一种检测急性主动脉夹层的标志物CD36和ADAMTS8及应用 专利技术说明

测量装置的制造及其应用技术一种检测急性主动脉夹层的标志物cd36和adamts8及应用技术领域1.本发明涉及医药学技术领域，特别是涉及一种检测急性主动脉夹层的标志物人血小板膜糖蛋白ⅳ(cd36)和含1型血小板结核蛋白基序的解整合素金属肽酶8(adamts8)及应用。背景技术：2.主动脉夹层是指主动脉壁撕裂使主动脉腔被分隔成真腔和假腔的疾病，发病机制是由于主动脉中层结构异常，引起主动脉内膜撕裂，引起壁间血肿蔓延。其主要危害有主动脉破裂，主动脉瓣关闭不全，重要脏器供血障碍等。主动脉夹层起病隐匿、死亡率高，已成为严重威胁人类生命健康的危重症心血管疾病。主动脉夹层作为心血管的急危重症，缺乏有效的预警体系。主动脉夹层发作前通常没有明显症状，患者常以突发胸痛、腹痛就诊，如果诊治不及时，早期死亡率极高。主要死因包括主动脉破裂、主动脉返流、急性心包压塞、急性心肌梗死、急性心力衰竭等心脏并发症以及脏器灌注不良并发症。随着微创血管腔内修复技术的创新发展、新型主动脉介入器械的研发以及外科术式的不断改善，主动脉夹层的诊断和救治率大大提高，但手术难度依然很大，病死率依然很高。因此，早期诊断和预防主动脉夹层至关重要。3.目前主动脉夹层的诊断主要依靠病史、心电图和x胸片、主动脉造影、经食管超声检查、主动脉计算机断层扫描成像等影像学检查。主动脉造影及主动脉计算机断层扫描成像诊断主动脉夹层的敏感性接近100％，但影像学检查耗时较长，还有部分患者有影像学检查禁忌或者存在偏远地区基层医院不具备影像学检查条件等等，以上均在一定程度上限制了主动脉夹层的诊断中的应用。并且大多数患者仅在可疑疾病发生时才行影像学检查，并不能有效预防主动脉的发生。4.近年来，主动脉夹层外周血生物标志物研究主要集中在平滑肌肌球蛋白重链、可溶性弹性蛋白片段、d-二聚体、可溶性致癌抑制因子2、基质金属蛋白酶等蛋白大分子以及一部分小分子标志物包括微小rna和小分子代谢产物等。平滑肌肌球蛋白重链、可溶性弹性蛋白片段均在疾病发作早期升高，因此临床应用局限，未能常规使用。d-二聚体应用较广泛，但由于年轻患者以及撕裂长度较短且假性栓塞患者的血浆中d-二聚体值较低，可能导致误诊，临床应用具有一定局限性。因此，寻求敏感性和特异性高、方便易行、安全和经济的生物标志物，并进行大量的临床验证，对急性主动脉夹层的预防和诊断具有重要的现实意义。技术实现要素：5.本发明的目的是提供一种检测急性主动脉夹层的标志物cd36、adamts8以及组合标志物cd36+adamts8及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明筛选得到的cd36和adamts8二者可单独或联合作为急性主动脉夹层的诊断性生物标志物，为急性主动脉夹层临床早期诊断和远期预后评估提供了新的方向。6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：7.技术方案一：一种用于检测急性主动脉夹层的生物标志物，所述生物标志物包含标志物cd36、adamts8或组合标志物cd36和adamts8。8.技术方案二：所述检测试剂包括检测如权利要求1所述的生物标志物的试剂。9.技术方案三：一种检测急性主动脉夹层的试剂盒，所述试剂盒包含所述的检测试剂。10.技术方案四：一种检测急性主动脉夹层的生物芯片，所述生物芯片包含所述的检测试剂。11.技术方案五：所述的生物标志物在制备诊断急性主动脉夹层患者的检测试剂中的应用。12.进一步地，所述生物标志物在所述急性主动脉夹层患者的血浆样品中呈现高表达。13.进一步地，采用elisa法检测所述血浆样品中生物标志物的含量。14.技术方案六：所述的检测试剂、所述的试剂盒和所述的生物芯片在制备急性主动脉夹层的诊断产品中的应用。15.进一步地，所述诊断产品用于急性主动脉夹层的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。16.本发明公开了以下技术效果：17.本发明通过空间转录组学筛选得到了检测急性主动脉夹层的生物标志物cd36、adamts8，以及生物标志组合物cd36+adamts8，将其作为分子标志物更具有敏感性和特异性，并经过了elisa验证证明了cd36和adamts8可能参与急性主动脉夹层的发病，并可单独或者联合应用，作为主动脉夹层的早期诊断性生物标志物和新的治疗靶点，进一步分析确定了单独的cd36和adamts8，以及cd36+adamts8联合可作为区分主动脉夹层和健康人的较佳诊断因子。18.本发明所提供的标志物为主动脉夹层临床早期诊断和远期预后评估提供了新的方向。本发明通过筛选主动脉夹层患者早期诊断的生物标志物，对急性主动脉夹层早期诊断、远期预后及生活质量的改善具有较大的临床价值和实际意义。本发明提供的一种特异度及灵敏度相对高的检测主动脉夹层的生物标志物，有效解决了主动脉夹层作为心血管的急危重症，缺乏有效的预警体系的问题。附图说明19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。20.图1为急性主动脉夹层升主动脉不同严重程度特有基因表达情况，其中，a为阶段1—轻度主动脉夹层特有基因和spot分布图，颜色越接近红色，表达量越高；b为阶段1特有基因功能注释，不同颜色代表不同通路；c为阶段2—中度主动脉升主动脉特有基因和spot分布图，颜色越接近红色，表达量越高；d为阶段2特有基因功能注释，不同颜色代表不同通路；e为阶段3—重度主动脉夹层特有基因和spot分布图，颜色越接近红色，表达量越高；f为阶段3特有基因功能注释，不同颜色代表不同通路；21.图2为adamts8和cd36作为生物标志物在正常对照组与主动脉夹层组中表达水平浓度数值，其中，a为adamts8的表达水平浓度数值；b为cd36的表达水平浓度数值(*为p《0.05)；22.图3为cd36、adamts8和cd36+adamts8联合在正常对照组与主动脉夹层组进行对比分析的受试者工作特征曲线。具体实施方式23.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。24.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。25.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。26.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。27.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。28.实验例1空间转录组学分析主动脉夹层患者差异表达基因29.收取主动脉夹层患者经外科血管置换术后的病变主动脉共15例，经过组织样本he染色形态学鉴定和组织rna质量控制rin检测，最终纳入8例样本。根据主动脉计算机断层扫描成像检查结果，依据升主动脉最宽直径将主动脉夹层病例分为不同严重程度的3组：35-40mm，2例；41-45mm，3例；46-50mm，2例，所有不同部位样本(升主动脉、头臂干动脉、左锁骨下动脉、左颈总动脉)切片共计19片，随后采用空间转录组学技术分析主动脉夹层患者差异性表达基因。研究对象均签署书面知情同意书，且本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准。30.空间转录组学技术及分析具体方法如下：31.1、人主动脉组织收集、速冻和包埋32.经血管置换术后收集的病变组织于30分钟内快速置于冷冻组织瓶，去除主动脉外膜多余组织和血凝块后，修剪组织横截面面积约6×6mm大小。用镊子将速冻组织放入适当大小的包埋盒中，用oct包埋胶快速包埋组织样本并置于干冰，直到oct固化变白。将包埋好的oct组织转运至冷冻切片机，在低温恒温箱中平衡20分钟以上(根据组织大小决定)，调整切片厚度，连续切20片组织切片后将切片叠放入标记并预冷的1.5ml离心管。33.2、rna提取、rin值评估以及贴片34.采用trizol法和qiagen rneasy mini试剂盒(德国qiagen公司)提取rna，将纯化后的rna保存于-80℃长期保存，或立即使用agilent rna 6000nano或pico试剂盒(美国agilent公司)进行rin检测。具体步骤参考agilent rna 6000nano试剂盒说明书，并按照agilent 2100生物分析仪系统操作指导进行检测。检测结果分析以rna质量检测rin》7的切片为合格样本。挑选合格样本在经低温恒温箱预平衡的visium空间基因载玻片上贴片。35.3、空间组织优化载玻片和空间基因表达载玻片的准备36.visium空间基因表达解决方案是将空间转录组学技术应用到组织切片和染色的标准方法中，研究空间分辨率下整个转录组mrna的表达情况，同时在同一组织切片中获得组织学相关信息，是一种在单独的组织样本中空间分辨率可视化和定量分析转录组的方法。用于文库构建的每张载玻片上有四个捕获区域(6.5×6.5mm)，每个捕获区域含有5000个被条形码标记的点(barcoded spots)，直径为55μm，每个点都有一个独特的条形码序列。当rna从组织切片的细胞中释放出来后，迁移到每个点的rna会被标记上相应的条形码序列，然后进行文库构建并进行测序。此后，根据数据的条形码信息对数据进行分配，以确定数据来源的位置，最终实现空间基因表达的可视化。37.空间基因表达解决方案试剂盒包括visium空间基因组织优化载玻片和visium空间基因表达载玻片两种：38.(1)visium空间基因组织优化载玻片：用于确定特定组织类型的最佳透化时间。包括8个捕获区，每个区域覆盖mrna捕获的寡核苷酸，每个捕获区域被一个面积8×8mm基准框包围，可读标签(序列号和二维码)即为载玻片的活性表面。39.(2)visium空间基因表达载玻片：生成visium空间基因表达文库，包括4个捕获区，每个捕获区6.5×6.5mm，约有5000个独特的基因表达barcoded spots，被总面积为8×8mm的基准框包围。40.visium空间基因表达载玻片活性表面引物序列为：[0041]5’‑ctacacgacgctcttccgatct-nnnnnnnnnnnnnnnn-nnnnnnnnnnnn-tt ttttttttttttttttttttttttttttvn-3’(seq id no.1)。[0042]4、组织优化[0043]文库构建前，visium空间组织优化可以优化感兴趣组织的渗透条件。将组织切片行he染色，使用leica scn 400载玻片扫描仪明场拍照；对固定并染色的组织切片进行不同时间的透化酶处理(透化酶分别处理3min，6min，12min，18min，24min，30min)，组织贴片在visium空间组织优化载玻片捕获区域，切片经固定和染色，进行不同时间的渗透。渗透过程中组织释放的mrna被载玻片捕获区域捕获，将含有逆转录试剂和荧光标记的核苷酸的混合物添加到组织贴片的表面，生成荧光标记的cdna。此后用组织移除酶去除组织，留下荧光cdna与寡核苷酸共价连接在组织优化载玻片上，用leica dmi8荧光显微镜成像可视化荧光cdna，比较he染色明场成像和荧光成像的组织形态学，产生最大荧光信号的渗透时间是最优的。[0044]5、visium空间基因表达[0045]visium空间基因表达解决方案是测定量完整组织切片中的总mrna，并绘制基因活跃表达的位置图谱。每张空间基因表达载玻片包含带有基因表达点的捕获区，其中包括捕获mrna需要的引物和多聚腺苷化mrna的底物，放置在这些捕获区域的组织切片被固定、染色，经过透化酶透化，细胞mrna被基因表达点上的引物捕获，引物在特定位点捕获的mrna生成的所有cdna都具有共同的空间条形码。由cdna生成单细胞3’基因表达文库并进行测序，使用空间条形码将读到的内容与组织切片图像关联，从而进行空间基因表达图谱绘制。这一阶段的步骤包括以下几个部分：[0046](1)组织切片、固定、染色；[0047](2)组织透化，逆转录，采用“组织优化”筛选出的最优条件，获取cdna；[0048](3)二链合成、变性：二链合成引物:5’‑aagcagtggtatcaacgcagag-3’(seq id no.2)；[0049](4)cdna扩增和质量控制：[0050]cdna引物包括正向引物：5’‑ctacacgacgctcttccgatct-3’(seq id no.3)和反向引物：5’‑aagcagtggtatcaacgcagag-3’(seq id no.2)；[0051]使用agilent 2100生物分析仪检测cdna质量。[0052]6、visium空间基因表达文库构建[0053]用上一步骤获得cdna构建visium空间基因表达文库库。步骤包括以下几个部分:(1)使用pcr仪启动片段化程序对样本进行片段化；(2)片段化后末端修复，加a尾，按spri筛选试剂盒(beckman coulter公司)对样本进行spri双端筛选；(3)接头连接；(4)接头连接后纯化，spri筛选；(5)样本加双端index，pcr；(6)样本加双端index后，pcr双端spri筛选；(7)文库构建后质检。[0054]7、测序[0055]visium空间基因表达库是标准的ilumina配对以p5开始，以p7结束的结构。对这些文库进行测序，生成一个标准的illumina bcl输出数据文件夹。[0056](1)测序深度估算：根据组织he染色明场成像覆盖捕获区域的面积大小来计算，总测序深度＝(捕获区域(％)×捕获区域总的spot数目(5000))×50000readpairs/spot；[0057](2)文库测序由上海晶能生物公司完成，使用iluminanova 6000测序平台测序。[0058]8、数据生物信息分析[0059]利用10×genomics官方分析流程及软件进行原始数据处理，针对样本测序后得到的原始数据按照质量控制方法和数据分析管道：sctransform normalization+pca dim30+t-sne+umap，联合对数据基本分析。详细分析主动脉夹层状态下主动脉不同部位、升主动脉不同严重程度基因表达和细胞类型的差异，建立主动脉夹层基因表达和细胞图谱。[0060]升主动脉不同严重程度差异表达基因分析：从升主动脉不同严重程度随机选择一个样本进行分析，利用seurat进行差异表达基因分析，包括共有差异表达基因，和不同严重程度每个样本特有差异表达基因，进而采用metascape软件进行功能注释，并挑选几个与空间位置相关基因展示分布情况。[0061]9、主动脉夹层中升主动脉不同严重程度基因表达模式[0062]结果分析主动脉夹层升主动脉不同阶段中基因表达中阶段1—轻度主动脉夹层特有基因103个，阶段2—重度主动脉夹层特有基因72个，阶段3—重度主动脉夹层特有基因268个，三个阶段共同表达基因有181个。[0063]其中，主动脉夹层中升主动脉不同严重程度特有基因表达模式为：阶段1—轻度主动脉夹层随根据基因表达位置筛选出2个特有基因，包括cxcl1和pls3，其主要分布在升主动脉内膜，对spot数量进行可视化(见图1中a)，对这两个基因进行功能注释，展示参与的top20条通路，主要参与由白细胞介素介导的信号通路、炎症因子信号通路，与炎症反应相关(见图1中b)；阶段2—中度主动脉夹层中根据基因表达位置筛选出2个特有基因，包括ptma和sparc，其主要分布在升主动脉中膜撕裂处，对spot数量进行可视化(见图1中c)，对这两个基因进行功能注释，展示参与的top20条通路，主要参与细胞外基质结构组织的维持、骨骼发育、血管发育通路，这些通路与血管重塑有关(见图1中d)；同样阶段3—重度主动脉夹层中根据基因表达位置筛选出2个特有基因包括adamts8和cd36，其主要分布在升主动脉中外膜，对spot数量进行可视化(见图1中e)，对这两个基因进行功能注释，展示参与的top20条通路，主要参与细胞黏附调节、缺氧信号通路，这些通路与细胞活动、氧稳态相关(见图1中f)。[0064]实施例2主动脉夹层患者生物标志物扩大样本验证[0065]根据纳入、排除标准，纳入经主动脉ct血管成像检查明确诊断为主动脉夹层的患者124例，健康对照组83例，收集患者血浆进行elisa实验验证上述因子能否判断患者患有主动脉夹层。分别采用adamts8 elisa检测试剂盒(jl14480)和cd36 elisa检测试剂盒(jl23929)，均购于中国上海江莱公司。主动脉夹层患者纳入标准：经主动脉ct血管成像检查明确诊断为急性主动脉夹层患者，年龄≥18岁，签署知情同意书；排除标准：合并风湿病、自身免疫性疾病、主动脉炎、妊娠或遗传性综合征(如马凡综合征等)病史患者。健康对照血样纳入标准：年龄≤65岁的健康体检者，无高血压或药物控制高血压，无心血管疾病史并经冠状动脉造影检查排除冠心病；排除标准：合并心血管疾病、全身性疾病患者。[0066]实验原理为采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(elisa)。往预先包被有相应指标捕获抗体的微孔中，依次加入样本、标准品、生物素标记的检测抗体，hrp酶结合物，中间经过温育和洗涤，用底物tmb显色，tmb在过氧化物酶(hrp)的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的相应蛋白浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，计算样品浓度。详细实验步骤参考试剂盒说明书。[0067]注意事项如下：[0068](1)样本处理：检测均采用血浆，用edta或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于4℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-80℃保存，但应避免反复冻融。[0069](2)标准品梯度工作液配制：采用倍比稀释方法在ep管中配置标准品梯度工作液，具体参考各试剂盒说明书。[0070](3)提前配置生物素化检抗工作液、酶结合物工作液和1x洗涤工作液。[0071](4)结果判断：[0072]1)计算标准品和样本复孔的平均od值并减去空白孔的od值作为校正值。以浓度为横坐标，od值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)；[0073]2)若样品od值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。[0074]通过上述elisa方法，以adamts8、cd36和adamts8+cd36联合作为生物标志物对主动脉夹层组和正常健康组进行分析检测，所得数据采用spss 26.0统计学软件进行分析并绘制受试者工作特征曲线，明确新型标志物能否成为新的主动脉夹层诊断标志物，以及探索联合指标对主动脉夹层的诊断价值。[0075](5)结果分析[0076]如表1和图2所示，根据adamts8和cd36这2个因子分别作为生物标志物在正常对照组和主动脉夹层组中的表达水平，能够得到adamts8和cd36这2个因子均能够很好的区分健康人与主动脉夹层患者。[0077]表1adamts8和cd36在血浆elisa浓度[0078][0079]cd36、adamts8这2个单独的因子以及cd36+adamts8联合因子作为生物标志物在区分正常对照组和主动脉夹层组时的受试者工作特征曲线如图3和表2的结果显示：cd36、adamts8这2个因子单独和联合的曲线下面积均大于0.7，对主动脉夹层具有很好的诊断价值。[0080]表2adamts8、cd36单独和联合用于筛检主动脉夹层的受试者工作特征分析[0081][0082]以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。









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