降解磺胺甲恶唑的脱氮副球菌及其应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及降解磺胺甲恶唑的脱氮副球菌及其应用，属于合成生物学领域。背景技术：2.磺胺类药物是一类广谱抗菌药物，在兽医临床和畜牧业中预防和治疗传染病。然而，抗生素的滥用已经导致了越来越多的环境问题。它们在环境中的累积残留物会减少土壤真菌的数量，改变微生物群落的结构，降低土壤肥力。在进入水体时，它们会危及水生动物，破坏生态系统的稳定，影响水产养殖业的健康发展。此外，它们难以降解，低浓度就有很高的生态毒性，并引起耐药性的扩散。因此，磺胺类药物污染对生态环境和人类健康构成了巨大的威胁。因此，高效去除磺胺类药物并降低其毒性是确保再生水安全使用的必然要求。用于治疗传染病的磺胺甲恶唑是最经常使用的磺胺类抗生素之一、磺胺甲恶唑及其代谢物通过尿液或粪便排泄到环境中。因此，磺胺甲恶唑在环境中的主要来源包括污水、医院、水产养殖场、制药业和地表水。研究表明，磺胺甲恶唑可能具有直接的神经毒性，与人类的肠道传输改变和神经精神并发症等副作用直接相关，危及人类健康。此外，由于其急性毒性，它对水生生物构成潜在的生态风险。因此，提高磺胺甲恶唑的降解效果是目前备受人们关注的热点。3.为了进一步提高降解效果，可以使用代谢工程来改造磺胺甲恶唑降解菌株，提高其降解效果。然而目前筛选出的磺胺甲恶唑降解菌株，由于缺乏代谢调控工具和方法，以及降解机制和关键基因不明确，很难进行工程化。因此使用可遗传的环境微生物作为代谢工程的底盘细胞是加强磺胺甲恶唑降解和环境治理的一个可行方法。为了实现这一目的，首先，我们要有一个清晰的磺胺甲恶唑降解代谢途径。最近，ricken等人分离出一株微杆菌br1，能够以磺胺甲恶唑作为唯一碳源进行代谢生长。这种细菌有一个执行降解功能的sad基因簇，由三个功能基因组成，两个单氧酶基因(sada，sadb)和一个fmn还原酶基因(sadc)。通过sada和sadb酶的作用，磺胺甲恶唑在fmnh2的协助下最终产生了3-氨基-5-甲基异恶唑，偏苯三酚和so2(图1)。这是迄今为止唯一在生化和分子生物学水平上得到验证的文献报告，为本次研究代谢工程以加强磺胺甲恶唑的降解提供了理论基础。另外，实验室从污水中分离的脱氮副球菌，可以利用不同碳源，适应极端环境能力强；本身也具有脱氮的功能，对有机污染物有很高的降解能力；且操作系统较为成熟，遗传稳定。因此通过代谢改造以脱氮副球菌为底盘细胞构建工程菌，可以提高环境微生物降解磺胺类污染物的能力，同时也为构建人工降解菌群奠定基础。技术实现要素：4.本发明提供了脱氮副球菌降解磺胺甲恶唑菌株，所述降解基因经脱氮副球菌内源性启动子优化后，基因的转录水平提升，脱氮副球菌降解磺胺甲恶唑的效率增强。5.在一种实施方式中，所述脱氮副球菌以seq id no.9～12任一所示的启动子表达磺胺甲恶唑降解途径的相关基因。6.在一种实施方式中，所述磺胺甲恶唑降解途径的相关基因包括但不限于sada、sadb、sadc、ssue、rutf、coga、sutr、psuk中的一种或多种。7.在一种实施方式中，所述脱氮副球菌表达了sada、sadb基因，并以seq id no.9～12任一所示启动子调控sadc、ssue、rutf、coga、sutr或psuk的表达。8.在一种实施方式中，降解基因sada和sadb来源于微杆菌br1基因组，fmn还原酶基因fmnr(即sadc来源于微杆菌br1基因组，ssue和rutf来源于大肠杆菌mg1655基因组，coga来源于谷氨酸棒状杆菌atcc 13032基因组，sutr来源于枯草芽孢杆菌srcm102756基因组，psuk来源于普氏假单胞菌kt2440基因组)，但不限于以上来源。9.在一种实施方式中，所述sada基因具有seq id no.1所示的核苷酸序列；所述sadb基因具有seq id no.2所示的核苷酸序列；所述sadc基因具有seq id no.3所示的核苷酸序列；所述ssue基因具有seq id no.4所示的核苷酸序列；所述rutf基因具有seq id no.5所示的核苷酸序列；所述coga基因具有seq id no.6所示的核苷酸序列；所述sutr基因具有seq id no.7所示的核苷酸序列；所述psuk基因具有seq id no.8所示的核苷酸序列。10.在一种实施方式中，所述脱氮副球菌为脱氮副球菌(paracoccus denitrificans)dytn-1，于2016年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2016741，已公开于论文《脱氮副球菌dytn-1高效去除污水中的总氮》。11.在一种实施方式中，以质粒piab4为表达载体表达所述基因。12.在一种实施方式中，所述质粒piab4是以质粒pind4为骨架，以pglna启动子调控sada和sadb基因的起始转录。13.在一种实施方式中，所述脱氮副球菌以质粒piab4为表达载体，用启动子prho调控sadc基因的表达；用启动子pcs调控coga基因或sutr基因的表达，用启动子prho调控psuk基因或rutf基因的表达，用启动子pnir调控psuk基因或ssue基因的表达。14.本发明还提供了含有所述脱氮副球菌的微生物制剂。15.本发明还提供了启动子在促进脱氮副球菌中蛋白表达方面的应用，所述启动子具有如seq id no.9，seq id no.10，seq id no.11，和seq id no.12所示的dna序列，并能够启动目的蛋白在脱氮副球菌中的转录。16.本发明还提供了所述脱氮副球菌在降解磺胺甲恶唑中的应用。17.在一种实施方式中，所述应用包括但不限于将所述脱氮副球菌在含磺胺甲恶唑的环境中培养。18.本发明还提供所述脱氮副球菌在降解磺胺类污染物中的应用。19.有益效果：20.(1)本发明提供了一种磺胺甲恶唑降解思路，通过以环境微生物为底盘细胞，运用合成生物技术和代谢工程在新的微生物中构造磺胺甲恶唑降解途径，该技术方案为提高微生物对磺胺甲恶唑的降解能力及构建人工降解菌群奠定基础。21.(2)本发明提供了脱氮副球菌dytn-1内源启动子，该启动子在脱氮副球菌有较好的表达，对表达强度高达2～25.3倍。该启动子作为基因表达调控元件，用于精细调控降解基因的表达，精细调控代谢通路，具有广泛的应用前景。附图说明22.图1为磺胺甲恶唑降解途径。23.图2为内源性启动子调控不同基因的强度示意图。24.图3为重组表达载体pind4系列结构示意图。25.图4为重组表达载体piab4系列结构示意图。26.图5为重组表达载体pet-28a系列结构示意图。27.图6为不同fmn还原酶酶活。28.图7为重组菌株对smx的降解效果。29.图8为重组菌株的硝化和反硝化作用。具体实施方式30.限制性内切酶和dna聚合酶分别购自赛默飞和takara公司。高效液相色谱(agilent 1260ii、santa clara、ca、usa)用于检测磺胺甲恶唑。大肠杆菌jm109用于分子克隆，大肠杆菌s17-1λpir作为辅助菌株用于脱氮副球菌dytn-1接合转移，脱氮副球菌dytn-1用于蛋白表达。31.实施例1基因重组载体的构建32.基因sada/b/c由安升达生物科技有限公司合成。其它基因模板采用上海生工细菌基因组试剂盒提取大肠杆菌mg1655(基因组dna的genbank登录号：:nc_000913.3)，谷氨酸棒状杆菌atcc 13032(基因组dna的genbank登录号：cp025533.1)，枯草芽孢杆菌srcm102756(基因组dna的genbank登录号：cp028218.1)，普氏假单胞菌kt2440(基因组dna的genbank登录号：lt799039.1)，及脱氮副球菌dytn-1的基因组dna。本发明所有引物由安升达生物科技有限公司合成，经dsl方法纯化，使用时稀释到10μm。pcr使用primestar max dna聚合酶，配制的反应体系为50μl。33.表1反应体系[0034][0035]表2反应条件[0036][0037]可根据以上pcr反应条件获得sada，sadb和fmnr(即sadc，ssue，rutf，coga，sutr，和psuk)及启动子pglna，prho，pcs，和pnir的dna片段，sada和sadb长度分别为1272，1200；sadc，ssue，rutf，coga，sutr，和psuk的长度分别为585，576，495，681，750，561，启动子片段长度分别为160，92，220，230。分别对上述片段进行测序，依次获得seq id no.1，seq id no.2，seq id no.3，seq id no.4，seq id no.5，seq id no.6，seq id no.7，seq id no.8，seq id no.9，seq id no.10，seq id no.11和seq id no.12所示dna序列。[0038]表3gibson组装酶反应混合体系[0039][0040][0041]以质粒pind4为骨架，将带有同源臂的线性化载体，启动子片段，分别与sfgfp或降解基因sada、sadb、sadc以1:3:3的比例(2.5μl)与酶反应体系(核酸外切酶，dna聚合酶，连接酶(7.5μl))混合成10μl体系，于50℃pcr反应1h。将gibson连接产物转化到含卡那霉素抗性(50mg/l)的平板上，37℃培养8～12h，挑单菌落pcr验证是否为阳性克隆。构建好的重组表达载体如图3所示：pind4-pglna-sfgfp，pind4-prho-sfgfp，pind4-pcs-sfgfp，pind4-pnir-sfgfp，pind4-pglna-sada，pind4-pcs-sada，pind4-pnir-sada，pind4-pglna-sadb，pind4-pcs-sadb，pind4-pnir-sadb，pind4-prho-sadc，pind4-pcs-sadc，pind4-pnir-sadc。[0042]重组表达载体piab4：以质粒pind4-pglna-sada为骨架，将线性化载体与pglna-sadb片段用以上方法构建得到质粒piab4，并用于后续表达载体的构建。[0043]以质粒为骨架piab4，将线性化载体与启动子片段，降解基因fmnr以相同的方法构建得到重组表达载体piab4-pp.den-fmnr(具体为图4所示：piab4-prho-sadc，piab4-pcs-sadc，piab4-pnir-sadc，piab4-prho-ssue，piab4-prho-ssue，piab4-pnir-ssue，piab4-prho-rutf，piab4-pcs-rutf，piab4-pnir-rutf，piab4-prho-coga，piab4-pcs-coga，piab4-pnir-coga，piab4-prho-sutr，piab4-pcs-sutr，piab4-pnir-sutr，piab4-prho-psuk，piab4-pcs-psuk，piab4-pnir-psuk)。[0044]以pet-28a为载体，将线性化载体与fmnr以相同的方法构建得到重组表达载体如图5所示：pet-28a-sadc，pet-28a-ssue，pet-28a-rutf，pet-28a-coga，pet-28a-sutr，pet-28a-psuk。[0045]表4引物列表[0046][0047][0048][0049][0050]实施例2脱氮副球菌接合转化[0051]将实施例1构建好的重组质粒，使用热击法分别转化至大肠杆菌s17-1λpir感受态细胞，在卡那霉素抗性(50mg/l)培养基上培养12h，挑取单菌落，摇菌鉴定阳性克隆。[0052]将含有重组质粒的大肠杆菌s17-1λpir作为供体菌株，将脱氮副球菌dytn-1作为受体菌株，分别接种在2支盛5ml lb培养基的试管中，37℃过夜培养。然后将供体细胞和受体细胞按照3：10的比例转移至同一试管中使试管内供、受体菌混匀，再将供、受体菌混合培养物置37℃保温30min。待供、受体菌混合培养物保温30min后，将这支试管剧烈振荡使供体菌和受体菌之间的性菌毛断开，从而中止基因的遣传转移。吸取0.1ml菌液涂布于相应的抗性平板培养两天，挑取单菌落，摇菌鉴定阳性克隆。[0053]实施例3脱氮副球菌关键酶的检测[0054]将实施例1构建好的pet-28a系列重组质粒，使用热击法分别转化至大肠杆菌bl21感受态细胞，在卡那霉素抗性(50mg/l)培养基上培养12h，挑取单菌落，摇菌鉴定阳性克隆。[0055]将含有重组质粒的大肠杆菌bl21，在37℃，250rpm下培养到od600＝0.8-0.9时加入0.2mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖。诱导后将温度降低到20℃，培养8小时，8000rpm离心10min，收集细胞并用pbs标准缓冲液重悬。重悬液经细胞超声处理，在8000rpm离心15分钟后收获上清液。最后，通过使用ni2+-nta柱对fmn还原酶进行纯化，用于酶活检测。[0056]以fmn，nadph(或nadh)为底物，在30℃下反应10分钟。通过biotek ht酶标仪(winooski,vt,usa)测量nadph(或nadh)的减少量来计算fmn还原酶的活性，吸光度为340nm。fmn还原酶活性定义为在30℃下，每分钟内每μmol酶对nadph(或nadh)的减少量。[0057]六种fmn还原酶活性如图6所示，coga、sadc、psuk、sutr、rutf和ssue的活性分别为0.44、0.53、0.7、0.86、1.58和1.92(u)。对于coga、sadc、psuk和sutr过表达的菌株，降解效率随着酶活性的增加而提高。然而，ssue和rutf具有高酶活性但实际降解效率不高，这可能是由于这两种基因转录水平过高(图7b)，使得蛋白质折叠错误，最终p.denitrificans dytn-1中的有效酶活总量较低。可见，smx的降解不仅高度依赖于酶的活性，而且还依赖于调控元件的特性。[0058]实施例4脱氮副球菌降解磺胺甲恶唑[0059]m9基本培养基配方为:nacl 0.5g/l，kh2po4 3.0g/l，na2hpo4 6.78g/l，1.0g/l nh4cl，cacl2 0.115g/l，mgso4 0.24g/l。[0060]将实施例2构建的重组脱氮副球菌及野生型菌株经过夜活化后，以2％的接种量接种至含100mg/l磺胺甲恶唑、4g/l甘油(按终浓度计)的m9培养基中(接种后的od600约0.08)，于30℃，150rpm震荡培养72h。每隔12h后取样，用甲醇进行稀释收集上清液，使用高效液相色谱(agilent 1260ii、santa clara、ca、usa)进行分析，配备ec-c18柱(4μm、4.6×150mm)。检测温度为35℃，在vwd检测器(agilent、santa clara、ca、usa)，265nm处检测磺胺甲恶唑。流动相为乙腈和0.2％乙酸(1:3)，流速为0.6ml/min。[0061]以野生型脱氮副球菌dytn-1作为对照，在光降解及误差范围内，对照组100mg/l磺胺甲恶唑降低了4.6％，而重组菌株可以将100mg/l磺胺甲恶唑降解至56mg/l(图7a)，说明可通过代谢改造环境微生物成功实现降解磺胺甲恶唑污染物的目的。[0062]本发明采用4个具有梯度调控强度的脱氮副球菌dytn-1的内源启动子(调控范围为2～25.3)，控制磺胺甲恶唑降解途径的表达。通过用不同启动子匹配磺胺甲恶唑降解途径基因，对磺胺甲恶唑降解途径基因fmn还原酶的表达水平和进行了优化，以提高脱氮副球菌dytn-1的磺胺甲恶唑降解效率。结果表明，磺胺甲恶唑降解效率得到明显提高(图7b)，其中不同fmn还原酶菌株的提高效果不同，具体表现为p.d-piab4-prho-sadc的降解效率为38.1％(11.3mg/l/od600)，p.d-piab4-pcs-coga为32.8％(15.2mg/l/od600)，p.d-piab4-prho-psuk为39.5％(13mg/l/od600)，p.d-piab4-pnir-psuk为39.7％(12.3mg/l/od600)，p.d-piab4-pnir-ssue为37.6％(13.5mg/l/od600)，p.d-piab4-prho-rutf为31.0％(10.3mg/l/od600)，降解效果最好的为p.d-piab4-pcs-sutr菌株，降解效率最高达到44％(17mg/l/od600)。综上所述这是一项在微生物中加强磺胺甲恶唑降解的代谢工程的开创性工作，为开发新的环境修复基因工程菌提供了成功案例。[0063]实施例5脱氮副球菌硝化和反硝化作用[0064]改良m9培养基配方为:nacl 0.5g/l，kh2po4 3.0g/l，na2hpo4 6.78g/l，1g/l no3-或nh4+，cacl2 0.115g/l，mgso4 0.24g/l。[0065]将实施例4中降解效果最好四株脱氮副球菌p.d-piab4-pcs-coga、p.d-piab4-pcs-sutr、p.d-piab4-prho-psuk、p.d-piab4-pnir-psuk及野生型菌株经过夜活化后，以2％的接种量接种至含100mg/l磺胺甲恶唑、4g/l甘油(按终浓度计)的改良m9培养基中(接种后的od600约0.08)，于30℃，150rpm震荡培养72h。每隔12h后取样，用试剂盒(连华lh-no3，中国上海)、氨氮(连华lh-nh4，中国上海)检测氮素的含量。[0066]本发明选择了降解效果最好的四株菌株，验证重组菌株自身的硝化和反硝化作用(图8a)是否受到外源基因表达和smx抗生素的影响。结果显示，经过12小时的处理，在不添加smx的情况下，野生型脱氮副球菌dytn-1对培养基中no3-的去除率为35.5％；添加smx后，去除率下降到18.4％。因此，野生型菌株的反硝化作用在早期生长阶段受到smx的抑制(图8b)。表达smx降解基因的重组菌株缓解了"smx压力"，平均no3-去除率为33％。72小时后，野生型菌株的no3-去除率为57.2％，而脱氮副球菌dytn-1、p.d-piab4-pcs-coga、p.d-piab4-pcs-sutr、p.d-piab4-prho-psuk和p.d-piab4-pnir-psuk的去除率分别为55.7％、49.3％、58.0％、56.4％、和55.7％。这些结果表明，sadab-fmnr的表达并不影响no3-的降解。相比之下，硝化作用几乎不受smx或sadab-fmnr表达的影响(图8c)。添加或不添加smx的野生型菌株的nh4+去除率分别为69.5％和67.8％，而表达smx降解基因的菌株nh4+去除率为68％-71％。因此，sadab-fmnr的表达对nh4+的去除没有负面影响。综上所述，构建的重组菌株，在不影响自身脱氮效果的情况下，通过代谢改造提高了脱氮副球菌对磺胺甲恶唑降解效率，获得的重组菌株可以用于smx和氮素污染物的双重降解，为环境保护工作的开展奠定理论基础。[0067]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。









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