甲状腺过氧化物酶抗原决定簇多肽、蛋白抗原、固定态蛋白抗原、试剂盒及应用的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及疾病的诊断和治疗技术领域，具体涉及一种甲状腺过氧化物酶抗原决定簇多肽、蛋白抗原、固定态蛋白抗原、试剂盒及应用。背景技术：2.自身免疫性疾病(autoimmune disease，ad)是指由于抗自身结构抗体的产生和t细胞的细胞毒性作用而引起的器官炎症所导致的一系列疾病，以自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease，aitd)最为常见。占总ad的30％。aitd主要由甲状腺抗体参与导致的甲状腺损害，包括毒性弥漫性甲状腺肿块(graves’disease，gd)、慢性淋巴细胞性甲状腺炎[包括桥本氏病(hashimoto’sthyroiditis，ht)和萎缩性甲状腺炎]、无痛性甲状腺炎等，一般人群中发病率可达5％-10％，女性患病率明显高于男性。[0003]遗传倾向和环境因素的互相作用是导致aitd发生的关键因素，基因的因素在出现甲状腺过氧化物酶抗体和甲状腺球蛋白抗体升高的人当中作用非常的明显。甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibodies，hgab)和甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibodies，tpoab)是诊断aitd的标志性抗体。[0004]甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase，tpo)由甲状腺滤泡细胞合成，它是由933个氨基酸残基组成的分子量为103kd的10％糖化的血色素样蛋白质，在滤泡腔面的微绒毛处分布最为丰富。tpo是催化甲状腺激素的重要酶，在甲状腺激素的生物合成中tpo参与2种不同的反应：酪氨酸残基的碘化，以及甲状腺球蛋白上2个碘酪氨酸残基的氧化偶联。tpo能诱导机体产生高亲和力的igg抗体(tpoab)，与tpo特异的t淋巴细胞分别参与甲状腺的浸润与破坏。[0005]tpoab一般属于iggi或igg4，随病例不同而异。tpo可以激活补体级联反应，通过抗体依赖的细胞毒效应破坏甲状腺细胞。tpoab阳性提示甲状腺的淋巴细胞浸润以及甲状腺细胞破坏。tpoab滴度升高常预示甲状腺功能异常，即使是在aitd的亚临床阶段。此外在接受治疗时，体内tpoab的滴度会同步下降。因此，tpoab的检测，对于aitd的预后判断和监测治疗效果有重要的意义。[0006]tpoab的检测临床上常用免疫检测方法有酶联免疫法(elisa)、化学发光免疫分析法(clia)等，但天然tpo分子体积大，空间位阻大，在体外诊断检测过程中不能灵敏的与tpoab发生特异性结合，导致检测结果的准确度不够高，影响检测结果的准确性。技术实现要素：[0007]本发明针对现有tpoab的检测临床上常用免疫检测方法存在的上述问题，提供一种甲状腺过氧化物酶抗原决定簇多肽。[0008]本发明的技术方案如下：一种甲状腺过氧化物酶抗原决定簇多肽，所述甲状腺过氧化物酶抗原决定簇多肽为甲状腺过氧化物酶抗原决定簇中基因位点在1702～2622之间对应的片段。[0009]本发明中，基因位点在1702～2622之间对应的片段为“热点”区，将其作为有效的检测片段，从而避免使用甲状腺过氧化物酶整个分子，从而提高了检测的灵敏性；在测定人血清中甲状腺过氧化物酶抗体浓度的药物或工具中具有很好的应用前景。[0010]本发明还提供了一种甲状腺过氧化物酶蛋白抗原，所述甲状腺过氧化物酶蛋白抗原主要由所述甲状腺过氧化物酶抗原决定簇多肽通过偶联剂与载体蛋白结合制备而成的。[0011]本发明中，甲状腺过氧化物酶蛋白抗原具有良好的抗原性，能与甲状腺过氧化物酶抗体发生特异性结合，在测定人血清中甲状腺过氧化物酶抗体浓度的药物或工具中具有很好的应用前景。[0012]作为优选地，所述载体蛋白包括血蓝蛋白、牛血清白蛋白以及卵清蛋白中的一种。[0013]本发明还提供了一种固定态蛋白抗原，所述固定态蛋白抗原主要由所述甲状腺过氧化物酶蛋白抗原通过偶联剂与固定相结合制备而成的。[0014]本发明还提供了一种用于检测甲状腺过氧化物酶抗体的试剂盒，所述的甲状腺过氧化物酶蛋白抗原，或所述的固定态蛋白抗原，能够提高体外定量检测人血清中检测甲状腺过氧化物酶抗体浓度的准确度，在测定人血清中甲状腺过氧化物酶抗体浓度中具有很好的应用前景。[0015]作为优选地，所述试剂盒包括磁微粒、酶标记的甲状腺过氧化物酶抗体以及发光底物，所述磁微粒上包被有所述甲状腺过氧化物酶蛋白抗原，或所述固定态蛋白抗原。[0016]作为优选地，所述试剂盒还包括缓冲液。[0017]本发明的有益效果：本发明公开的试剂盒检测结果准确度高，在测定人血清中甲状腺过氧化物酶抗体浓度中具有很好的应用前景。具体实施方式[0018]实施例1[0019]s1、甲状腺组织总rna的提取[0020]采用trhol一步法从graves病患者甲状腺组织标本中提取总rna，具体如下：[0021]s1-1、从液氮中取出手术切除的甲状腺组织标本约40mg，在放有液氮的研钵中研成粉末后移入加有1ml trhol试剂的冰浴的玻璃匀浆器中，冰浴下匀浆5min，得到匀浆液；[0022]s1-2、将匀浆液移入1.5ml离心管中，25℃水浴5min，加0.2ml三氯甲烷剧烈振荡15s，25℃水浴3min，4℃，12000rpm离心15min；[0023]s1-3、吸取上层水相加等量异丙醇，混匀，25℃水浴10min，4℃，12000rpm离心15min；[0024]s1-4、弃上清，加入75％乙醇1ml，混匀，4℃，7500rpm离心5min，弃上清；[0025]s1-5、将rna沉淀晾干，加入去离子甲酰胺60μl，55-60℃温浴10min，加入无rnase的dnase 37℃水浴30min，酶切降解可能混杂的基因组dna，然后进行总rna纯度、浓度和完整性的鉴定。[0026]s2、逆转录合成甲状腺cdna[0027]采用oligo(dt)15为逆转录引物，以mrna为模板，在逆转录酶的作用下合成与mrna互补的单链dna，即cdna。[0028]s3、目的基因的pcr扩增及其鉴定[0029]用taq platinum聚合酶扩增目的基因，反应体系：10μm上游引物1.0μl，10μm下游引物1.0μl，cdna 1.5 1.0μl，2×mastermix×12.5μl，去离子水9.0μl，总反应体积25.0μl；反应条件：预变性94℃3min，变性94℃45s，退火63℃1min，延伸72℃45s，72℃7min，35个循环。纯化后以限制性内切酶apa i进行单酶切鉴定。[0030]s4、tpo抗原决定簇基因原核表达载体的构建[0031]新鲜的pcr回收产物与pcdnatm 3.1d/v5-his-topo载体进行拓扑克隆，即轻柔的混合反应物，室温(22-23℃)孵育30min；取3μl混合物与e.coli oneshot topl0(50μl)混合，冰浴30min；将混合物置于42℃的水浴中热休克30s；使混合物立即冷却，加入250μl soc培养基，放入空气浴振荡器，37℃200rpm 1h：取1000μl混合物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素lb培养板上，37℃过夜培养。[0032]s5、重组质粒的提取和鉴定[0033]先提取质粒，做pcr鉴定，以限制性内切酶bamh i、hind iii、xba i做单酶切和双酶切鉴定，并进一步进行测序鉴定，插入序列i498bp，故测序分4段进行测序，序列分别如下：(1)t7正向引物：5'-taatacgactcactataggg-3’(20bp)；(2)中问上游引物：5'-tgccaattgctgtgcc-3’(16bp)；(3)中间下游引物：5'-gcattcctcatcttggg-3’(17bp)；(4)bgh反向引物：5'-tagaaggcacagtcgagg-3’(18bp)；配制1％琼脂糖凝胶，以generuler tm l00bp dna ladder plus和l00bp dna ladder作为核酸分子量标准，通过电泳进行鉴定。[0034]s6、制备tpo蛋白抗原[0035]取步骤s5中得到的重组质粒2mg，用500μl偶联缓冲液mes(0.1mol/lph4.5-5.0)溶解；牛血清白蛋白2mg，用200μl的去离子水溶解；混合所得两份溶液，冷却至0℃，取bdb偶联剂氯化铬200μl(10g/l)，室温下过夜反应，4℃透析3天后分装，即得到tpo蛋白抗原(2mg/ml)，分装并置于-20℃保存。[0036]s7、制备浓度为1μg/mg和0.2mg/ml的tpo蛋白抗原偶联的磁微粒[0037]取1ml tpo蛋白抗原(2mg/ml)超滤后加入26μl 10mm nhs-peg4-biotin，室温反应1h；反应完成后，葡聚糖凝胶分离纯化，洗脱液为tris-hcl缓冲液；通过硫酸铵沉淀法使tpo蛋白抗原析出，随后使用缓冲液配制为0.5mg/ml的溶液；取2ml 10mg/ml tosyl磁微粒，加入缓冲液4ml，混匀；取上清，洗涤三次，每次加入6ml缓冲液；洗涤完成后取10ml缓冲液重新悬浮；取生物素标记的tpo蛋白抗原0.2ml，与磁微粒连接，室温反应30min；向磁微粒溶液中加入0.2ml封闭液，反应15min。在磁力分离器上静止10min，取上清液，加如缓冲液洗涤3次，每次6ml；加入100ml缓冲液定容。[0038]s8、用于检测甲状腺过氧化物酶抗体的试剂盒[0039]1μg/mg 0.2mg/ml tpo蛋白抗原偶联的磁微粒、缓冲液、0.1mm碱性磷酸酶标记的鼠抗人tpoab igg抗体。[0040]s9、检测人血清中的tpoab浓度[0041]分别制备三份tpo蛋白抗原包被的磁微粒和tpo抗原包被的磁微粒，使用雷杜lumiray 1600化学发光测定仪，检测浓度为30.00iu/ml和200.00iu/ml准确度参考品，重复测定3次，计算该检验方法的准确度，结果如表1所示。[0042]检验方法：50μl tpo蛋白抗原包被磁微粒与30μl待测样本混匀，37℃孵育10min，洗涤3次；再加入50μl碱性磷酸酶标记的鼠抗人tpoab igg抗体，37℃孵育10min，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，洗涤3次，未被结合的酶标抗体以及其它物质被去除；加入化学发光底物3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(amppd)，发光底物在碱性磷酸酶的催化下发射出光子，所产生的光子数与样本中tpoab浓度成正比。[0043]表1准确度测定结果[0044][0045]由表1可知，tpo蛋白抗原包被的磁微粒检测结果的相对偏差小于tpo抗原包被的磁微粒，因此tpo蛋白抗原包被的磁微粒检测结果的准确性较高，有推广应用的前景。[0046]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。









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