一种多肽合成中用于树脂切割的新型鸡尾酒试剂 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术一种多肽合成中用于树脂切割的新型鸡尾酒试剂所属技术领域：1.本发明涉及一种多肽合成中用于树脂切割的新型鸡尾酒试剂，具体来讲：就是开发了一种新型配方的鸡尾酒试剂，应用此试剂可在fmoc(芴基甲氧基羰基)固相合成法中在将侧链带有保护基团的多肽从wang树脂上完全切除并脱保护的同时，选择性地保留多肽上侧链的酸性敏感保护基团。背景技术：2.鸡尾酒试剂(cleavage cocktails)是用于在肽合成过程中从固体支持物(通常是树脂)上切下多肽的混合试剂。鉴于固相多肽合成中涉及树脂及其肽链的氨基酸序列和保护基组合变化繁多，化学性质迥异。单纯运用三氟乙酸(tfa)进行切割通常会导致一些期望保留的支链保护基的脱除或氨基酸残基的副反应。为了克服上述的合成困难，形形色色的鸡尾酒试剂配方被研发出来。常用的鸡尾酒试剂包括试剂b、试剂k、试剂l、试剂r等。3.试剂b是tfa、水、苯酚和三异丙基硅烷(tips)(优选体积配比88:5:5:2)的混合试剂。tfa是主要的切割剂。加入tips作为清除剂以防止副反应。试剂b通常用于从含有酸不稳定保护基团(如三苯甲基)的树脂载体上切割多肽。4.试剂k是tfa、水、苯酚、苯硫醚和乙二硫醇(edt)(优选体积配比82.5:5:5:5:2.5)的混合试剂。tfa是主要的切割剂。加入苯硫醚和edt以提高切割效率并防止副反应。试剂k特别适合用于pal或bal树脂上含有色氨酸的肽链切割，对于其他含有半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸的多肽均适用。5.试剂l是tfa、水、tips和二硫苏糖醇(dtt)(优选体积配比88:5:2:5)的混合试剂。tfa是主要的切割剂。dtt取代了刺激性清除剂edt和硫代苯甲醚。此外，与edt不同，dtt不易与4-苯甲酰苯丙氨酸(bpa)的二苯甲酮部分发生反应，这使得试剂l成为含bpa多肽的首选裂解混合物。6.试剂r是tfa、苯硫醚、edt和苯甲醚(优选体积配比90:5:3:2)的混合试剂。试剂r特别适用于切割和脱保护含有用磺酰基保护的精氨酸的多肽。该试剂也推荐用于在pal或bal树脂上制备的含色氨酸多肽，因为它最大限度地避免了多肽在色氨酸残基上与树脂linker的再次连接。7.除了这些鸡尾酒试剂外，其他鸡尾酒试剂还包括试剂t、试剂j和试剂h等，再次不一一赘述。8.综上所述，鸡尾酒试剂的选择取决于树脂类型、多肽序列和多肽合成中使用的保护基团种类，研发的目标是使用合适的鸡尾酒试剂来实现有效的切割并最大限度地减少副反应。值得注意的是，几乎常用的所有鸡尾酒试剂的主要成分都采用了高浓度的tfa。在一些应用于环肽合成的直链肽制备中，经常希望在完全切割树脂的情况下，依然保留多肽侧链酸性敏感基团。那么显而易见地，上述常规的鸡尾酒试剂配方均不适用。其过高的tfa浓度足以使所有保护基脱保护，造成多肽合成的策略设计受到极大限制与掣肘。目前已知的解决方案是使用特种类型的树脂支撑物，主要包括三苯甲基氯-树脂或tcp树脂。上述两种树脂均可在低浓度tfa(1-2％)条件下被切割，但它们在实际运用也展现出一些缺陷：三苯甲基氯-树脂具有高反应性，需要小心处理和储存，以避免不必要的副反应和树脂降解；高载量时常导致难以从树脂中去除杂质，会导致最终产品的产量和纯度降低；tcp树脂，特别是预载氨基酸的tcp树脂，相比其他同类树脂昂贵得多；对酸性的高敏感度也让此类树脂的处理需要加倍小心。另一方面，最为常用的wang树脂虽然性能优良，价格低廉，化学稳定性高、低膨胀率且切割操作简单，但它的切割要求高浓度tfa或含有高浓度tfa的鸡尾酒试剂。因此，开发一种适用于wang树脂切割的含低浓度tfa的新型鸡尾酒试剂成为多肽合成中最具有吸引力目标之一。技术实现要素：9.发明首次提出了多肽合成中用于从wang树脂上化学选择性切除带有敏感保护基团多肽的新型鸡尾酒试剂。所述敏感保护基团是指常见对酸耐受度低的多肽侧链保护基团，包括叔丁氧基羰基(boc)、叔丁基(tbu)和三苯甲基(trt)等。本发明涉及的新型鸡尾酒试剂是由tfa、三聚氰酸、水和tips(优选体积配比1:88:10:1)混合而成，在此命名为“鸡尾酒试剂c”。其中，三聚氰酸是主要切割剂。三聚氰酸包含有多个互变异构体，其中三酮形式的结构式为三酚形式的结构式为微量的tfa保证鸡尾酒试剂的总体酸性，有利于树脂上酯交换的发生，但又不至于过酸影响到对酸性敏感保护基。一定量水的存在使得三聚氰酸部分转化为三酚形式，并促进新形成酯中间体的水解。tips作为清除剂防止副反应的发生。本发明提出的新型鸡尾酒试剂的树脂切割机理可能是：首先三酮形式的三聚氰酸在水中部分转化为三酚形式；在tfa酸催化下，与连接多肽的树脂发生可逆的酯交换反应，生成多肽的三聚氰酸酯；多肽的三聚氰酸酯在稀酸水溶液中不稳定，迅速水解为多肽和三聚氰酸。由于三聚氰酸的酸性极微弱，因此不会影响多肽链上的对酸敏感侧链保护基。其过程图示为：[0010][0011]其中aa1、aa2、…aan为多肽上的氨基酸残基，为wang树脂。[0012]本发明提出的鸡尾酒试剂c的配制及其进行树脂切割获得多肽包括以下基本步骤：[0013]1)按照优选体积配比1:88:10:1将tfa、三聚氰酸、水和tips配制成鸡尾酒试剂c。组氨酸(trt)-丙氨酸-oh的wang树脂。[0031]按照优选体积配比88:5:5:2将tfa、水、苯酚和tips配制10ml鸡尾酒试剂b。将100mg载有多肽赖氨酸(boc)-天冬氨酸(tbu)-组氨酸(trt)-丙氨酸的树脂与鸡尾酒试剂b充分震荡混合，并反应2小时。过滤并用少许额外的鸡尾酒试剂b洗涤树脂。将合并的滤液冷却至4℃并加入冰乙醚(合并滤液体积的10倍以上)以沉淀粗产品多肽。[0032]经hplc分离纯化及esi质谱验证(m/z[m+h+]＝470.2321，保留时间＝17.40min，纯度96.5％)，得到的产物为完全脱保护的多肽nh2-赖氨酸-天冬氨酸-组氨酸-丙氨酸-oh。[0033]实施例2，应用新型鸡尾酒试剂c切割预载多肽nh2-赖氨酸(boc)-天冬氨酸(tbu)-组氨酸(trt)-丙氨酸-oh的wang树脂。[0034]按照优选体积配比1:88:10:1将tfa、三聚氰酸、水和tips配制10ml鸡尾酒试剂c。将100mg载有多肽赖氨酸(boc)-天冬氨酸(tbu)-组氨酸(trt)-丙氨酸的树脂与鸡尾酒试剂c充分震荡混合，并反应2小时。过滤并用少许额外的鸡尾酒试剂c洗涤树脂。将合并的滤液冷却至4℃并加入冰乙醚(合并滤液体积的10倍以上)以沉淀粗产品多肽。[0035]经hplc分离及esi质谱验证(m/z[m+h+]＝868.4569，保留时间＝25.01min，纯度97.2％)，得到的产物为带有完整侧链保护基的多肽nh2-赖氨酸(boc)-天冬氨酸(tbu)-组氨酸(trt)-丙氨酸-oh。[0036]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均包括在本发明的保护范围和公开范围之内。









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