一种促进罗伊氏乳杆菌生长的培养基及方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种促进罗伊氏乳杆菌生长的培养基及方法。背景技术：2.罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reutrei)是专性异型发酵乳酸杆菌，广泛存在于酸面团、肉和奶等发酵食品中以及人与动物的胃肠道中。l.reuteri对肠黏膜具有很强的黏附能力，具有抑制病原菌、调节肠道菌群、增强宿主机体免疫功能、改善婴儿肠绞痛、降胆固醇等诸多优良益生功能，同时对宿主肠道上皮组织再生和修复具有重要意义，对肠应激综合征有明显的改善效果。罗伊氏乳杆菌在动物养殖方面常被用来作为益生菌，预防和治疗动物肠道疾病，是替代抗生素和促进动物生长的有效益生品。罗伊氏乳杆菌可广泛应用于药品、奶酪和酸奶等奶制品、肉制品、功能性食品、饮料及养殖饲料和饮用水中。3.由于罗伊氏乳杆菌广泛应用于食品、医药、饲料，养殖等行业,随着对罗伊氏乳杆菌剂应用领域的开发，菌剂的需求量也越来越大。目前国内对植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌等乳酸菌的培养发酵研究的相对较多，市场上菌数高的可达500-1000亿/g,而罗伊氏乳杆菌发酵液活菌数一般只在1.0～2.0×109cfu/ml，菌数偏低。4.燕麦(拉丁学名：avena sativa l.)生长在寒冷地区,为禾本科植物,《本草纲目》中称之为雀麦、野麦子，还因不易脱皮，被称为皮燕麦。燕麦营养全面，富含蛋白质、矿物质、维生素及膳食纤维等营养素。燕麦籽粒中蛋白质含量约为11％～20％之间，因品种不同而异，多数在16％左右，在禾谷类作物中含量最高，而且含有人体必需的8种氨基酸。燕麦脂肪含量相对其他谷类作物含脂量较高，为3.44％～9.65％，有研究表明其含有的不饱和脂肪酸以油酸、亚油酸、亚麻酸为主，相对含量约占79.45％。燕麦含有大量的膳食纤维，分为可溶性膳食纤维和不可溶性膳食纤维。因燕麦属于低糖、高营养、高能食品，有着卓越的营养保健价值和非凡的食疗功效，是我国药食同源文化的典型食材，长期食用对预防慢性疾病、改善身体状况，保障人体健康起着重要的作用，是中老年人理想的保健食品。燕麦用途广泛，不仅用于食品、饲料还可用于医药、化妆品等方面。相对于其他的谷物更具有开发价值，但由于其自身的属性如口感粗糙，直接食用体验差等问题，故开发其他加工途径更具有意义。5.目前文献报道用于罗伊氏乳杆菌的益生元，大多数为低聚糖、果蔬类和蛋白类及其降解产物和中草药提取物等，还未有燕麦作为罗伊氏乳杆菌益生元的相关报道。技术实现要素：6.本发明的目的是提供一种促进罗伊氏乳杆菌生长的培养基及方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过向改良mrs培养基中添加燕麦培养罗伊氏乳杆菌，可以显著提高发酵液中的罗伊氏乳杆菌活菌数。7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：8.本发明提供一种罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)jp-06，该菌保藏编号为cctcc no：m20221231；保藏时间为2022年8月3日；保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。9.本发明还提供一种促进所述的罗伊氏乳杆菌生长的方法，包括：向发酵培养罗伊氏乳杆菌的mrs培养基中添加质量分数为5.0％-80％的燕麦，以促进罗伊氏乳杆菌生长，提高所述罗伊氏乳杆菌的活菌数。10.优选的是，所述改良mrs培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨1～50/l、牛肉膏2～50g/l、酵母浸粉2～50/l、葡萄糖10～100g/l、柠檬酸氢二铵0.5～8g/l、吐温-80 0.5～5.0ml/l、乙酸钠5～30g/l、磷酸氢二钾0.5～5g/l、硫酸镁0.1～20g/l、硫酸锰0.01～0.5g/l、碳酸钙5～50g/l以及半胱氨酸盐酸盐0.1～10g/l。11.优选的是，所述罗伊氏乳杆菌的接种量为0.5％-10％。12.优选的是，发酵培养条件为：发酵温度20℃～40℃，发酵时间为8-72h，ph为5.0-7.5。13.优选的是，所述活菌发酵液的活菌数为1.26×1010～1.89×1010cfu/ml。14.优选的是，在向所述改良mrs培养基添加所述燕麦前，通过粉碎、酶法处理或者热处理任一种或者多种组合方式对燕麦进行处理。15.优选的是，发酵时，所述燕麦以如下任一种或者多种组合方式添加至所述改良mrs培养基中：16.(1)配制所述改良mrs培养基时，一次性添加；17.(2)发酵培养过程中，间歇式流加；18.(3)发酵培养过程中，持续流加。19.优选的是，发酵培养前，还包括以下步骤：20.将罗伊氏乳杆菌接种改良mrs培养基，在20℃～40℃恒温培养8-24h，进行菌种活化。21.本发明还提供一种促进所述的罗伊氏乳杆菌生长的培养基，所述培养基包括以下浓度的组分：燕麦50～800g/l、蛋白胨1～50/l、牛肉膏2～50g/l、酵母浸粉2～50/l、葡萄糖10～100g/l、柠檬酸氢二铵0.5～8g/l、吐温-80 0.5～5.0ml/l、乙酸钠5～30g/l、磷酸氢二钾0.5～5g/l、硫酸镁0.1～20g/l、硫酸锰0.001～0.01g/l、碳酸钙5～50g/l以及半胱氨酸盐酸盐0.1～10g/l。22.本发明公开了以下技术效果：23.本发明是通过利用燕麦添加到培养基中发酵培养罗伊氏乳杆菌，起到增菌作用，可以显著增加发酵液中的活菌数量，可以高达1.89×1010cfu/ml，这为罗伊氏乳杆菌的开发利用提供了基础，并且经发酵后，燕麦不仅作为保健食品营养物质更利于肠道吸收，因含有高活菌性益生菌还可以将含燕麦发酵物作为有特殊功能的生物活性保健产品，利用开发燕麦的潜在价值。附图说明24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。25.图1为实施例1中5组培养基培养后，显微镜下观察的菌体形态；26.图2为实施例1中不同处理方式处理燕麦后添加到发酵培养基中，对发酵液中活菌数的影响。具体实施方式27.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。28.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。29.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。30.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。31.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。32.实施例1罗伊氏乳杆菌分离鉴定方法33.1、取松滋市新江口镇民主大道28号白云边酒厂新鲜白酒醅1g置于已灭菌装有15ml mrs液体培养基试管中，在37℃条件下进行富集培养24小时。34.2、取富集培养液1ml加入已灭菌装有9ml生理盐水的试管中进行10倍递增稀释至10-7，分别取稀释度为10-4、10-5、10-6、10-7稀释液100μl均匀涂布于含caco3的mrs固体培养基平板上，于37℃条件下厌氧培养48h。挑取具有明显溶钙圈的单菌落划线于mrs固体培养基中进行分离纯化至单一菌落形态。35.3、形态鉴定：将筛选菌株划线接种于mrs培养基平板上，于37℃条件下培养48h，菌落形态呈白色，润泽，隆起，边缘规则。革兰氏染色阳性，镜检观察菌体细胞形态特征呈杆状、无芽孢。36.4、分子生物学鉴定：将筛选得到的菌种委托武汉擎科生物科技有限公司进行测序，将测序得到的结果提交至美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)的genbank数据库中，采用基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool，blast)进行同源性搜索，选取同源性较高的模式菌株的16s rdna基因序列进行比较，结果为罗伊氏乳杆菌，命名为罗伊氏乳杆菌jp-06。37.16s rdna序列(seq id no:1)为：38.actttgggcgttacaaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaacggctttaagagattagcttactctcgcgagcttgcgactcgttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatctgacgtcgtccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcactagagtgcccaacttaatgctggcaactagtaacaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacgaccatgcaccacctgtcattgcgtccccgaagggaacgccttatctctaaggttagcgcaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctccgggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcactcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttgcagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcattccaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtcgcccggtttccgatgcacttcttcggttaagccgaaggctttcacatcagacctaagcaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtgactttctggttggatacsgtcactgcgtgaacagttactctcacgcacgttcttctccaacaacagagctttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggtgttgcttccatcaggcttgcgcccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtatggaccgtgtctcagttccattgtggccgatcagtctctcaactcggctatgcatcatcgccttggtaagccgttaccttaccaactagctaatgcaccgcaggtccatcccagagtgatagccaaagccatctttcaaacaaaagccatgtggcttttgttgttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccgctccggggcaggttacctacgtgttactcacccgtccgccactcactggtgatccatcgtcaatcaggtgcaagcacca。39.该罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)jp-06已于2022年8月3日中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m20221231；保藏地址为中国.武汉.武汉大学。40.实施例2一种促进罗伊氏乳杆菌生长的方法41.本实施例是采用蓝口瓶静置发酵，具体如下：42.(1)菌株活化：取-80℃低温冰箱保存的罗伊氏乳杆菌甘油管种，回温至室温，按照接种量0.5％(v/v)接入装有mrs液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养16h。43.将活化好的菌株，按照接种量0.5％接种到mrs液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养36h，得到种子液。上述mrs液体培养基包括以下浓度组分：蛋白胨15g/l、牛肉膏(牛肉浸粉)12g/l、酵母浸粉(酵母膏)20g/l、葡萄糖25g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、吐温-80 2.0ml/l、乙酸钠10g/l、磷酸氢二钾7.0g/l、硫酸镁6.0g/l、硫酸锰0.03g/l、碳酸钙7g/l以及半胱氨酸盐酸盐1.0g/l。该培养基ph为6.5，在121℃，压力0.1mpa条件下灭菌30min，备用。44.(2)将培养好的种子液分别按照接种量3.5％接入如下5组培养基(30瓶/组，每瓶装有600ml培养基的蓝口瓶)：45.1组：发酵基础培养基，即：改良mrs培养基：蛋白胨8g/l、牛肉膏(或牛肉浸粉)10g/l、酵母浸粉(或酵母膏)15g/l、葡萄糖22g/l、柠檬酸氢二铵3g/l、吐温-80 1.0ml/l、乙酸钠5g/l、磷酸氢二钾2.3g/l、硫酸镁5.0g/l、硫酸锰0.1g/l、碳酸钙17g/l以及半胱氨酸盐酸盐5g/l。该培养基ph为6.5，在121℃，压力0.1mpa条件下灭菌30min，备用；46.2组：发酵基础培养基添加燕麦粉，按照100g/l的终浓度添加；47.3组：发酵基础培养基添加酶法处理后的燕麦粉，按照100g/l的终浓度添加；48.酶法处理燕麦粉，具体为：49.取燕麦麦粒用粉碎机粉碎制成粉末；按酶制剂说明书表明的使用量，以组合的方式添加纤维素酶、糖化酶、液化酶、蛋白酶到燕麦中，加适量水，在ph6.5，温度40℃条件下酶法处理3h。50.4组：发酵基础培养基添加热处理后的燕麦粉，按照100g/l的终浓度添加；51.热处理燕麦粉，具体为：52.取燕麦麦粒用粉碎机粉碎制成粉末；取燕麦粉加适量的水，通过烫(或者蒸或者煮)方式加热后保温60℃，维持60min。53.5组：发酵基础培养基添加燕麦粉，燕麦粉是经过先经过如4组的热处理后，在经过如3组的酶法处理，按照100g/l的终浓度添加。54.(3)发酵培养55.上述5组接种的培养基置于37℃恒温培养箱中静置培养30h(24-72h范围内的其它培养时间长度也能实现同样的技术效果)。56.其中，以“5组”发酵培养的菌体为例，观察菌体形态，如图1所示。经过5组不同发酵培养基发酵，结果如图2所示，经过处理后的燕麦添加到培养基能够促进罗伊氏乳杆菌发酵液中活菌数的提高，并且经过酶法处理和热处理组合处理的燕麦粉能够显著增加发酵液中活菌数的数量。57.实施例358.与实施例2(5组)的区别在于：燕麦粉添加终浓度为50g/l，其余步骤均相同。59.实施例460.与实施例2(5组)的区别在于：燕麦粉添加终浓度为300g/l，其余步骤均相同。61.实施例562.与实施例2(5组)的区别在于：燕麦粉添加终浓度为800g/l，其余步骤均相同。63.对比例164.与实施例2(5组)的区别在于：葡萄糖替换为麦芽糖，其他步骤均相同。65.对比例266.与实施例2的区别在于：省略牛肉膏，其他步骤均相同。67.对比例368.与实施例2的区别在于：省略碳酸钙，其他步骤均相同。69.实施例6一种促进罗伊氏乳杆菌生长的方法70.本实施例是利用5l发酵罐发酵，具体如下：71.(1)菌株活化：取-80℃低温冰箱保存的罗伊氏乳杆菌甘油管种，回温至室温，按照接种量2.0％(v/v)接入装有mrs液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24h。72.将活化好的菌株，按照接种量2.0％(v/v)接种到mrs液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养72h，得到种子液。73.(2)将培养好的种子液按照接种量2.5％(v/v)接入装有发酵培养基的5l发酵罐中；其中，发酵培养基是将燕麦粉按照终浓度150g/l添加一次性添加到改良mrs培养基中形成，上述改良mrs培养基包括以下浓度的组分：牛肉膏(牛肉浸粉)30g/l、酵母浸粉(酵母膏)25g/l、葡萄糖20g/l、柠檬酸氢二铵4g/l、吐温-80 1.0ml/l、乙酸钠10g/l、磷酸氢二钾1.5g/l、硫酸镁6.0g/l、硫酸锰0.05g/l、碳酸钙10g/l以及半胱氨酸盐酸盐6.5g/l。该培养基ph为6.5，在121℃，压力0.1mpa条件下灭菌30min，备用。74.(3)发酵培养75.发酵初期通入惰性气体；搅拌浆转速维持在50r/min；发酵期间用20％naoh中和剂维持ph至6.3；发酵20h左右结束发酵。76.实施例777.与实施例6的区别在于：燕麦粉添加终浓度为400g/l，其余步骤均相同。78.实施例879.与实施例6的区别在于：燕麦粉添加终浓度为700g/l，其余步骤均相同。80.实施例9一种促进罗伊氏乳杆菌生长的方法81.本实施例利用100l发酵罐发酵罗伊氏乳杆菌，具体如下：82.(1)菌株活化83.取-80℃低温冰箱保存的罗伊氏乳杆菌甘油管种，回温至室温，按照接种量1.5％(v/v)接入装有mrs液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养16h。84.(2)一级种子液制备85.将经活化好后菌液，按照接种量1.5％(v/v)接种至mrs液体培养基的三角瓶中，37℃静置培养12h，备用。86.(3)发酵培养87.将一级种子液按照接种量2.0％(v/v)接种到100l发酵罐中的改良mrs培养基。发酵过程中，将燕麦粉用补料罐采用流加间歇式流加补料方式添加总量20l的无菌燕麦粉悬浮液到改良mrs培养基中(燕麦粉在改良mrs培养基中的终浓度为200g/l)，将燕麦粉均分为6份，开始发酵第4h第一次添加，之后每间隔4h添加一次。上述改良mrs培养基包括以下浓度组分：蛋白胨20g/l、牛肉膏(牛肉浸粉)30g/l、酵母浸粉(酵母膏)20g/l、葡萄糖30g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、吐温-80 3.0ml/l、乙酸钠20g/l、磷酸氢二钾5.0g/l、硫酸镁6.0g/l、硫酸锰0.3g/l、碳酸钙9g/l以及半胱氨酸盐酸盐5.0g/l。ph 6.5、115℃灭菌30min。该培养基ph为6.5，在121℃，压力0.1mpa条件下灭菌30min，备用。88.发酵培养发酵初期通入惰性气体；搅拌浆转速维持在80r/min；发酵期间用50％nahco3中和剂维持ph至6.0；35℃培养36h结束发酵。89.实施例10一种促进罗伊氏乳杆菌生长的方法90.本实施例利用2000l发酵罐发酵罗伊氏乳杆菌，具体如下：91.(1)菌株活化92.取-80℃低温冰箱保存的罗伊氏乳杆菌甘油管种，回温至室温，按照接种量2.0％(v/v)接入装有mrs液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养16h。93.(2)一级种子液制备94.将经活化好后的菌液按照接种量2.0％(v/v)接种至装有mrs液体培养基的三角瓶中，35℃静置培养12h，备用。95.(3)二级种子制备96.将制备的一级种子按照接种量2.0％(v/v)接入改良mrs液体培养基30l发酵罐；发酵初期通入惰性气体；搅拌浆转速维持在80r/min；37℃培养12h，结束发酵。上述改良mrs液体培养基包括以下浓度组分：蛋白胨15g/l、牛肉膏(牛肉浸粉)12g/l、酵母浸粉(酵母膏)20g/l、葡萄糖25g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、吐温-80 2.0ml/l、乙酸钠10g/l、磷酸氢二钾7.0g/l、硫酸镁6.0g/l、硫酸锰0.2g/l、碳酸钙7g/l以及半胱氨酸盐酸盐5.0g/l。该培养基ph为6.5，在121℃，压力0.1mpa条件下灭菌30min，备用。97.(4)发酵培养98.将制备二级种按照2.5％(v/v)的接种量接入2000l发酵罐改良mrs培养基中，发酵全程不通入任何气体，维持发酵6h后通过补料罐采用流加的方式流加总体积为100l的无菌燕麦粉混悬液至改良mrs培养基(燕麦粉在改良mrs培养基中的终浓度为350g/l)，发酵过程中用30％naco3中和剂维持ph至6.3；35℃培养48h结束发酵。取发酵液采用平板计数法或半固体高层试管法计数。上述改良mrs培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨15g/l、牛肉膏(牛肉浸粉)20g/l、酵母浸粉(酵母膏)20/l、葡萄糖30g/l、柠檬酸氢二铵5.0g/l、吐温-80 3.0ml/l、乙酸钠3g/l、磷酸氢二钾9.0g/l、硫酸镁7.0g/l、硫酸锰0.5g/l、碳酸钙13g/l、半胱氨酸盐酸盐5.0g/l。该培养基ph为6.5，在121℃，压力0.1mpa条件下灭菌30min，备用。99.上述实施例2-实施例10以及对比例1-3，发酵结束后测定发酵液中的活菌数，结果如下表1所示：100.表1测定发酵液中活菌数的结果101.[0102][0103]以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。









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