一种基于染料结合的快速分析肌原纤维蛋白净电荷的方法 专利技术说明

测量装置的制造及其应用技术1.本发明属于蛋白质理化特性分析领域，尤其涉及一种基于染料结合的快速分析肌原纤维蛋白净电荷的方法。背景技术：2.肌原纤维蛋白是肉制品中主要的功能性蛋白，具有凝胶、乳化、持水等功能特性。蛋白质功能特性与其理化性质息息相关。近年来研究表明蛋白质净电荷的变化为理解肌肉源食品贮藏加工过程中的品质变化提供了一个新的视角。目前，研究人员往往通过zeta电位的测定、聚电解质滴定法、毛细管区带电泳、蛋白等电点(pi)的变化来侧面表征肌原纤维蛋白电荷变化，但这些方法也相当复杂，而且不完全直观的体现测定结果。因此，有必要进一步表示蛋白质被氧化后表面净电荷的变化。染料结合法是一种利用蛋白与一些染料的结合反应所形成的蛋白质-染料复合物吸光度的变化分析蛋白质的相关性质的方法。染料结合法已经在生物化学及临床分析中得到广泛的应用，其中染料可以通过氢键、表面疏水作用、静电相互作用与蛋白结合。如考马斯亮蓝(cbb)g-250染料结合法测定样品中总蛋白；溴酚蓝染料结合法用来表征蛋白表面疏水能力。技术实现要素：3.针对现有技术的步骤，本发明旨在解决所述问题之一；提供了一种快速、灵敏、简单的通过蛋白与染料结合量分析氧化前后肌原纤维蛋白表面净电荷变化的方法。所述方法包括肌原纤维蛋白提取、肌原纤维蛋白模拟氧化体系的构建、肌原纤维蛋白表面净电荷的表征等。4.本发明引用两种不同的染料：橙黄og(带负电)、番红so(带正电)，当肌原纤维表面净电荷为负时，可以结合更多的带正电荷的染料番红；同样地，当其净电荷为正时，可以结合更多的带负电的橙黄g染料，通过不同带电染料与肌原纤维结合量可以侧面表征肌原纤维表面净电荷。5.该方法以鱼肉中主要蛋白质——肌原纤维蛋白进行研究，解决了传统方式中通过测定等电点时样品复杂的前处理问题，本发明通过染料与蛋白的结合量直观的判断肌原纤维蛋白表面净电荷的电负性与电荷的变化情况。为直观判断氧化介导的电荷变化控制鱼肉及其制品加工过程中蛋白质功能变化提供理论依据。6.为实现以上技术目的，本发明具体步骤如下：7.(1)将淡水鱼用清水冲洗干净，选取背部鱼肉，经清洗、去皮后进行搅碎处理获得鱼糜；8.(2)首先配制磷酸盐缓冲溶液，然后加入步骤(1)得到的鱼糜；搅拌均匀后进行均质、离心去除上清液，收集沉淀物；在得到的沉淀物再次加入磷酸盐缓冲溶液进行均质、冷冻离心，去除上清液，收集沉淀物；如此重复数次后；在最终收集的沉淀物中加入磷酸盐缓冲溶液进行均质，均质后经过滤得到滤液，进行离心，最终得到的沉淀即为肌原纤维；9.(3)肌原纤维氧化：在步骤(2)制备的肌原纤维中加入磷酸盐缓冲液，得到悬浊液；然后加入过氧化氢溶液和芬顿试剂进行反应，反应后，将其离心，所得沉淀物再用磷酸盐缓冲液离心洗涤数次，最终得到的沉淀为氧化后的肌原纤维，将氧化后的肌原纤维悬浮于磷酸盐缓冲液中，均质得到肌原纤维悬浊液；10.(4)配置染料溶液，分别配制番红染料溶液与橙黄染料溶液；11.(5)染料结合量的表征：12.(a)取磷酸盐缓冲液一定量，加入番红染料溶液，混合均匀并稀释数倍，通过紫外分光光度计在一定波长下测定其吸光度，记录吸光度值，记为a1空白；13.取步骤(3)氧化后的肌原纤维悬浊液一定量，加入番红染料溶液，混合均匀，并在室温下孵育，离心，取上清液稀释，稀释后的溶液即为样品溶液，并通过紫外分光光度计在一定的波长下测定其上清液的吸光度，记录吸光度值，a1样品，并计算出番红染料结合量；14.(b)取磷酸盐缓冲液一定量，加入橙黄染料溶液，混合均匀并稀释数倍，通过紫外分光光度计在一定波长下测定其吸光度，记录吸光度值，记为a2空白；15.取步骤(3)氧化后的肌原纤维悬浊液一定量，加入橙黄染料溶液，混合均匀，并在室温下孵育，离心，取上清液稀释，稀释后的溶液即为样品溶液，并通过紫外分光光度计在一定的波长下测定其上清液的吸光度，记录吸光度值，a2样品，并计算出橙黄染料结合量；16.(6)最后以步骤(5)的(a)中计算得到的番红染料结合量与步骤(5)的(b)中计算得到的橙黄染料结合量的大小作为评判肌原纤维蛋白表面净电荷电负性以及肌原纤维蛋白表面净电荷量的标准；根据步骤(5)的(a)和(b)中不同样品计算得到的两种染料结合量的变化来评价氧化前后肌原纤维蛋白表面净电荷变化；17.(a)判断表面电负性：番红染料溶液带正电，橙黄染料溶液带负电，两种染料由于静电相互作用可以与肌原纤维蛋白表面净电荷相结合；当橙黄染料的结合量》番红染料结合量时，说明肌原纤维蛋白表面净电荷为正；当橙黄染料的结合量《番红染料结合量时，说明肌原纤维蛋白表面净电荷为负；根据两种不同带电染料的结合量可以判断肌原纤维蛋白表面电负性；18.(b)判断肌原纤维蛋白表面净电荷的变化情况：当外界条件变化，包括ph、盐浓度；会影响肌原纤维蛋白表面净电荷，此时可通过其结合量的变化得出条件变化前后肌原纤维蛋白表面净电荷的变化；19.ph影响：当ph≤5时，蛋白结合更多的负电染料橙黄，表明肌原纤维蛋白带净的正电荷；而当ph≥5.5时，蛋白结合更多的正电染料番红，表明此时肌原纤维蛋白带净的负电荷；20.盐浓度：在ph在4.5的条件下，蛋白带净的正电荷，蛋白与橙黄染料的结合量随盐浓度的增加而降低，表明盐浓度增加屏蔽电荷使肌原纤维蛋白表面净电荷数量下降；在ph在6.5条件下，蛋白带净的负电荷，蛋白与番红染料的结合量随盐浓度的增加而降低，表明盐浓度增加屏蔽电荷使肌原纤维蛋白表面净电荷数量下降。21.优选的，步骤(1)中所述淡水鱼具体为黑鱼。22.优选的，步骤(2)中所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01m，ph为6.5，并含有nacl，终浓度为0.1m；磷酸盐缓冲溶液与鱼糜的用量比为4ml：1g；沉淀物中再加入磷酸盐缓冲溶液，两者的用量关系均为1g：4ml；所述的离心均在4℃，8000rpm条件下进行，且离心时间均为10～15min。23.优选的，步骤(3)中氧化后肌原纤维与磷酸盐缓冲溶液的用量比为1g:4ml；氧化氢溶液的浓度为20mm，氧化氢溶液与悬浊液的用量比为1ml：1ml；芬顿试剂由fecl3溶液和抗坏血酸溶液组成，其中fecl3溶液和抗坏血酸溶液的浓度均为1mm；fecl3溶液与肌原纤维悬浊液的用量比为1ml：100ml；所述抗坏血酸溶液肌原纤维悬浊液的用量比为1ml：10ml。24.优选的，步骤(3)中所述的离心均在4℃、8000rpm条件下进行，且离心时间均为10～15min；反应的时间为20～24h，所述肌原纤维悬浊液的浓度为0.25mg/ml。25.优选的，步骤(4)中番红染料溶液与橙黄染料溶液的浓度均为1mg/ml。26.优选的，步骤(5)的(a)中磷酸盐缓冲液与番红染料溶液的用量比为1ml:200μl；肌原纤维悬浊液与番红染料溶液的用量比为1ml:200μl；所述室温下孵育的时间为2h；所述的稀释倍数为10倍；离心条件为室温8000rpm，离心时间为3～5min；所述一定波长均为520nm。27.优选的，步骤(5)的(b)中磷酸盐缓冲液与橙黄染料溶液的用量比为1ml:200μl；肌原纤维悬浊液与橙黄染料溶液的用量比为1ml:200μl；所述室温下孵育的时间为2h；所述的稀释倍数为10倍；离心条件为室温8000rpm，离心时间为3min；所述一定波长均为495nm。28.优选的，步骤(5)的(a)中计算染料结合量的公式为：[0029][0030]公式中a1空白表示步骤(5)中磷酸盐缓冲液的吸光度，a1样品表示步骤(5)中样品溶液的吸光度；m表示染料的分子质量，其中番红染料的分子量为350.85。[0031]步骤(5)的(b)中计算染料结合量的公式为：[0032][0033]公式中a2空白表示步骤(5)中磷酸盐缓冲液的吸光度，a2样品表示步骤(5)中样品溶液的吸光度；m表示染料的分子质量，其中橙黄染料的分子量为452.37。[0034]有益效果：[0035]与对照组(0mm h2o2)相比，当h2o2浓度为10mm时，染料结合量发生改变。对照组肌原纤维蛋白番红染料溶液结合量为1.92±0.01μmol/mg，橙黄染料溶液结合量为0.02±0.006μmol/mg；而当h2o2浓度为10mm时，肌原纤维蛋白番红染料溶液结合量为1.98±0.02μmol/mg，橙黄染料溶液结合量为0.11±0.008μmol/mg。根据两种染料的结合量可以判定肌原纤维蛋白表面净电荷的电负性为负，且氧化会改变肌原纤维表面净电荷，番红染料溶液结合量增加表明肌原纤维蛋白氧化后表面净负电荷增加。因此，通过本发明的方法，可以快速准确通过染料与蛋白的结合量直观的判断肌原纤维蛋白表面净电荷的电负性与电荷的变化情况，为直观判断氧化介导的电荷变化控制鱼肉及其制品加工过程中蛋白质功能变化提供理论依据。[0036]具体原因在于，番红染料溶液带正电，橙黄染料溶液带负电，两种染料由于静电相互作用可以与肌原纤维蛋白表面净电荷相结合，根据两种不同带电染料的结合量可以判断肌原纤维蛋白表面电负性与肌原纤维蛋白表面净电荷的变化情况。附图说明[0037]图1是氧化对不同ph下肌原纤维蛋白胶状态的影响(a为对照组，b为氧化组)和肌原纤维蛋白溶液浊度(c)、zeta电位(d)的影响。[0038]图2为肌原纤维等电点变化影响电荷变化示意图。[0039]图3为不同ph条件下的氧化对肌原纤维蛋白结合染料(a：番红so、b：橙黄og)的影响。[0040]图4为不同盐浓度条件下氧化对肌原纤维蛋白结合染料(a：ph 4.5条件下；b：ph 6.5条件下)的影响。具体实施方式[0041]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，具体实施中的淡水鱼选择黑鱼。[0042]对比例：[0043](1)鱼肉的预处理：将黑鱼用清水冲洗干净，选取背部鱼肉，经清洗、去皮后进行搅碎处理获得鱼糜；[0044](2)肌原纤维提取：首先配制浓度为0.01m磷酸盐缓冲液，其ph为6.5且含有0.1mnacl，然后加入步骤(1)得到的鱼糜(磷酸盐缓冲溶液与鱼糜的用量比为4ml：1g)，搅拌均匀后进行均质、4℃，8000rpm离心15min，通过离心去除上清液，除去水溶性蛋白；得到的沉淀物再次加入磷酸盐缓冲溶液进行均质(沉淀物与磷酸盐缓冲溶液的用量关系为1g：4ml)、冷冻离心，去除上清液，收集沉淀物，如此重复数次后，在得到的沉淀物中再加入磷酸盐缓冲溶液进行均质，均质后经过滤得到滤液进行4℃，8000rpm离心15min，最终得到的沉淀即为肌原纤维；[0045](3)肌原纤维氧化：在步骤(2)制备的肌原纤维中加入磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲溶液与肌原纤维的用量比为4ml：1g)，得到悬浊液；然后加入过氧化氢溶液(浓度为20mm，且与悬浊液的用量比为1ml：1ml)和芬顿试剂(fecl3溶液和抗坏血酸溶液其浓度均为1mm，fecl3溶液与肌原纤维悬浊液的用量比为1ml：100ml；抗坏血酸溶液肌原纤维悬浊液的用量比为1ml：10ml)反应24h，反应完全后，将其4℃，8000rpm离心3min，所得沉淀物再用磷酸盐缓冲液洗涤3次，最终得到得沉淀为氧化后的肌原纤维，将氧化后的肌原纤维悬浮于磷酸盐缓冲液中，均质得到肌原纤维悬浊液(浓度为0.25g/ml)，备用。[0046](4)肌原纤维蛋白氧化前后等电点表征：采用等电沉淀法测定蛋白pi。将肌原纤维(1.5g)放入烧杯中，加入25ml蒸馏水。然后，加入25ml 1m氢氧化钠溶液，轻轻搅拌至蛋白质完全溶解。随后，在烧杯中加入25ml 1m醋酸溶液，搅拌至蛋白质混合均匀。最后，将完全溶解的蛋白质溶液转移到一个250ml的容量瓶中，定容备用。用醋酸溶液调整蛋白胶(15ml)的ph，溶液最终体积为35ml，每组ph分别为3.4、3.7、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.9、5.2、5.5、5.8、6.1、6.4。通过拍摄了照片来记录蛋白质胶的状态，如图1所示，与非氧化组相比(图1a)，氧化组中管内上清液(ph 3.4-4.2)逐渐变为浑浊，试管中沉积物(ph 4.3-4.5)逐渐增加(图1b)。用uv-vis-nir分光光度计在350nm处测定吸光度，获得蛋白胶的浊度，如图1中d图所示，随着ph值从4.0增加到6.4，两组样品的浊度先升高后降低。非氧化组的浊度在ph值为5.2左右最高，而氧化组的浊度在ph值为4.6最高。用激光粒度分析仪(莫尔文仪器公司，英国)测量了zeta电位分布，如图1中c所示，经过氧化后，zeta电位曲线转移到一个更酸性的区域。上述研究结果表明，经过氧化后，肌原纤维蛋白的pi值逐渐向酸性区域转移。[0047](5)通过等电沉淀的原理，由不同ph条件下肌原纤维蛋白的状态与肌原纤维蛋白的zeta电位曲线看出(氧化组)，氧化后，肌原纤维蛋白等电点向酸性区域移动，并且其等电点在5.0-5.2左右。而通过肌原纤维等电点变化影响电荷变化机理图看出(图2)，当ph＜pi时，肌原纤维蛋白带净的正电荷，氧化后肌原纤维蛋白pi向酸性区域移动，与环境ph差值变小，造成其表面净正电荷减少；当ph＞pi，肌原纤维蛋白带净的负电荷，氧化后，pi与环境ph差值变大，造成其表面净负电荷增加。传统方式考究氧化前后蛋白电荷变化需先测定氧化前后肌原纤维蛋白pi，或通过测定不同ph梯度下肌原纤维蛋白的zeta电位，并通过pi与环境ph之间的关系来探究氧化前后肌原纤维蛋白电荷变化情况，过程相对繁琐且不够直观。[0048]图1中a的操作同对照组步骤(3)～(4)中的操作，区别是将步骤(3)中的过氧化氢溶液替换为0.01m磷酸盐缓冲液(ph＝6.5)；[0049]图1c的操作同对照组步骤(3)～(4)中的操作，区别是将步骤(3)中的过氧化氢溶液替换为0.01m磷酸盐缓冲液(ph＝6.5)；[0050]图1d的操作同对照组步骤(3)～(4)中的操作，区别是将步骤(3)中的过氧化氢溶液替换为0.01m磷酸盐缓冲液(ph＝6.5)；[0051]实施例1：[0052](1)鱼肉的预处理：将黑鱼用清水冲洗干净，选取背部鱼肉，经清洗、去皮后进行搅碎处理获得鱼糜；[0053](2)肌原纤维提取：首先配制浓度为0.01m磷酸盐缓冲液，其ph为6.5且含有0.1m nacl，然后加入步骤(1)得到的鱼糜(磷酸盐缓冲溶液与鱼糜的用量比为4ml：1g)，搅拌均匀后进行均质、4℃，8000rpm离心15min，通过离心去除上清液，除去水溶性蛋白；得到的沉淀物再次加入磷酸盐缓冲溶液进行均质(沉淀物与磷酸盐缓冲溶液的用量关系为1g：4ml)、4℃，8000rpm离心15min，去除上清液，收集沉淀物，如此重复3次后，在得到的沉淀物中再加入磷酸盐缓冲溶液进行均质，均质后经过滤得到滤液进行4℃，8000rpm离心15min，最终得到的沉淀即为肌原纤维。[0054](3)肌原纤维氧化：在步骤(2)制备的肌原纤维中加入磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲溶液与肌原纤维的用量比为4ml：1g)，得到悬浊液；然后加入过氧化氢溶液(浓度为20mm，且与悬浊液的用量比为1ml：1ml)和芬顿试剂(由fecl3溶液和抗坏血酸溶液组成，其浓度均为1mm，fecl3溶液与肌原纤维悬浊液的用量比为1ml：100ml，抗坏血酸溶液与肌原纤维悬浊液的用量比为1ml：10ml)反应24h，反应完全后，将其4℃，8000rpm离心3min，所得沉淀物再用磷酸盐缓冲液洗涤3次，最终得到得沉淀为氧化后的肌原纤维，将氧化后的肌原纤维悬浮于磷酸盐缓冲液中，均质得到肌原纤维悬浊液(浓度为0.25g/ml)，备用。[0055](4)肌原纤维蛋白样品处理：首先配置不同ph的0.01m的磷酸盐缓冲溶液，其磷酸盐缓冲溶液的ph分别为4.5、5、5.5、6、6.5，随后，将步骤(3)中氧化后的肌原纤维悬浮在各组磷酸盐缓冲溶液中，其中肌原纤维与磷酸盐缓冲溶液的用量比为1g：4ml。[0056](5)染料结合量的表征：[0057](a)取步骤(4)中的各ph值的磷酸盐缓冲液1ml，各组加入200μl 1mg/l的番红染料，混合均匀孵育2h；随后并稀释10倍，通过紫外分光光度计在520nm下测定吸光度，记录吸光度值，记为a1空白；[0058]取步骤(4)中的肌原纤维蛋白样品1ml，各组加入200μl 1mg/l的番红染料，混合均匀孵育2h；8000rpm下离心5min，取上清液稀释10倍，通过紫外分光光度计在520nm下测定吸光度，记录吸光度值，记为a1样品，并通过公式计算染料结合量。[0059][0060]公式中a1空白表示步骤(5)中磷酸盐缓冲液的吸光度，a1样品表示步骤(5)中样品溶液的吸光度；m表示染料的分子质量，其中番红染料的分子量为350.85；[0061](b)取步骤(4)中的各ph值的磷酸盐缓冲液1ml，各组加入200μl 1mg/l的橙黄染料，混合均匀孵育2h；随后并稀释10倍，通过紫外分光光度计在495nm下测定吸光度，记录吸光度值，记为a2空白；[0062]取步骤(4)中的肌原纤维蛋白样品1ml，各组加入200μl 1mg/l的橙黄染料，混合均匀孵育2h；8000rpm下离心5min，取上清液稀释10倍，通过紫外分光光度计在495nm下测定吸光度，记录吸光度值，记为a2样品，并通过公式计算染料结合量。[0063][0064]公式中a2空白表示步骤(5)中磷酸盐缓冲液的吸光度，a2样品表示步骤(5)中样品溶液的吸光度；m表示染料的分子质量，其中橙黄染料的分子量为452.37；[0065](6)经测定，如图3所示，蛋白与染料结合量随ph变化显示不同结合量。随ph值的增加，蛋白结合的番红染料(so)逐渐增加(图3a)，而蛋白结合的橙黄染料(og)逐渐减小(图3b)。根据番红与橙黄染料的结合量对比可以判断肌原纤维蛋白表面电荷的电负性。当ph≤5时，蛋白结合更多的正电染料番红，表明肌原纤维蛋白带净的负电荷。氧化后，蛋白结合番红的量显著下降，而结合橙黄的量增多表明氧化降低了肌原纤维蛋白表面净负电荷。而当ph≥5.5时，蛋白结合更多的负电染料橙黄，表明此时肌原纤维蛋白带净的正电荷。氧化后，蛋白结合橙黄的量上升，而结合番红的量下降，表明氧化增加了肌原纤维蛋白表面净正电荷。通过蛋白与两种带电染料结合量的变化可以直观的判断肌原纤维蛋白表面电荷的电负性，并且通过其结合量的变化得出氧化前后肌原纤维蛋白表面净电荷的变化，比传统方式更简单直观。[0066]图3a中的操作同实施例1步骤(3)～(5)中的操作，区别是将步骤(3)中的过氧化氢溶液替换为0.01m磷酸盐缓冲液(ph＝6.5)；[0067]图3b中的操作同实施例1步骤(3)～(5)中的操作，区别是将步骤(3)中的过氧化氢溶液替换为0.01m磷酸盐缓冲液(ph＝6.5)。[0068]实施例2：[0069]本发明包括鱼肉的清洗、去皮、肌原纤维蛋白的提取、肌原纤维氧化、氧化指标的表征、肌原纤维表面净电荷表征、数据处理等程序，具体生产工艺如下：[0070](1)鱼肉的预处理：将黑鱼用清水冲洗干净，选取背部鱼肉，经清洗、去皮后进行搅碎处理获得鱼糜；[0071](2)肌原纤维提取：首先配制浓度为0.01m磷酸盐缓冲液，其ph为6.5且含有0.1m nacl，然后加入步骤(1)得到的鱼糜(磷酸盐缓冲溶液与鱼糜的用量比为4ml：1g)，搅拌均匀后进行均质、4℃，8000rpm离心15min，通过离心去除上清液，除去水溶性蛋白；得到的沉淀物再次加入磷酸盐缓冲溶液进行均质(沉淀物与磷酸盐缓冲溶液的用量关系为1g：4ml)、4℃，8000rpm离心15min，去除上清液，收集沉淀物，如此重复3次后，在得到的沉淀物中再加入磷酸盐缓冲溶液进行均质，均质后经过滤得到滤液进行4℃，8000rpm离心15min，最终得到的沉淀即为肌原纤维。[0072](3)肌原纤维氧化：在步骤(2)制备的肌原纤维中加入磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲溶液与肌原纤维的用量比为4ml：1g)，得到悬浊液；然后加入过氧化氢溶液(浓度为20mm，且与悬浊液的用量比为1ml：1ml)和芬顿试剂(fecl3和抗坏血酸其浓度均为1mm，fecl3溶液与肌原纤维悬浊液的用量比为1ml：100ml；抗坏血酸溶液肌原纤维悬浊液的用量比为1ml：10ml)反应24h，反应完全后，将其4℃，8000rpm离心3min，所得沉淀物再用磷酸盐缓冲液洗涤3次，最终得到得沉淀为氧化后的肌原纤维，将氧化后的肌原纤维悬浮于磷酸盐缓冲液中，均质得到肌原纤维悬浊液，备用。[0073](4)肌原纤维蛋白样品处理：将氧化后ph分别为4.5与6.5的肌原纤维悬浮液用不同的盐浓度处理，混合均匀。各组氯化钠的浓度分别为0mm、25mm、50mm、75mm、100mm。[0074](5)染料结合量的表征：[0075](a)取步骤(4)中的各ph值的磷酸盐缓冲液1ml，各组加入200μl 1mg/l的番红染料，混合均匀孵育2h；随后并稀释10倍，通过紫外分光光度计在520nm下测定吸光度，记录吸光度值，记为a1空白；[0076]取步骤(4)中的肌原纤维蛋白样品1ml，各组加入200μl 1mg/l的番红染料，混合均匀孵育2h；8000rpm下离心5min，取上清液稀释10倍，通过紫外分光光度计在520nm下测定吸光度，记录吸光度值，记为a1样品，并通过公式计算染料结合量。[0077][0078]公式中a1空白表示步骤(5)中磷酸盐缓冲液的吸光度，a1样品表示步骤(5)中样品溶液的吸光度；m表示染料的分子质量，其中番红染料的分子量为350.85；[0079](b)取步骤(4)中的各ph值的磷酸盐缓冲液1ml，各组加入200μl 1mg/l的橙黄染料，混合均匀孵育2h；随后并稀释10倍，通过紫外分光光度计在495nm下测定吸光度，记录吸光度值，记为a2空白；[0080]取步骤(4)中的肌原纤维蛋白样品1ml，各组加入200μl 1mg/l的橙黄染料，混合均匀孵育2h；8000rpm下离心5min，取上清液稀释10倍，通过紫外分光光度计在495nm下测定吸光度，记录吸光度值，记为a2样品，并通过公式计算染料结合量。[0081][0082]公式中a2空白表示步骤(5)中磷酸盐缓冲液的吸光度，a2样品表示步骤(5)中样品溶液的吸光度；m表示染料的分子质量，其中橙黄染料的分子量为452.37；[0083](7)实验结果显示：图4显示了不同盐浓度处理对肌原纤维蛋白染料结合量的影响，当ph为4.5时(图4a)，肌原纤维蛋白结合更多的橙黄染料(带负电)，表明此时肌原纤维蛋白表面净电荷为正。盐浓度增加会屏蔽电荷，从而减弱静电相互作用。随着盐浓度的增加，橙黄的结合量降低，表明橙黄染料与肌原纤维蛋白结合的灵敏性高。同样的，当ph为6.5时(图4b)，肌原纤维蛋白结合更多的番红染料(带正电)，表明此时肌原纤维蛋白表面净电荷为负。随着盐浓度的增加，番红的结合量降低，表明番红染料与肌原纤维蛋白结合的灵敏性高。当盐浓度改变时，氧化前后肌原纤维蛋白结合量的趋势不变，表明染料结合法在不同盐浓度条件下较稳定。综上所述，染料结合法表征肌原纤维表面净电荷具有稳定且灵敏性高等特点。[0084]图4a中的操作同实施例2步骤(3)～(5)中的操作，区别是将步骤(3)中的过氧化氢溶液替换为0.01m磷酸盐缓冲液(ph＝6.5)；[0085]图4b中的操作同实施例2步骤(3)～(5)中的操作，区别是将步骤(3)中的过氧化氢溶液替换为0.01m磷酸盐缓冲液(ph＝6.5)；[0086]说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。









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