嗜热链球菌CICC6038菌株的鉴定方法及其引物、试剂盒和应用与流程 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术嗜热链球菌cicc 6038菌株的鉴定方法及其引物、试剂盒和应用技术领域1.本发明涉及微生物鉴定技术领域，尤其涉及一种嗜热链球菌cicc 6038菌株的鉴定方法及其引物、试剂盒和应用。背景技术：2.嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)细胞形态多为球形或者卵球形，成对或链状，无芽孢、无鞭毛、无运动性，单体直径通常在1μm以下，为革兰氏阳性菌。嗜热链球菌是最常用的天然发酵乳酸菌菌种之一，能够加速原料乳酸化，促进牛奶蛋白凝乳，具有抗氧化活性、调节肠道菌群、抑制病原微生物等益生特性，改善发酵乳制品的质地及风味从而提升其应用价值。3.研究表明，与其他链球菌菌种相比，嗜热链球菌不具有致病性而具备良好的发酵特性。嗜热链球菌产酸、糖代谢、蛋白水解、产活性物质、后酸化等代谢特征在其菌株水平具有特异性，直接影响发酵乳制品的成本和质地。嗜热链球菌cicc 6038遗传性状稳定，乳酸代谢能力强，后酸化较弱，是一株极具开发潜力的优质发酵剂菌株。因此，快速、精准的“株”水平鉴定方法是嗜热链球菌cicc 6038菌株研究开发和商业化应用的重要技术保障，对其工业化生产具有重要的意义。4.ncbi genbank数据库中已收录超过200株嗜热链球菌的基因组数据。然而，大多数常用的微生物测序手段只能将微生物鉴定到种(species)水平，但嗜热链球菌不同分离株之间存在潜在的功能差异。因此，需要针对性地开发每一株目标菌株的专属性鉴定方法，实现其“株”水平的快速且精准的鉴定。技术实现要素：5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种简单、快速鉴定嗜热链球菌cicc 6038菌株的方法及其引物、试剂盒和应用。6.本发明提出如seq id no:1所示的核苷酸序列在鉴定嗜热链球菌cicc 6038菌株中的应用。7.可选的，seq id no:1所示的核苷酸序列上的第208位、第537位的碱基为多态性位点。8.本发明提出了一种嗜热链球菌cicc 6038菌株的鉴定方法，至少包括以下步骤：9.s1、提取待测菌株的基因组dna；10.s2、针对seq id no:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物覆盖至少一个seq id no:1的多态性位点；11.s3、利用引物对基因组dna进行扩增，获得实际扩增产物；12.s4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非嗜热链球菌cicc 6038；13.s5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与seq id no:1所示的核苷酸序列进行对比：14.如实际扩增产物多态性位点的碱基与seq id no:1相同，待测菌株鉴定为嗜热链球菌cicc 6038；15.如实际扩增产物多态性位点的碱基与seq id no:1不同，待测菌株鉴定为非嗜热链球菌cicc 6038。16.可选的，嗜热链球菌cicc 6038菌株的鉴定方法至少包括以下步骤：17.s1、提取待测菌株的基因组dna；18.s2、针对seq id no:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物至少覆盖seq id no:1的第208位～第537位的碱基；所述目的扩增产物的长度为330bp～762bp；19.s3、利用引物对基因组dna进行扩增，获得实际扩增产物；20.s4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非嗜热链球菌cicc 6038；21.s5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与seq id no:1所示的核苷酸序列进行对比：22.如实际扩增产物在seq id no:1所示的核苷酸序列的对应位置上第208位的碱基为t且第537位的碱基为c，待测菌株鉴定为嗜热链球菌cicc 6038；23.如实际扩增产物在seq id no:1所示的核苷酸序列的对应位置上第208位的碱基不为t或第537位的碱基不为c，待测菌株鉴定为非嗜热链球菌cicc 6038。24.可选的，在s2中，目的扩增产物的长度为400bp～600bp。25.可选的，在s2中，引物的目的扩增产物至少覆盖seq id no:1的第119位～第625位的碱基。26.可选的，引物的核苷酸序列如seq id no:2和seq id no:3所示。27.本发明提出一种于鉴定嗜热链球菌cicc 6038菌株的试剂盒，应用seq id no:1所示的核苷酸序列进行菌株鉴定，包括采用pcr技术和基因测序技术检测seq id no:1所示的核苷酸序列上的多态性位点。28.可选的，试剂盒内包括核酸扩增试剂，核酸扩增试剂内至少含有如seq id no:2和seq id no:3所示的核苷酸序列的引物对。29.本发明提出一种用于鉴定嗜热链球菌cicc 6038菌株的引物，其核苷酸序列如seq id no:2和seq id no:3所示。30.本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：31.本发明利用了链球菌属的特有保守基因序列，提出了一种简单、快速鉴定嗜热链球菌cicc 6038菌株的方法。32.在优选的技术方案中，本发明的引物在链球菌属上特异性良好且在“株”水平上可以精准、快速鉴定cicc 6038菌株。附图说明33.图1是保守基因6038gl000641与其44个ncbi库中近缘序列构建的进化发育树；34.图2是3对引物的特异性扩增验证电泳图；1为cicc 6038，2为cicc 6222，3为cicc10135r，4为cicc 10387，5为cicc 10465，6为cicc 25094，7为cicc 25139；35.图3是seq id no:2和seq id no:3所示引物对的特异性扩增验证电泳图；1为cicc6038-1，2为cicc 6038-2，3为cicc 6038-3，4为cicc 6058，5为cicc 6063，6为cicc6222，7为cicc 10135r，8为cicc 10138r，9为cicc 10141r，10为cicc 10387，11为cicc 10465，12为cicc 25139，13为cicc 25094，14为cicc 6246，15为cicc 24337，16为cicc 6081，17为cicc 6117，18为cicc 6132，19为空白；36.图4是seq id no:1所示序列与嗜热链球菌26条同源代表序列单核苷酸多态性位点对比信息图。以cicc 6038(第一列，cicc 6038)作为模板，同一位点与模板相同则标记为“·”，不同则标记差异碱基。具体实施方式37.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。38.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。39.本发明实施例的第一个方面提供了一条链球菌属特有保守基因序列在鉴定嗜热链球菌cicc 6038菌株中的应用，核苷酸序列如seq id no:1所示。40.从中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)菌种资源库及ncbi genbank数据库中搜集嗜热链球菌全基因组数据，通过比较基因组学分析获得cicc 6038基因组上的一条保守编码蛋白的核酸序列(如seq id no:1所示)及其特有snp位点信息。该核酸序列作为编码基因被命名6038gl000641，经与swissprot和ncbi数据库比对后推测为酪氨酸型位点特异性重组酶(site-specific tyrosine recombinase xerd)。在ncbi nt数据库中通过blast检索其同源序列，链球菌属外无结果，链球菌属上有112条同源结果。其中，86条结果为嗜热链球菌，与基因6038gl000641比对的序列覆盖率均为100％，序列相似度均大于98％；4条结果序列比对覆盖率只有7％，直接舍弃；其余22条序列分布在嗜热链球菌近缘物种唾液链球菌(21条)和前庭链球菌(1条)上，比对的序列覆盖率均为100％，序列相似度均在81％～84％之间。将基因6038gl000641与嗜热链球菌86条同源序列去冗余后的22条代表序列，以及其余非嗜热链球菌同源序列，共45条核酸序列一起构建进化发育分析，结果详见图1。结果表明，seq id no:1所示核苷酸序列的同源序列只存在于链球菌属中，在嗜热链球菌上保守且普遍存在，而在其它链球菌上不存在或同源性相对较低，是嗜热链球菌特有的保守遗传标记。41.经实验验证，利用seq id no:1所示的核苷酸序列及其特定的snp位点，可以将嗜热链球菌cicc 6038菌株与其他菌株鉴别出来。其中，seq id no:1所示的核苷酸序列上的第208位、第537位的碱基为多态性位点。42.本发明实施例的第二个方面提供了嗜热链球菌cicc 6038菌株的鉴定方法，利用引物可以特异性在链球菌中扩增目的片段；在此基础上，鉴别目标菌株是否为cicc 6038必须满足引物扩增片段的特异性snp位点判别标准。具体包括以下步骤：43.s1、提取待测菌株的基因组dna；44.s2、针对seq id no:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物覆盖至少一个seq id no:1的多态性位点；45.s3、利用引物对待测菌株的基因组dna进行扩增，获得实际扩增产物；46.s4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非嗜热链球菌cicc 6038；47.s5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与seq id no:1所示的核苷酸序列进行对比：48.如实际扩增产物多态性位点的碱基与seq id no:1相同，判定待测菌株鉴定为嗜热链球菌cicc 6038；49.如实际扩增产物多态性位点的碱基与seq id no:1不同，判定待测菌株鉴定为非嗜热链球菌cicc 6038。50.本发明实施例的鉴定方法，克服了现有方法中需要对16s rdna序列同源性进行分析的弊端，充分利用了嗜热链球菌的特有保守核酸序列，建立了一种简单、快速的鉴定方法，无需复杂的仪器，适合大规模推广应用。为了进一步保证鉴定的准确性，优选目的扩增产物覆盖两个seq id no:1的多态性位点、且实际扩增产物中两个多态性位点的碱基均与seq id no:1相同，判定为嗜热链球菌cicc 6038菌株。51.作为本发明实施例进一步优选的技术方案，嗜热链球菌cicc 6038菌株的鉴定方法，至少包括以下步骤：52.s1、提取待测菌株的基因组dna；53.s2、针对seq id no:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物至少覆盖seq id no:1的第208位～第537位的碱基；目的扩增产物的长度为330bp～762bp；54.s3、利用引物对基因组dna进行扩增，获得实际扩增产物；55.s4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非嗜热链球菌cicc 6038；56.s5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与seq id no:1所示的核苷酸序列进行对比：57.如实际扩增产物在seq id no:1所示的核苷酸序列的对应位置上第208位的碱基为t且第537位的碱基为c，待测菌株鉴定为嗜热链球菌cicc 6038；58.如实际扩增产物在seq id no:1所示的核苷酸序列的对应位置上第208位的碱基不为t或第537位的碱基不为c，待测菌株鉴定为非嗜热链球菌cicc 6038。59.在上述优选的技术方案中，引物的目的扩增产物覆盖seq id no:1的第208位～第537位的碱基时，目的扩增产物的长度为330bp；即目的扩增产物覆盖第208位、第537位两个多态性位点。为了保证测序的准确性，可将目的扩增产物的长度适当延长，例如，可将上游引物设计在seq id no:1的第208位碱基上游10～100个bp的位置，下游引物设计在seq id no:1第537位的碱基下游的10～100个bp的位置。当引物的目的扩增产物覆盖seq id no:1的全部碱基时，目的扩增产物的长度为762bp。60.作为本发明实施例进一步优选的技术方案，在s2中，目的扩增产物的长度可以为400bp～600bp，更优选450bp～550bp；该长度范围内的目的扩增产物既可以对目的片段具有很好的覆盖，同时该长度的核苷酸片段的扩增和测序都比较快速、高效和准确。61.作为本发明实施例进一步优选的技术方案，在s2中，引物的目的扩增产物至少覆盖seq id no:1的第119位～第625位的碱基。针对seq id no:1的第119位～第625位的碱基，本发明实施例通过引物筛选，获得了一对扩增效果最佳的引物对，核苷酸序列如seq id no:2和seq id no:3所示(见表1)。62.表1：cicc 6038的特异性引物信息[0063][0064]利用该引物对扩增得到的pcr产物长度为507bp，产物90号位点碱基为t(该snp位点位于一段15bp核酸序列acgtaagtgctcggc，下划线标出)和产物419号位点碱基为c(该snp位点位于一段15bp核酸序列ttaaaaacgacaata上，下划线标出)。[0065]本发明实施例基于基因序列开发的鉴别cicc 6038的特异性引物，在嗜热链球菌物种水平上具有特异性，可以获得507bp的目标产物，利用其pcr扩增出目的条带的菌株可以被鉴定为嗜热链球菌。通过实验证实，该引物对检测的准确性良好，对近缘菌株具有100％的区分。利用ncbi引物工具primer-blast在细菌(bacteria《taxid:2》)基因组范围内验证seq id no:2和seq id no:3所示引物对的特异性，允许每条引物有不多于6个碱基的错配，扩增片段长度不超过2000bp。seq id no:2和seq id no:3所示的引物对在ncbi数据库中都只在嗜热链球菌上存在结果，表明该引物对在嗜热链球菌上具有良好的特异性。[0066]本发明实施例的第三个方面提供了一种于鉴定嗜热链球菌cicc 6038菌株的试剂盒，应用seq id no:1所示的核苷酸序列进行菌株鉴定，包括采用pcr技术和基因测序技术检测seq id no:1所示的核苷酸序列上的多态性位点。具体的，seq id no:1所示的核苷酸序列上的第208位、第537位的碱基为多态性位点。[0067]作为本发明实施例的一种改进，试剂盒内包括核酸扩增试剂，核酸扩增试剂内至少含有如seq id no:2和seq id no:3所示的核苷酸序列的引物对。除引物外，还包括dntps、buffer和dna聚合酶等。具体可为：引物(10μmol/l)2μl×2，2×pcr taqmix 25μl，ddh2o21μl。[0068]本发明实施例的第三个方面提供了一种用于鉴定嗜热链球菌cicc 6038菌株的引物，其核苷酸序列如seq id no:2、seq id no:3所示。[0069]下面通过具体实施例进一步说明本发明实施例，以下实施例所采用的实验试剂均为市售，所采用的菌株均为现有菌株，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)。[0070]实施例1[0071]本实施例用于说明引物设计及特异性验证过程。[0072]1)引物设计和选择：[0073]针对基因6038gl000641的核酸序列，使用primer premier 6设计包含snp位点的引物，并通过oligo 7对引物进行综合评估，最终筛选出3对特异性引物，如表1所示。在此基础上，选取cicc菌种资源实物库中嗜热链球菌cicc 6038、嗜热链球菌cicc 6222、嗜热链球菌cicc 10135r、变异链球菌cicc 10387、无乳链球菌cicc 10465、酿脓链球菌cicc 25094、停乳链球菌马样亚种cicc 25139等7株链球菌属菌株进行了引物扩增效率验证的实验，优选最佳引物方案。[0074]表2验证实验菌株信息[0075][0076]pcr反应体系为50μl总体积：dna模板2μl，引物(10μmol/l)2μl×2，2×pcr taqmix25μl，ddh2o 21μl；pcr扩增条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃35s，35个循环；72℃10min。将扩增产物进行凝胶电泳，结果详见图2。[0077]如图2所示的实验结果可知，seq id no:2和seq id no:3所示的引物扩增效率高，且特异性更好。其它2对引物在对照菌株中出现非目的片段的扩增产物。后续对，seq id no:2和seq id no:3所示的引物进行特异性扩增验证实验。[0078]2)引物特异性验证：[0079]为了全面评估seq id no:2和seq id no:3所示的引物在嗜热链球菌上的特异性，选取18株菌作为实验验证菌株，包含cicc 6038同株不同代的3株菌，6株非cicc 6038的嗜热链球菌，4株链球菌属其它种的菌株，2株链球菌科其它属的菌株，3株其它科的菌株。验证菌株具体信息如表2所示，涵盖了同株不同代(株内)、同种不同株(株间)、同属不同种(种间)、同科不同属(属间)、不同科的分类学情况。菌株经活化、转接培养以及纯度确认无误后，提取基因组dna，进行引物pcr扩增验证实验。[0080]pcr反应体系为50μl总体积：dna模板2μl，引物(10μmol/l)2μl×2，2×pcr taqmix25μl，ddh2o 21μl；pcr扩增条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃35s，35个循环；72℃10min。将扩增产物进行凝胶电泳，结果详见图3。[0081]如图3所示，9株嗜热链球菌在相应位置均有明亮的条带，9株非嗜热链球菌包括4株链球菌属菌株在内均无条带。结果表明引物seq id no:2和seq id no:3在嗜热链球菌种内扩增效率高且具有良好的特异性，非嗜热链球菌的其它物种无法扩增出产物。[0082]实施例2：[0083]本实施例用于说明特异性引物在嗜热链球菌物种基因组中鉴别cicc 6038菌株的过程。[0084]为了检验嗜热链球菌种内cicc 6038“株”水平的鉴别标准是否普遍适用，搜集了ncbi refseq数据库中176个基因组与cicc库中6个基因组(表2中非cicc 6038的嗜热链球菌株)，共182个嗜热链球菌基因组作为参考基因组，从基因组层面进行补充验证。[0085]以seq id no:1作为模板，使用软件blast检索其在182个基因组上的同源序列，并使用软件cd-hit对同源序列按照100％相似度聚类、去冗余，最终获得了26个同源组。每个同源组内各嗜热链球核酸序列完全相同，因此每组选取一条代表序列，与seq id no:1比对获取基因差异位点信息，详见图4。[0086]结果表明，cicc 6038在seq id no:1的第208位、第537位的碱基与其余嗜热链球菌同源序列同一位点的碱基均不相同，可以作为其株水平鉴别的特有遗传标记，且该判别标准在嗜热链球菌物种上具有普适性。因此，扩增产物涵盖这两个snp位点的引物seq id no:2和seq id no:3能够明确地在株水平鉴定cicc 6038菌株。[0087]实施例3：[0088]本实施例用于说明两个多态性位点在不同代cicc 6038菌株株内的遗传稳定性。[0089]1)样品信息及dna模板提取[0090]从cicc菌种资源库中获得菌株cicc 6038，使用m17培养基在37℃有氧环境下培养、传代；获得第1代(6038-1)、第3代(6038-2)和第5代(6038-3)三批菌株，使用细菌基因组dna提取试剂盒(cat.#dp302-02，tiangen，北京)提取菌株的基因组dna。[0091]2)特异性引物扩增目的片段[0092]pcr反应体系为50μl总体积：dna模板2μl，引物(10μmol/l)2μl×2，2×pcr taqmix25μl，ddh2o 21μl；pcr扩增条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃35s，35个循环；72℃10min。将pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，扩增片段长度均符合理论设计长度(507bp)，结果如见图3，其中，1为cicc 6038-1，2为cicc 6038-2，3为cicc 6038-3。[0093]3)测序及鉴定结果[0094]pcr扩增产物经过测序获得长度为507bp的核酸序列，产物的第90位和第419位碱基分别对应seq id no:1的第208位和第537位碱基。结果表明，引物在6038-1、6038-2、6038-3三个样品中扩增片段长度一致、核酸序列100％匹配，与cicc 6038基因组上保守序列seq id no:1预测的pcr产物序列完全一致。这表明本发明提出的判别标准所依据的snp位点在cicc 6038株内遗传稳定，可以作为cicc 6038菌株鉴定的有效参考。[0095]实施例4：[0096]本实施例用于说明特异性引物在嗜热链球菌种内不同菌株间快速、精准地鉴定菌株cicc6038的验证过程。[0097]1)样品信息及dna模板提取[0098]从cicc菌种资源库中获得菌株cicc 6058、cicc 6063、cicc 6222、cicc 10135r、cicc 10138r、cicc 10141r作为株间特异性引物验证的实验菌株。这些菌株都已完成了高通量测序获得了其基因组数据，并经过生物信息学分析鉴定其均属于嗜热链球菌。其中，全基因组snp分析可以确定它们属于不同的菌株，snp信息详见表3。菌株培养条件及基因组dna提取方法同实施例3。[0099]表3：实验菌株全基因组snp距离矩阵[0100][0101]2)特异性引物扩增目的片段[0102]pcr扩增体系和扩增条件同实施例3，将pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，扩增片段长度均符合理论设计长度(507bp)，结果详见图3。[0103]3)测序及鉴定结果[0104]表4：cicc 6038与其它嗜热链球菌菌株扩增片段差异[0105][0106]除cicc 6038菌株以外，其它6株嗜热链球菌的pcr产物经测序也分别获得了507bp的核酸序列。将这些测序获得的序列与cicc 6038菌株的扩增产物序列做对比，获取基因差异位点信息，详见表4。6株非cicc 6038菌株的扩增产物第90位和第419位碱基分别是“c”和“t”，与cicc 6038菌株不同，均不符合判别标准。这表明本发明提出的判别标准所依据的snp位点差异在嗜热链球菌上具有普适性，可以用以cicc 6038菌株鉴定。[0107]实施例5：[0108]本实施例用于说明引物在非嗜热链球菌上的特异性验证过程。[0109]1)样品信息及dna模板提取[0110]从cicc菌种资源库中获得9株非嗜热链球菌株，cicc 10387(变异链球菌)、cicc 10465(无乳链球菌)、cicc 25139(停乳链球菌马样亚种)和cicc 25094(酿脓链球菌)作为链球菌属内不同种特异性引物验证的实验菌株；cicc 6246(乳酸乳球菌乳亚种)和cicc 24337(乳酸乳球菌乳脂亚种)作为链球菌科内不同属内特异性引物验证的实验菌株；cicc 6081(嗜酸乳杆菌)、cicc 6117(干酪乳杆菌)和cicc 6132(罗伊氏粘液乳杆菌)，作为其他科特异性引物验证的实验菌株。菌株培养条件及基因组dna提取方法同实施例3。[0111]2)特异性引物扩增目的片段[0112]pcr扩增体系和扩增条件同实施例3。9株非嗜热链球菌的pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，均没有目标条带，结果详见图3所示。4株链球菌属的菌株也没有有效扩增，这与引物设计过程中序列验证结果一致。[0113]综上，实验验证结果与序列验证结果表明seq id no:2和seq id no:3所示引物的有效扩增可以判定菌株为嗜热链球菌，结合扩增产物上snp位点的信息，可以实现在株水平上有效地鉴别cicc 6038菌株。[0114]以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。









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