高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌培养基、制备方法及应用与流程 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌培养基、制备方法及应用。背景技术：2.多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida，pm)是一种革兰氏阴性兼性厌氧菌，能够广泛感染哺乳动物、鸟类和爬行动物，造成多种疾病的发生。其中禽霍乱是由禽多杀性巴氏杆菌引起的禽类的传染病之一，给全球家禽业造成了重大的经济损失，其中的荚膜血清a型(a:1、a:3、a:4)是引起禽霍乱的主要血清型。3.现有研究表明病原菌对常用药物敏感性降低，药物治疗愈加困难。目前对禽霍乱的重要预防措施是接种疫苗。接种疫苗能够明显降低禽类发生疾病的比例，预防疾病的发生。在疫苗制备过程中，如何提高菌体密度是提高疫苗产量和降低成本的关键因素。4.目前禽多杀性巴氏杆菌的培养大部分采用tsb和马丁肉汤，也有商品化的专用疫苗培养基，收获的活菌数峰值在1×1010cfu/ml左右，增菌效果以及制备的疫苗的免疫效果较差，使用马丁肉汤还需额外添加血清，培养成本高。5.cn110643522a中公开了一种禽多杀性巴氏杆菌的培养基、培养方法及其应用，虽然使用该发明中的培养基制备得到的菌体密度值在5h可达到2.0～2.5×1010cfu/ml，但是通过该培养基制备的免疫疫苗的保护率只有83.3％。技术实现要素：6.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌培养基、制备方法及应用。7.本发明所采取的技术方案是：8.第一个方面，本发明提供一种高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌培养基，包括：细菌学蛋白胨8～13g/l、促生长肽3～8g/l、酵母粉18～23g/l、葡萄糖2～7g/l、氯化钠4～9g/l、磷酸氢二钾1～5g/l，余量为水；其中，所述促生长肽的制备方法为：以豆粕为原料，蒸煮后加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为：温度为50～60℃，酶解ph值为9.0～11.0，酶解时间为6～8h，酶的质量百分比用量为0.9～1.1％，豆粕浓度4.0～5.0g/100ml，经灭酶、离心、干燥后得到。9.在一些实例中，所述高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌培养基包括：细菌学蛋白胨10g/l，促生长肽5.95g/l，酵母粉21.04g/l，葡萄糖3.95g/l，氯化钠7g/l，磷酸氢二钾2g/l，余量为水。10.第二个方面，本发明提供第一个方面所述组成的高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌培养基的制备方法，包括以下步骤：11.1)按照配方量将细菌学蛋白胨、促生长肽、酵母粉、葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾用水溶解，得到混合液；12.2)然后调节该混合液的ph值至7.2～7.4，高温灭菌冷却后即得到所述高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌的培养基；13.在一些实例中，所述高温灭菌的温度为115～121℃，时间为15～30min。14.第三个方面，本发明提供一种禽多杀性巴氏杆菌的高密度培养方法，包括以下步骤：15.1)一级种子的制备：将禽多杀性巴氏杆菌接种到tsa平板中培养，制得禽多杀性巴氏杆菌的一级种子；16.2)二级种子的制备：挑选出圆形、半透明、光滑、湿润、完整的禽多杀性巴氏杆菌一级种子单菌落接种于培养基中进行培养直到od600值达到1.2，制得禽多杀性巴氏杆菌的二级种子；17.3)发酵培养：在发酵罐中放入培养基，接种禽多杀性巴氏杆菌二级种子进行培养，制得禽多杀性巴氏杆菌的发酵培养物；18.其中，所述培养基为第一个方面所述高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌培养基。19.在一些实例中，所述禽多杀性巴氏杆菌一级种子的制备温度为36～38℃，制备时间为16～30h。20.在一些实例中，所述禽多杀性巴氏杆菌二级种子的制备温度为36～38℃，制备时间为7～9h。21.在一些实例中，所述发酵培养的条件为：发酵起始转速为90～110rpm/min，每分钟的空气通气量为发酵液体积的0.3～0.4倍；发酵2～4h后，发酵转速为240～260rpm/min，每分钟的空气通气量为发酵液体积的0.9～1.1倍。22.在一些实例中，所述发酵培养中禽多杀性巴氏杆菌二级种子的接种体积为以培养基体积计的2～4％。23.在一些实例中，所述发酵培养的温度为36～38℃，发酵培养时间为6～8h。24.上述特征在不相冲突的情况下，可以任意组合。25.本发明的有益效果是：26.1)使用本发明的高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基有利于细菌的生长繁殖，培养所需时间短、菌体密度高，更适合用于禽多杀性巴氏杆菌的培养；27.2)本发明的高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基制备方法简单、原料易得、成本低，适合工业化大规模生产；28.3)本发明提供的发酵参数，可以显著提高发酵速度和发酵液中禽多杀性巴氏杆菌菌体密度，最终可达到1.84×1010cfu/ml；29.4)本发明提供的培养基制备的疫苗保护效率高达100％，而且抗原活性优秀，为禽多杀性巴氏杆菌疫苗的生产奠定了基础。附图说明30.图1为培养基中各组分不同添加量摇瓶发酵的单因素试验结果；31.图2为培养基中添加促生长肽和大豆胨的生长曲线对比；32.图3为本发明提出的高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基中各成分交互作用的响应面图；33.图4为本发明所述的高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基与tsb培养基的生长曲线对比。具体实施方式34.下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。35.方便比较起见，以下实例中使用的促生长肽制备方法如下：36.以豆粕为原料，将豆粕进行粉碎过80目筛后进行收集，加入水，使得豆粕：水＝1:30(m:v)，在室温下进行搅拌15min，经蒸煮30min后，冷却至55℃后，在蒸煮液中加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为：温度为50～60℃，酶解ph值为9.0～11.0，酶解时间为6～8h，酶的质量百分比用量为0.9～1.1％，豆粕浓度4.0～5.0g/100ml，酶解完成后进行灭酶操作(水浴条件：100℃，8min)，将酶解液冷却至室温后，进行离心处理(4℃，6000r/min，5min)，离心完成后取上清液调节ph到7，最后将离心液脱盐、干燥后得到促生长肽。使用的碱性蛋白酶的酶活约6000u/g。37.实施例138.培养摇瓶发酵单因素试验结果对比，包括以下步骤：39.高抗原活性的禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基中的各组分最适添加量须采用单因素试验方法确定，包括对细菌学蛋白胨、促生长肽、酵母粉、葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾六个因素分别采用单因素试验。40.(1)细菌学蛋白胨添加量分别为0g/l、5g/l、7.5g/l、10g/l、12.5g/l、15g/l，其他组分添加量不变，使用纯化水溶解。41.(2)促生长肽添加量分别为0g/l、2.5g/l、5g/l、7.5g/l、10g/l、12.5g/l，其他组分添加量不变，使用纯化水溶解。42.(3)酵母粉添加量分别为0g/l、5g/l、10g/l、12.5g/l、15g/l、17.5g/l，其他组分添加量不变，使用纯化水溶解。43.(4)葡萄糖添加量分别为0g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l，其他组分添加量不变，使用纯化水溶解。44.(5)氯化钠添加量分别为0g/l、3g/l、5g/l、7g/l、9g/l、11g/l，其他组分添加量不变，使用纯化水溶解。45.(6)磷酸氢二钾添加量分别为0g/l、1g/l、2g/l、3g/l、4g/l，其他组分添加量不变，使用纯化水溶解。46.上述溶液分别取50ml使用1mol/l碳酸钠溶液调节ph至7.2～7.4，分别装入250ml锥形瓶中121℃高温高压灭菌15min，以3％(v/v)的接种量接种禽多杀性巴氏杆菌二级种子，在37℃下于150r/min摇床培养，利用酶标仪测量菌液od600的最大值进行比较，结果如图1所示。47.分析结果表明：禽多杀性巴氏杆菌的菌体密度分别在细菌学蛋白胨、促生长肽、酵母粉、葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾的添加量为10g/l、5g/l、15g/l、3g/l、7g/l、2g/l时达到最高。48.实施例249.按照实施例1中单因素试验的各组分最佳添加量配制培养基a，将培养基a中的促生长肽替换成大豆胨，配方其他组分不变配制成培养基b，进行对比试验，比较促生长肽和大豆胨对禽多杀性巴氏杆菌的增菌效果。本实施例采用实施例1中的发酵培养方法培养禽多杀性巴氏杆菌并绘制生长曲线，结果如图2所示。50.根据图2可以得出，培养基中添加促生长肽相较于大豆胨对禽多杀性巴氏杆菌的增菌效果明显更好，因此可以看出促生长肽在增菌培养基中起到了关键作用，应采用促生长肽进行后续的培养基优化试验。51.实施例352.本实施例是对实施例1的进一步优化处理，具体的为：在单因素试验筛选的基础上，还需进行plackett-burman(pb)试验设计，且步骤为，选择细菌学蛋白胨a、促生长肽b、酵母粉c、葡萄糖d、氯化钠e、磷酸氢二钾f作为影响因素，以菌体密度(od600)为评价指标，使用design-expert软件设计pb试验，筛选出能显著影响禽多杀性巴氏杆菌生长的因素，各因素水平设计见表1，pb试验的组合见表2。依照模型所设计出的试验方案，在实施例1中的培养条件下，测定菌液的od600值，对数据进行分析，结果如表3所示。53.表1 pb试验因素和水平表[0054][0055]表2 pb试验设计及结果[0056][0057]表3 pb试验设计结果分析[0058][0059]由分析结果可知，该模型有意义(f＝6.28，p《0.05)。其中的促生长肽、酵母粉、葡萄糖对禽多杀性巴氏杆菌的生长具有显著影响(p《0.05)，且系数估计都为正值说明都为正相关。故选择酵母粉、促生长肽、葡萄糖这3个因素进行后续的最陡爬坡试验和响应面试验。其余因素不显著(p》0.05)，在后续试验中保持其原有水平。[0060]实施例4[0061]本实施例是对实施例2的进一步补充优化，具体的为：在pb试验的基础上，还需进行最陡爬坡试验设计，且步骤为，根据pb试验结果可知，促生长肽、酵母粉和葡萄糖的系数估计都为正值，说明其添加量与禽多杀性巴氏杆菌的生长呈正相关，故爬坡方向均为上，据此设计的最陡爬坡试验与试验结果见表4。[0062]表4最陡爬坡试验设计及结果[0063][0064]由分析结果可知，编号4组合所得的菌体响应值最高，因此选择编号4的添加量作为后续试验的中心点进行响应面试验。[0065]实施例5[0066]本实施例是对实施例3的进一步补充优化，具体的为：在最陡爬坡试验的基础上，还需进行box-behnken试验设计(bbd)，且步骤为，本试验根据pb试验得到的显著影响因素，再以最陡爬坡试验的结果确定响应面试验的中心点，选择促生长肽a、酵母粉b、葡萄糖c作为影响因素，以菌体密度(od600)为评价指标，应用design-expert软件设计响应面分析试验，各因素水平见表5，设计方案及结果如表6所示。[0067]表5 bbd因素及水平表[0068][0069]表6响应面设计方案及结果[0070][0071]分析所得响应值(od600)与促生长肽(a)、酵母粉(b)和葡萄糖(c)的关系如多元二次回归方程所示：[0072]od600＝1.33-0.005825a+0.031b-0.050c+0.002225ab+0.012ac+0.024bc-0.096a2-0.083b2-0.079c2。[0073]响应面拟合回归方程的方差分析结果见表7。由分析结果可知：模型的f值为89.59，差异极显著(p《0.01)，并且失拟项的p》0.05，说明拟合程度极好。对于单个因素来说，酵母粉(b)、葡萄糖(c)对菌体生长的影响均极显著(p《0.01)，各因素的影响程度为c》b》a。对于两个因素间的交互作用来说，酵母粉和葡萄糖的交互作用对菌体的生长影响极显著(p《0.01)，其他的则为不显著(p》0.05)。对于模型的二次项来说，这三个因素的作用均极显著(p《0.01)。[0074]表7响应面拟合回归方程的方差分析[0075][0076]利用design-expert软件，绘制响应面三维图，参考附图3，响应面图均为开口向下，因此响应值应存在最大值。通过对禽多杀性巴氏杆菌生长回归方程求一阶偏导数可预测最佳值，预测的最佳条件为：促生长肽5.95g/l，酵母粉21.04g/l，葡萄糖3.95g/l。在此条件下模型预测的od600为1.3416，在此条件下进行三次平行试验，所测得结果为1.334，与预测值相似，说明方程拟合良好。[0077]实施例6[0078]本实施例是对实施例4的结果进一步证明，具体的为：[0079](1)按照配比配置培养基：细菌学蛋白胨10g/l，促生长肽5.95g/l，酵母粉21.04g/l，葡萄糖3.95g/l，氯化钠7g/l，磷酸氢二钾2g/l，余量为纯化水。使用1mol/l碳酸钠调节ph至7.2～7.4。[0080](2)配置tsb培养基作为对照。[0081](3)在100ml锥形瓶中分别加入20ml(1)(2)两种培养基，高温高压灭菌冷却后，按3％(v/v)的接种量接种禽多杀性巴氏杆菌二级种子，摇匀后取200μl加入到96孔板中，每种培养基3个平行；37℃恒温培养，每小时测一次od600值，连续震荡培养10h以上，绘制生长曲线，参考图4。[0082](4)在发酵罐中分别按照60％(v/v)加入(1)(2)两种培养基，高温高压灭菌后，将培养基温度降至37℃，以培养基体积计，按3％(v/v)的接种量接种禽多杀性巴氏杆菌二级种子，在37℃培养9h，每小时取样测od600、ph值，稀释涂布法计活菌数。结果见表8。[0083]分析结果表明：观察生长曲线，禽多杀性巴氏杆菌在tsb培养基中9h左右生长到平台期，od600最高为1.184，在高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基中7h左右生长到平台期，od600最高为1.338。菌体在高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基中的生长速度和增菌效果均优于tsb培养基。观察发酵数据，发现高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基不仅在到达平台期的时间要早于tsb培养基，而且在菌体密度上也要高于tsb培养基。发酵时间为6h，活菌数达到1.84×1010cfu/ml，对比tsb培养基的增菌效果提升了2.7倍。[0084]表8高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基与tsb培养基发酵结果对比[0085][0086]实施例7[0087]本实施例是对采用高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基制备的疫苗进行免疫效果评估以及对不同时间段发酵产物的抗原活性测定，具体的为：[0088](1)利用上述禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基发酵培养菌株，加铝胶佐剂制备成灭活疫苗，然后使用该疫苗进行动物免疫保护试验。选取适龄balb/c小鼠，随机分成4组(每组10只)：疫苗培养基组、商品化灭活疫苗组、pbs攻毒组、pbs空白组。[0089](2)对疫苗组和pbs攻毒组进行两次免疫，在二次免疫后14d后取血清，测定血清抗体效价备用。二次免疫后14d对疫苗组和攻毒组小鼠注射致死剂量4ld50活菌(2.4×103cfu)，观察并记录7d内小鼠出现的临床症状和死亡情况。[0090](3)在利用上述高抗原活性禽多杀性巴氏杆菌疫苗培养基发酵菌株的不同时间段取样，离心重悬后，进行超声破碎，调至10μg/ml后利用elisa法测定抗原活性。[0091]免疫后的攻毒保护率如表9所示，可以看出采用本发明的疫苗培养基培养禽多杀性巴氏杆菌制成的疫苗，其免疫后的攻毒保护率和血清效价均优于市售疫苗，并且在免疫过程中对免疫动物无不良反应，该疫苗能够作为该种疫苗生产的基础。[0092]测得不同时间段发酵产物效价结果如表10所示，结果显示在对数生长期时，菌体抗原蛋白的免疫原性相对较弱，到稳定期后，菌体抗原蛋白的免疫原性达到最高，且在后续阶段基本保持稳定。因此，在利用该培养基制备禽多杀性巴氏杆菌疫苗时，在达到稳定期即可收菌，此时的免疫原性和菌体密度都达到顶峰，制备的疫苗效果好，成本低。[0093]表9疫苗保护试验结果[0094][0095]表10不同时间段菌体抗原蛋白免疫原性的测定结果[0096][0097]以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。









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