一种小鼠胃癌腹膜转移模型及其建立方法与应用 专利技术说明

农业,林业,园林,畜牧业,肥料饲料的机械,工具制造及其应用技术1.本发明涉及实验动物模型构建领域，具体涉及一种小鼠胃癌腹膜转移模型及其建立方法与应用。背景技术：2.胃癌严重威胁着人民群众的生命健康，现有的标准治疗外科方案为，手术根治性切除联合术后化疗。然而，即便经过规范标准的外科治疗，仍有高达20％的进展期胃癌患者发生以腹膜种植为代表的腹腔隐匿性复发转移，中位生存期不到半年，这是影响胃癌预后的重要因素，同时也提示围手术期的检查容易漏诊腹膜转移这一重要事件。3.为了缩小各种新型诊疗方案临床前试验疗效和实际临床结果之间的差异以及更好的探究人胃癌腹膜转移的机制和病理生理过程，需要一种模拟真实胃癌腹膜转移的动物模型。肿瘤的发生和发展过程是一个多因素、多步骤的复杂生物学演变过程。目前胃癌腹膜转移相关机制尚未完全查明，理想的动物模型在肿瘤转移的研究中占有极其重要的地位，因此无论是对胃癌腹膜转移病理生理过程和机制的研究还是对胃癌腹膜转移新型诊疗方案的研究最终都要适宜的动物模型来进行探索。4.目前，常用于建立小鼠胃癌腹膜转移模型的方法主要为移植性小鼠胃癌模型，根据移植物又可分为细胞移植和组织移植。目前，有多种方法将胃癌细胞或组织定植于小鼠腹膜，如开腹后手术移植肿瘤组织、直接注射肿瘤细胞等。但手术开腹存在创面大、术后感染风险高，操作难度大等缺点；直接注射肿瘤细胞又有着容易误注射入小鼠肠道、肿瘤分布不符合临床实际分布等局限，难以满足基础研究和临床转化的需求。与此同时，现有技术的胃癌小鼠模型要么制备周期长、成瘤均一度差，要么未能完全模拟自然转移过程、并发症多，要么制备操作复杂、成功率较低、模型不稳定。因此，目前迫切需要一种操作简单、可重复性高、成功率高、可模拟真实胃癌腹膜转移病理生理过程，再现真实病灶特征的模型构建方法。技术实现要素：5.针对现有技术中的不足，本发明的首要目的在于提供一种小鼠胃癌腹膜转移模型的建立方法。6.本发明的再一目的是，提供如上所述方法建立的小鼠胃癌腹膜转移模型。7.本发明的另一目的是，提供如上述小鼠胃癌腹膜转移模型的鉴定方法和应用。8.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：9.一种小鼠胃癌腹膜转移模型的建立方法，所述方法按以下步骤进行：10.以小鼠作为模型动物，麻醉后向小鼠腹腔内注射气体，使脏腹膜和壁腹膜分离，腹部保持气腹状态，向腹部注入胃癌细胞，注射完毕回抽腹腔内气体，接种后正常饲养3～4周，即构建完成小鼠胃癌腹膜转移模型。11.优选地，所述小鼠为6周龄健康spf级balb/c裸鼠，清洁级，体重为20±1.5g，在室温18～25℃、湿度30％～50％、标准饲料喂养、24h光暗交替条件下饲养。12.优选地，所述气体为空气、氧气、二氧化碳的一种，气体量为5～10ml；13.所述胃癌细胞为人源胃癌scg-7901细胞，人源胃癌bgc-803细胞，人源胃癌bgc-823细胞，鼠源胃癌mfc细胞的一种。14.优选地，所述向腹部注入胃癌细胞为根据四分法，将小鼠腹部分为左上腹、左下腹、右上腹、右下腹四个区域，后分别向四个区域注入75～400μl浓度为1×107～2×107/100μl的胃癌细胞。15.优选地，建立模型后每天观察记录裸鼠体重和腹围，腹部包块形成情况。16.优选地，建立模型3～5周后，处死小鼠，通过活体荧光成像技术检测肿瘤的形成。17.优选地，建立模型3～5周后，处死小鼠，解剖观察肿瘤形成及转移情况。18.一种小鼠胃癌腹膜转移模型，由上述的方法得到。19.上述方法在抗胃癌药物研发中的应用。20.上述方法在抗胃癌药物筛选中的应用。21.本模型通过向小鼠腹腔注射5ml气体分离脏壁层腹膜，创造性地建立“气腹”模型，形成充分的操作空间，可防止荷瘤过程中肿瘤细胞的误注射入肠道，导致肿瘤接种失败，同时利用重力因素，使大部分肿瘤细胞种植于壁腹膜，从而再现实际的临床分布。22.与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：23.本发明使用裸鼠进行多次动物实验，形成一种稳定的小鼠胃癌腹膜转移模型的建模方法。该建模方法先向裸鼠腹腔注射5ml二氧化碳，形成“气腹”模型后直接腹腔注射胃癌细胞，利用重力的因素使胃癌细胞充分与壁腹膜接触，稳定地诱导裸鼠产生腹膜转移，较为真实地模拟临床胃癌腹膜转移病理生理过程，更加适合针对胃癌腹膜转移的基础研究，为研究胃癌腹膜转移提供可靠的动物模型，具有较高的科研应用价值。24.本发明提供的建模方法能够在3～4周内发生腹膜转移，且模型构建成功率可以达到100％，模型稳定，可重复性高。附图说明25.为了更清楚地说明本发明具体实施方式的技术方案，下面对具体实施方式中需要使用的附图作简单介绍。应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。26.图1为“气腹法”构建胃癌腹膜转移模型示意图。27.图2为腹膜转移模型构建后小鼠的体重、腹围及腹部包块的变化情况。28.图3为胃癌腹膜转移模型建模成功小鼠腹膜荧光成像验证图。29.图4为胃癌腹膜转移模型建模成功小鼠腹膜及其他重要脏器解剖图。具体实施方式30.下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。31.本发明实施例中涉及到的实验方法和实验仪器，其名称和简称均属于本领域内常规的名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的仪器，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。32.本发明实施例中使用的各种原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过市售购买获得的常规产品。也可以按照本领域技术人员熟知的常规方法进行制备。33.实施例1腹腔注射胃癌细胞株建立腹膜转移模型34.1、动物模型35.(1)其中，scg-7901细胞购于atcc，培养于含10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mmol/l谷氨酰胺的dmem细胞培养基中，置37℃、5％co2细胞培养箱中培养，2～3d传代换液1次。取对数生长期细胞，调整浓度为1×107/100μl。36.(2)准备6周龄健康spf级雌性balb/c裸鼠(balb/c-nu)20只，体重20g左右，购于南方医科大学生物医学研究所(中国广州)。动物护理和安乐死由南方医科大学动物护理和使用委员会(iacuc)批准(认证号为。k2020015)37.(3)根据麻醉预实验结果选取10％水合氯醛，腹腔注射，按体重计算用量，30ul/10g。向裸鼠腹腔内注射5ml二氧化碳(空气、氧气均可)，使脏腹膜和壁腹膜分离，保持气腹状态。38.(4)将“气腹”状态的裸鼠腹部分为左上腹、左下腹、右上腹、右下腹四个区域，后分别向四个区域注入75μl浓度为1×107/100μl的人源胃癌scg-7901细胞。注射完毕回抽腹腔内气体，使小鼠恢复正常状态。39.(5)接种后正常饮食，每日记录裸鼠体重及腹围，观察腹膜成瘤情况。40.2、小鼠一般情况和腹部体征变化41.腹腔注射腹膜转移模型建立后，每日观察小鼠体重，腹围以及小鼠腹部体征。42.结果如图2所示，随着造模时间延长，小鼠体重未有明显增加，腹围轻度增宽。造模21天后，小鼠腹部有多发细小突起，可在小鼠腹部触摸到沙砾样的多发质硬小结节，可见明显血性腹腔积液。43.3、活体荧光成像44.气腹法建立腹膜转移模型后，利用活体荧光成像检测肿瘤的形成和发展。45.结果如图3所示，可见腹部肿瘤荧光信号，表明小鼠腹腔形成了活体成像仪可检测到的一定数量的肿瘤细胞。处死裸鼠，解剖腹膜及其他重要脏器后，发现荧光主要集中于壁腹膜上的肿瘤病灶和肝转移灶。46.4、解剖观察47.处死裸鼠，解剖腹膜及其他重要脏器。结果如图4所示，可见小鼠腹膜形成多个转移结节。且肿瘤病灶主要集中于壁腹膜，少量分布于脏层腹膜和肠系膜，并发现肝脏转移病灶。48.结合活体荧光成像、解剖结果，证实裸鼠胃癌腹膜转移模型建模成功。经统计，所有20只裸鼠胃癌腹膜转移成瘤率100％(20/20)，出现肉眼可见的腹膜转移病灶(壁腹膜和脏腹膜)和远端脏器的转移，包括肝、淋巴转移等。为本发明裸鼠胃癌腹膜转移模型的构建提供了理论和实验依据。49.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。









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