一株溶藻弧菌及其应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及微生物学技术领域，具体而言，涉及一株溶藻弧菌及其应用。背景技术：2.大型海藻是开发海洋多糖功能食品，寻找新型多糖药物先导化合物的宝贵资源，其蕴藏着多种结构各异的k-卡拉胶多糖。当下k-卡拉胶多糖资源供应缺口大，生产手段落后，而k-卡拉胶多糖存在分子量大、水溶性低、不易被吸收等问题，因此k-卡拉胶多糖仅仅作为原料销至国外或采用简单粗放加工提取k-卡拉胶作为食物或食品添加剂使用。3.相比于k-卡拉胶多糖，k-卡拉胶寡糖不仅来源丰富、种类繁多、性质稳定、应用广泛、活性独特，还具有分子量小、易溶于水、无抗原性等显著优势，具有多种医药保健功效，如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫调节等功能。4.制备k-卡拉胶寡糖的常见方法主要有化学法和物理法，但是现有方法存在破坏多糖的结构以及产生有害副产物等缺点。技术实现要素：5.本发明提供一株溶藻弧菌及其应用，用以克服现有技术中存在的至少一个技术问题。6.有鉴于此，本发明提供了一株溶藻弧菌及其应用，该菌株能够将k-卡拉胶降解为k-卡拉胶寡糖，降解率大于80％，获得的k-卡拉胶寡糖具有显著的抗氧化作用。7.本发明从大型海藻江蓠中分离获得菌株k-z8，该菌株为革兰氏阴性杆菌，菌落湿润、淡黄色、圆形，边缘整齐，好氧菌，可降解k-卡拉胶并在固体培养基上有水解圈，并随着时间的增加水解圈直径不断扩大。该菌株的16s rrna基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。经形态学和16s rrna基因鉴定为溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)，其保藏编号为cgmcc no.24569。8.本发明还提供了所述溶藻弧菌在制备k-卡拉胶寡糖中的应用。9.本发明还提供一种制备k-卡拉胶寡糖的方法，由本发明所述的溶藻弧菌k-z8降解k-卡拉胶制得。10.一些实施方案中，本发明提供的制备k-卡拉胶寡糖的方法具体包括：11.步骤(1)：将保藏编号为cgmcc no.24569的溶藻弧菌接种至种子培养基中，培养，获得种子液；12.步骤(2)：将所述种子液接种于含k-卡拉胶的液体培养基中，培养，离心去除菌体，得到上清液；13.步骤(3)：将所述上清液经分子截留、离心，收集分子量3～10kda的组分。14.一些实施方案中，步骤(1)中所述溶藻弧菌k-z8的接种量为1～2％(v/v)；一些具体实施例中，所述接种量具体可为2％(v/v)。15.一些实施方案中，所述培养的条件为：转速为160～180rpm，25～30℃下，培养12～15h；一些具体实施例中，所述培养的条件为：转速为180rpm，30℃下，培养15h。16.一些具体实施例中，步骤(2)中，所述含k-卡拉胶的液体培养基包括如下质量体积百分数的组分：17.0.15％k-卡拉胶、3％nacl、0.5％(nh4)2so4、0.26％k2hpo4·3h2o、0.1％mgso4·7h2o、0.01％feso4·7h2o，ph为7.5。18.一些实施方案中，步骤(2)中所述种子液的接种量为1～2％(v/v)；一些具体实施例中，所述接种量具体可为2％(v/v)。19.一些实施方案中，步骤(2)中所述培养的条件为：转速为160～180rpm，25～30℃下,培养45～60h；一些具体实施例中，所述培养的条件为：转速为180rpm，30℃下，培养45h。20.本发明还提供了由本发明所述的方法制得的k-卡拉胶寡糖。21.本发明研究了由本发明所述的方法制得的k-卡拉胶寡糖(即分子量3～10kda的粗k-卡拉胶寡糖)的抗氧化特性，发现其在ph 6.5～7.5的dpph清除率为＞75％，在温度30～35℃的dpph清除率为＞80％，具有显著的抗氧化作用。22.基于以上效果，本发明还提供了所述的k-卡拉胶寡糖在制备抗氧化产品中的应用。23.本发明从大型海藻江蓠中分离一株溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)k-z8，于2022年3月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24569。该菌株能够将k-卡拉胶充分地降解为分子量3～10kda的k-卡拉胶寡糖，所获得的k-卡拉胶寡糖具有显著的抗氧化作用.24.生物保藏说明25.k-z8，分类命名：溶藻弧菌vibrio alginolyticus，于2022年3月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.24569。附图说明26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。27.图1为菌株形态图；28.图2为菌株扫描电镜图；29.图3为不同时间段菌株降解琼胶的水解圈变化；30.图4为菌株k-z8系统进化树图；31.图5为3～10kda的λ-卡拉胶寡糖的抗氧化性；32.图6为温度对k-卡拉胶寡糖的抗氧化性的影响；33.图7为ph对k-卡拉胶寡糖的抗氧化性的影响；34.图8为不同时间段发酵液中的3～10kda的k-卡拉胶寡糖的抗氧化性。具体实施方式35.本发明公开了一株需钠弧菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。36.下面结合实施例，进一步阐述本发明：37.实施例1溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)k-z8的筛选与鉴定38.1.1培养基39.(1)k-卡拉胶液体培养基中各组分的质量体积百分含量为0.15％k-卡拉胶、3％nacl、0.5％(nh4)2so4、0.26％k2hpo4·3h2o、0.1％mgso4·7h2o、0.01％feso4·7h2o，ph为7.5。40.(2)k-卡拉胶固体培养基中各组分的质量体积百分含量为：1.5％琼胶、2％k-卡拉胶、3％nacl、0.5％(nh4)2so4、0.26％k2hpo4·3h2o、0.1％mgso4·7h2o、0.01％feso4·7h2o，ph为7.5。41.1.2菌株筛选42.1.2.1样品采集：采集海南近海大型海藻江蓠，取5g样品，加入50ml pbs缓冲液，于无菌研磨器中研磨后倒入100ml ep管，上下轻晃，静置10min之后备用。43.1.2.2菌株k-z8的初筛：取10μl处理好的江蓠样品接种至以k-卡拉胶为唯一碳源的液体培养基进行发酵培养，在30℃、180rpm的条件下培养24h，并且3次传代。44.1.2.3菌株k-z8的复筛：取3μl传代后的发酵液涂布至k-卡拉胶固体培养基上，待长出菌落后进行多次划线，直至分离出单菌落(图1)。45.1.3菌株k-z8的形态特征46.菌株k-z8为革兰氏阴性菌，且为杆菌，菌落湿润、淡黄色、圆形，边缘整齐，好氧菌，可降解λ-卡拉胶并在固体培养基上有水解圈(图1-2)，并随着时间的增加水解圈直径不断扩大(5％卢戈碘液染色)(图4)。47.1.4菌株k-z8的分子生物学鉴定48.将k-z8提取基因组后，进行16s rdna测序以及鉴定，该菌株鉴定为需钠弧菌(vibrio natriegens)，我们将其命名为溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)k-z8(图4)。49.16s rrna全基因序列长1351bp，序列如seq id no：1所示。50.1.5菌株k-z8制备k-卡拉胶寡糖的方法51.(1)将需钠弧菌k-z8以2％(v/v)的接种量接种到2216e种子培养基中，转数180rpm，装液量20％，30℃培养12h得到种子液。52.(2)将种子液以2％的接种量接种于k-卡拉胶液体培养基中(制备k-卡拉胶寡糖的培养基为k-卡拉胶固体培养基：1.5％琼胶、2％k-卡拉胶、3％nacl、0.5％(nh4)2so4、0.26％k2hpo4·3h2o、0.1％mgso4·7h2o、0.01％feso4·7h2o，ph为7.5。160rpm，30℃培养45h，获得发酵液，经离心去除菌体，得到上清液；53.(3)上清液通过分子截留的方法，使用ultra离心管获得分子量3～10kda的粗λ-卡拉胶寡糖。54.1.6k-z8k-卡拉胶寡糖抗氧化特征55.1.6.13～10kda k-卡拉胶寡糖的抗氧化性56.k-卡拉胶寡糖的抗氧化特性使用dpph自由基清除法进行评估。使用无水乙醇配制0.1mm dpph溶液。首先考察了3～10kda的k-卡拉胶寡糖的抗氧化特性，将50μl dpph溶液与150μl的3～10kda的k-卡拉胶寡糖液混合(ph 7.0)，25℃下避光孵育60min后，在517nm处测量反应液的吸光度，并以无水乙醇代替样品作为阴性对照，计算3～10kda的k-卡拉胶寡糖的抗氧化效率。结果发现，分子截留后的3～10kda的k-卡拉胶寡糖的dpph清除率为82％，相比于1.5小节步骤(2)相同体积的发酵液提高了近53％，表现出较强的抗氧化特性(图5)。57.1.6.2温度对k-卡拉胶寡糖的抗氧化的影响58.将50μl dpph溶液与150μl的3～10kda的k-卡拉胶寡糖液混合(ph 7.0)，不同温度下避光孵育60min后，在517nm处测量反应液的吸光度，并以无水乙醇代替样品作为阴性对照，考察3～10kda的k-卡拉胶寡糖在不同温度下的抗氧化效率，结果显示，温度范围在30～35℃的dpph清除率为最佳且均＞80％(图6-7)。59.1.6.3ph对k-卡拉胶寡糖的抗氧化的影响60.首先调节3～10kda的k-卡拉胶寡糖液的ph为5～11。随后，将50μl dpph溶液与150μl的3～10kda的k-卡拉胶寡糖液混合，在30℃下避光孵育60min后，在517nm处测量反应液的吸光度，并以无水乙醇代替样品作为阴性对照，考察3～10kda的k-卡拉胶寡糖在不同温度下的抗氧化效率，结果显示，ph范围在6～7.5的dpph清除率最佳且均＞80％。61.1.6.4不同时间段发酵液中的3～10kda的k-卡拉胶寡糖的抗氧化性62.选取不同发酵阶段的发酵液，离心去除菌体，得到上清液。上清液通过分子截留的方法，获得不同发酵阶段的分子量为3～10kda的粗k-卡拉胶寡糖。将50μl dpph溶液与150μl的各时间段的3～10kda的k-卡拉胶寡糖液混合(ph 7.0)，30℃下避光孵育60min后，在517nm处测量反应液的吸光度，并以无水乙醇代替样品作为阴性对照，考察不同时间段发酵液中3～10kda k-卡拉胶寡糖的抗氧化效率，结果显示，发酵45h后的发酵液中的3～10kda k-卡拉胶寡糖液dpph清除率达到最佳约为82％，随后进入平台期(45～80h),平台期过后发酵液中的3～10kda k-卡拉胶寡糖对dpph清除率逐渐下降(图8)。63.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!