用在可食用的中空纤维上培育的肌肉细胞生成的可消费的如同组织的结构的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术用在可食用的中空纤维上培育的肌肉细胞生成的可消费的如同组织的结构背景技术：1.实验室培育的肉或如同肉的制品，通常被称作“清洁肉”，很可能在为不断增长的人口提供食物方面发挥重要作用。然而，在该领域中的努力仅取得有限的成功。部分原因是因为用现有技术所生成的制品几乎没有或根本没有结构，最多如同碎肉的物质，该如同碎肉的物质必须与其它成分组合以形成如同肉的结构和质地(texture)。2.为了生成结构性清洁肉类，必须使用支架(scaffolding)。为了切实可行且具有成本效益，该支架必须是可食用的和/或可溶解的，并在最终制品中造成这样的质地和结构，该质地和结构使人联想到真正的肉或天然肉(即源自动物的肉)的口感。这意味着该支架必须提供至少三种品质：1)是可食用的，2)提供类似于真正的肉的质地和口感，和3)为肌细胞或如同肌细胞的细胞和其它细胞类型提供合适的培养环境，以有效地生长并形成类似天然肌肉的肌肉结构(例如，形成肌管并达到如同组织的细胞密度)。3.实现上述目标中的每一个在本领域中一直是挑战。在本领域中未能达到在一个培养体系中实现上述目标中的所有三个，很大程度上因为达到该三个目标中的任意一个会不利于达到其它目标中的一者或二者。4.原因是多方面的。我们将在此回顾其中的一些。已经尝试了可食用的微载体，但是在没有额外的加工步骤和/或材料的情况下，可食用的微载体无法达到如同组织的细胞密度或提供肉组织的口感或质地(参见例如marga的第2015/0079238号的美国专利公开)。5.已经使用了水凝胶管。一个益处是，肌细胞能够在水凝胶管上形成肌管。但是，细胞密度不够高，而最终的宏观结构不类似天然肉。将需要进一步加工，例如用于肌管校准(参见qiang,li,et al.,2018biofabrication 10:025006)的加工。6.三维(3d)水凝胶基质是熟知的，并且商购可获得。不幸的是，该形式并不适合用于如同组织的细胞密度，至少部分因为，维管化/培养基扩散是受限的(bramfeldt,et al.,curr med chem.2010；17(33):3944-3967)。此外，该结构会给出不自然的如同海绵的口感。7.已经由公司例如redefine meat,ltd.(ness ziona，以色列)进行了三维印刷，并且在对基于非肉类的结构性的如同肉的制品的组装(assembling)的结构和细胞密度方面中已经取得了进展。然而，该方法是最后的步骤。细胞生长的大部分会需要提前完成，并且将该细胞加工成3d结构给该过程增加过多的时间和成本。8.已经将去细胞化的植物材料(例如芹菜和大黄)描述为支架材料(参见gershlak,j.,et al.,biomaterials,2017may；125:13-22)。然而，液体管理成为超出实验室规模的挑战，使得使用去细胞化的植物材料的任何过程难以扩大至生产规模。此外，最终结构反映该植物材料，使得如同肉的制品的口感和质地不令人满意。尽管去细胞化的植物材料似乎允许细胞的正确取向并有助于对培养的细胞的维管化，但扩大规模已被证明是需要克服的关键障碍。另外，相比于天然肉，其口感可能更加非常类似植物物料。参见，例如待刊的decellularized plant-based scaffold for guided alignment of myoblast cells-santiago campuzano,et al.,2020和www.new-harvest.org/santiago_campuzano。9.基于植物的中空纤维在提供可食用的制品方面会存在问题。全谷物淀粉是可食用的，但溶于细胞培养培养基，因此不适合用于细胞培养或细胞粘附。纤维素已广泛用于过滤行业中。纤维素被认为是在现有食品中的材料，但在膜形式中，纤维素通常是化学改性的，并表现得如同塑料。纤维素的这种宏观性能使它对于消费是不理想的。同样，已经描述了与中空纤维共混的胶原蛋白。但是，此类制品并非为人类消费或为在清洁肉行业中的用途而设计(参见wo2018162857 a1，hollow cellular microfibre and method for producing such a hollow cellular microfibre)，并很可能不适合用于该领域中。10.此外，现有的可食用的支架不允许维管化，该维管化是生成厚度超过几百微米的结构性肉所需的。如上所述，可食用的支架的一个实例是微载体。微载体必须或者悬浮在培养容器中，或者被包装在床层或散装材料中。在此类情况下，仅从培养基中进料细胞培养物，在该培养基中浸入该支架。因此，该培养物的生长受到在组织中的培养基的扩散的限制，所述扩散据报道为小于200μm。11.支架也已经被报道以基本上二维的形式，例如材料的静电纺纱片材(参见例如yang,f.,et al.,materials(basel),2017oct 12；10(10))。此类二维片材可以通过穿过该片材的培养基的扩散来进料以及通过周围的培养基来进料。12.另外，在现有技术的支架上培育的肌肉组织的取向并未正确地取向，以包括肌原纤维的形成。用于制备可食用的结构性清洁肉制品所需的和所述的支架在本领域中是未知的，也不是商购可获得的。13.因此，目前需要改善的细胞培养材料，以及采用此类材料的装置和方法，以用于结构性清洁肉制品的生成。技术实现要素：14.本发明涉及提供可食用的清洁肉制品的细胞培养装置和体系，该可食用的清洁肉制品包含支架，该支架1)是可食用的，2)提供类似于真肉的质地、结构和口感，和3)促进肌细胞和其它细胞类型生长成类似天然肌肉的结构。此外，在例如加工(即切割或切片)和烹饪的期间，支架和在该支架上的清洁肉生长具有类似天然肉的质地和处理品质。换句话说，本发明提供适合用于制备有质地的结构性肉制品的材料和方法。通过基于可食用的中空纤维的培养体系、利用本发明的可食用的中空纤维的培养装置和利用本发明的培养装置的培养方法，本发明实现这些目标。如下文所述，本发明的中空纤维也可以是部分或完全可溶解的。15.本发明人已经发现，通过使用本发明的可食用的中空纤维，可以生成具有成本效益的结构性清洁肉。本发明的中空纤维在肌肉结构以及其它期望的性质方面增加结构性清洁肉的终端制品的品质。此外，通过在培养期结束时用基于脂质的组分填充中空纤维的空腔(lumen)，所需终端制品的脂肪含量可以被调整并被均匀地分布在整个制品中。16.本发明的中空纤维组合物还可以有助于终端制品的口感以及终端制品的味道。此外，在培养期结束时，用例如胶体材料或其它材料可以将香料添加至该中空纤维的中心。该胶体材料可以是包含脂质(脂肪)和香料中的一者或二者以及其它成分的液体或浆液。17.通过使用各种(a variability of)基础材料以产生中空纤维，可以影响结构性清洁肉终端制品的香味和质地。在这个意义上，依据所需的终端制品可以定制本发明的中空纤维。例如，依据正在培育的肉的类型，可以调整用于制备中空纤维的材料，并且可以调整间隔(即中空纤维之间的间隔和中空纤维的直径)以提供例如不同的最终质地。根据本说明书的教导，根据需要，本领域技术人员将能够修改本发明的中空纤维和任何相关的中空纤维设备(例如中空纤维筒)，以影响最终终端制品的特性。18.基于本发明的中空纤维的结构和组成，也可以控制细胞生长特性。例如，在中空纤维的构造中利用纤维状组分而不是粒子或微粒，可能会导致不同的细胞粘附特性，并最后造成纤维和最终清洁肉制品二者的不同的最终制品质感。例如，发明人理解，在本发明的中空纤维的构造中利用纤维状组分使细胞生长取向沿着纤维。类似地，具有有质感表面的纤维可影响最终制品。此外，本发明的纤维可以具有被加入至或被施加至本发明的中空纤维的表面上的因子(例如生长因子、附着因子)。上述对本发明的中空纤维的修改中的一些也可以影响最终制品的味道、结构、强度、质地和口感中的一种或多种。19.在本文中提供，新颖的非显而易见的中空纤维的发明，该中空纤维适合用于细胞材料(即细胞，例如但不限于肌肉细胞、脂肪细胞和成纤维细胞)均匀或实质上均匀地生长至沿着各自中空纤维和沿着被排列成需要的图案的中空纤维的均匀或实质上均匀的密度，以及具有在所述排列的中空纤维之间的空隙空间的均匀或实质上均匀的分布。本发明还涉及至少部分地利用本发明的中空纤维的生物反应器，以及制备结构性清洁肉制品的工艺和方法，和用本发明的中空纤维制备的结构性清洁肉制品。尽管本发明不限于理论，但据信本发明的中空纤维的令人惊讶和出人意料的特征可以至少归因于一种或多种纤维材料、纤维配置、纤维孔隙率和纤维直径的组合。此外，本发明的中空纤维的此类特征据信与在本发明的结构性清洁肉制品的制备中培养的一种或多种细胞类型协同和组合地作用。20.在一方面，本发明涉及可食用的中空纤维，其包含一种或多种选自水胶体和蛋白的材料，所述中空纤维具有约0.2mm至约2.0mm的外径，0％至约75％的孔隙率和约0.05mm至约0.4mm的壁厚。在另一方面，所述中空纤维具有约0.08mm至0.2mm的壁厚。在另一方面，所述中空纤维具有约40％至约60％的孔隙率。21.在另一方面，本发明的中空纤维包含藻酸盐、胶原、纤维素、脱乙酰壳多糖、胶原、玉米蛋白、琼脂、菊粉、面筋、果胶、豆类蛋白、甲基纤维素、果胶、明胶、木薯淀粉、黄原胶、瓜耳胶、他拉胶、豆胶、植物蛋白、淀粉、植物分离物(例如大豆蛋白/玉米蛋白/酪蛋白/小麦蛋白)、脂质(例如游离脂肪酸、甘油三酯、天然蜡和磷脂)中的一种或多种。在本发明的另一方面，所述中空纤维的蛋白包括玉米蛋白、土豆蛋白、小麦蛋白、高梁蛋白、动物蛋白、动物蛋白分离物、牛肉蛋白分离物、酪蛋白和乳清蛋白中的一种或多种。在本发明的另一方面，所述中空纤维的植物分离物包括大豆蛋白、玉米蛋白、酪蛋白和小麦蛋白中的一种或多种。在本发明的另一方面，本发明的中空纤维的脂质包括游离脂肪酸、甘油三酯、天然蜡和磷脂中的一种或多种。在本发明的又另一方面，所述中空纤维包含一种或多种豆类蛋白和一种或多种水胶体。22.在本发明的另一方面，每根本发明的中空纤维具有第一末端和第二末端，其中所述第一末端和所述第二末端在位置上彼此相对，并且其中，一定数量的所述中空纤维平行地或基本上平行地排列，并且如此定位使得所述中空纤维的所述第一末端固定在第一保持装置中，并且所述中空纤维的所述第二末端固定在第二保持装置中，所述第一和第二保持装置取向成垂直于或基本上垂直于所述中空纤维的纵向取向，并且取向成彼此平行或基本上平行，其中至少一个保持装置允许流体流动至所述中空纤维的内部，由此产生中空纤维筒。在本发明的另一方面，所述中空纤维筒的所述中空纤维处于约40至约120根/cm2的密度。在本发明的另一方面，所述中空纤维筒的所述中空纤维处于约60至约100根/cm2的密度。在本发明的又另一方面，所述中空纤维筒的所述中空纤维处于约70至约90根/cm2的密度。23.在本发明的另一方面，本发明的中空纤维筒具有在所述中空纤维之间的空隙空间，并且在所述中空纤维之间的所述空隙空间占所述中空纤维筒的总体积的约25％至约75％。在本发明的又另一方面，在所述中空纤维之间的所述空隙空间占所述中空纤维筒的总体积的约40％至约60％。24.在本发明的另一方面，所述中空纤维筒被设计成可移除地插入至外壳中。在本发明的另一方面，所述外壳是生物反应器或生物反应器体系的一部分。25.在另一方面，本发明涉及中空纤维细胞培养反应器，其包含本发明的中空纤维细胞培养筒、具有容纳本发明的中空纤维筒的尺寸的外壳、与在所述外壳中的一个或多个入口流体连通的细胞培养培养基来源、在所述外壳中的一个或多个出口和一个或多个泵，以通过所述培养基的一个或多个入口和/或一个或多个出口向所述中空纤维筒供应所述培养基和/或从所述中空纤维筒中移除废弃培养基和/或气体。在本发明的另一方面，所述入口与所述中空纤维的内部流体连通。在本发明的另一方面，所述入口与所述中空纤维之间的所述空隙空间流体连通，并且所述出口与所述中空纤维的内部流体连通，由此产生从所述中空纤维的外部至内部的流体流动。在本发明的又另一方面，所述中空纤维细胞培养反应器包含自动控制器。所述自动控制器可包括计算机。26.在本发明的一个方面，本发明涉及肉制品的制备方法，其包括：在本发明的中空纤维反应器中的所述中空纤维之间的所述空隙空间中以约105个细胞/ml至约108个细胞/ml的密度接种肌细胞、如同肌细胞的细胞或表达一种或多种如同肌细胞的特征的工程细胞中的一种或多种，和培养所述细胞直至达到约80％至约99％的汇合度；约85％至约99％的汇合度；或约90％至约99％的汇合度。在本发明的另一方面，所述方法额外地包括，在所述细胞已经达到需要的汇合度后，从所述中空纤维细胞培养反应器中移除所述中空纤维筒。在本发明的另一方面，本发明的方法额外地包括分别从所述中空纤维的所述第一末端和第二末端移除所述第一保持装置和所述第二保持装置。在本发明的另一方面，本发明的方法额外地包括在所述中空纤维反应器中接种(即，除了上述的肌细胞、如同肌细胞的细胞或表达一种或多种如同肌细胞的特征的工程细胞以外)脂肪细胞、如同脂肪细胞的细胞或表达一种或多种如同脂肪细胞的特征的工程细胞和/或成纤维细胞、如同成纤维细胞的细胞或表达一种或多种如同成纤维细胞的特征的工程细胞中的一种或多种。27.在本发明的另一方面，本发明的方法额外地包括，通过所述中空纤维的所述第一末端和第二末端中的一者或二者进入至所述中空纤维的内部中，通过所述中空纤维的壁进入至在所述中空纤维之间的所述空隙空间中，在所述空隙空间中所述细胞被接种，和通过在所述外壳中的一个或多个所述出口，来将培养基供应至所述细胞。在本发明的另一方面，对于培养过程的至少一部分，培养基的流动是反方向的。28.在本发明的另一方面，本发明的方法另外包括，在所述细胞达到汇合度后，所述中空纤维的内部和/或在所述细胞之间的任何剩余空隙空间中灌注脂肪、香料、色料、盐和防腐剂中的一种或多种。29.在本发明的另一方面，本发明涉及结构性清洁肉制品，其包括：a)50％至90％的培养动物细胞；b)10％至30％的可食用的中空纤维和/或中空纤维材料；c)1％至30％的空隙空间，所述空隙空间位于所述培养动物细胞之间和/或在所述空隙空间中散布所述培养动物细胞；和d)1％至30％的添加剂。通过本发明的方法使用本发明的中空纤维细胞培养反应器和中空纤维，可制备结构性清洁肉制品。30.在本发明的一个方面，添加至本发明的结构性清洁肉制品中的添加剂包括香料(flavor)、质地增强剂、营养成分添加剂(nutritional additive)、防腐剂和脂肪中的一种或多种。在本发明的一个方面，所述香料选自精油、含油树脂(eso)、酶(enz)、天然物质和抽提物(nat)、非营养性甜味剂(nns)、营养性甜味剂(nutrs)、辛香料(spice)、天然调味品和调味剂(seasonings&flavorings)(sp)、合成香料(sy/fl)、熏蒸剂(fum)、人工甜味剂和酵母提取物中的一种或多种。在本发明的另一方面，所述质地增强剂选自糊状(pureed)植物材料、瓜耳胶、纤维素、半纤维素、木质素、β-葡聚糖、大豆、小麦、玉米和水稻分离物和甜菜纤维、豌豆纤维、竹纤维、衍生自植物的纤维、衍生自植物的面筋(gluten)、角叉菜胶、黄原胶、卵磷脂、果胶、琼脂、藻酸盐、天然多糖、谷壳、柠檬酸钙、磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁和盐中的一种或多种。在本发明的另一方面，所述营养成分添加剂选自微量元素；生物活性化合物、内源性抗氧化剂；a、b-复合物；c、d、e维生素；锌；硫胺素；核黄素；硒；铁；烟酸；钾；磷；ω-3；ω-6；脂肪酸；镁；蛋白；氨基酸盐；肌酸；牛磺酸；肉碱；肌肽；泛醌；谷胱甘肽；胆碱；谷胱甘肽；硫辛酸；精胺；鹅肌肽；亚油酸；泛酸；胆固醇；视黄醇；叶酸；膳食纤维和氨基酸中的一种或多种。在本发明的又另一方面，所述脂肪选自饱和的脂肪、单不饱和的脂肪、多不饱和的脂肪、玉米油、菜籽油、葵花油、红花油、橄榄油、花生油、大豆、亚麻籽油、芝麻油、菜籽油、牛油果油、种子油、坚果油、红花油和葵花油、棕榈油、椰子油、ω-3、鱼油、猪油、黄油、经加工的动物脂肪、脂肪组织(adipose tissue)、衍生自细胞农业的脂肪精油和含油树脂中的一种或多种。在本发明的另一方面，所述防腐剂和/或抗氧化剂选自以下中的一种或多种：钠盐、氯盐、碘盐、硝酸盐、亚硝胺、丁基化的羟基苯甲醚(bha)、丁基化的羟基甲苯(bht)、苯甲酸钠、苯甲酸钾和苯抗坏血酸、柠檬酸、钾、谷氨酸一钠(msg)、二氧化硫、亚硫酸盐、抗生素中的一种或多种。此处应注意，任何一种添加剂、香料、质地增强剂、营养物添加剂、脂肪/油和/或防腐剂/抗氧化剂可为本发明的结构性清洁肉制品供应超过一种的属性。31.在本发明的一个方面，本发明的结构性清洁肉制品的中空纤维包含一种或多种豆类蛋白和一种或多种水胶体。在本发明的另一方面，所述空隙空间没有细胞和/或细胞材料。在本发明的另一方面，所述空隙空间至少部分地填充有除了细胞或细胞材料之外的材料。附图说明32.图1(a和b)示出本发明的中空纤维的几何排列的某些实施方案。图1a示出矩形图案，图1b示出三角形图案。附图仅用于对纤维排列的说明性目的。相比于图示，在本发明的实际中空纤维筒中的纤维间隔可以具有更大的在所述纤维之间的空隙空间。同样，在各自中空纤维之间的间隔可以不同。33.图2(a和b)示出在本发明的中空纤维上的细胞生长的端视图表示的某些实施方案。附图示出，在某些情况下，即使在细胞生长后，仍可存在最低限度的空隙空间。34.图3示出本发明的单根中空纤维的截面的一个实施方案的表示，其中a是所述中空纤维的中心或空腔，b是多孔中空纤维壁，c是细胞团(cell mass)。35.图4示出基于不同纤维直径(od＝外径)的清洁肉(“肉”)、纤维和空隙空间的示例性计算百分比。本领域技术人员将能够从这些附图中推断出更大或更窄的od的纤维。36.图5示出对三种不同的纤维od的清洁肉(“肉”)、纤维和空隙空间的示例性计算百分比。37.图6展示以表格形式的来自图5的示例性数据。38.图7展示以表格形式的关于本发明的中空纤维的实施方案的示例性计算数据。39.图8示出溶解的藻酸盐：蛋白混合物。从左至右：大豆酸解产物；牛肉蛋白分离物、乳清蛋白分离物、糙米蛋白分离物、豌豆蛋白分离物和大豆蛋白分离物。40.图9示出单独的各种藻酸盐(不含蛋白)。大型广口瓶已经高压灭菌；小型广口瓶未经高压灭菌。41.图10(a-d)示出根据范例制备的中空纤维。(a)显示出制备后的纤维。(b)和(c)显示出处于100倍放大倍数的纤维。(d)显示出处于50倍放大倍数的另一根纤维。42.图11示出本发明的中空纤维可以容易地支撑它们的重量，这会是在生物反应器中需要的。所示纤维为2米长。43.图12(a和b)示出由5:2的乳清蛋白:藻酸盐的混合物制成的本发明的中空纤维的冷冻扫描电子显微照片(sem)。(a)100x。(b)5000x。44.图13(a-d)示出增加的放大倍数的由5:2的乳清蛋白:藻酸盐的混合物制成的中空纤维。(a)比例尺＝10μm，(b)比例尺＝1μm，(c)比例尺＝1μm(与图13b相比更大的比例尺表明其放大倍数约为图13b的放大倍数的3倍)，(d)比例尺＝100nm。这些样品使用临界点干燥法来制备，随后sem。45.图14(a和b)示出由大豆蛋白:藻酸盐的混合物制成的本发明的中空纤维的冷冻sem。(a)100x。(b)5000x。46.图15(a和b)显示出增加的放大倍数的由5:2的大豆蛋白:藻酸盐的混合物制成的中空纤维。(a)比例尺＝10μm，(b)比例尺＝1μm。这些样品使用临界点干燥法来制备，随后sem。47.图16(a和b)显示出进一步增加的放大倍数的由5:2的大豆蛋白:藻酸盐制成的中空纤维。(a)示出与图15a不同的区域：比例尺＝1μm，(b)比例尺＝200nm。这些样品使用临界点干燥法来制备，随后sem。同样值得注意的是，在图16a中观测到的细菌污染，表明本发明的可食用的中空纤维的易腐本质。48.图17(a和b)示出由南瓜蛋白:藻酸盐的混合物制成的本发明的中空纤维的冷冻sem。(a)1000x。(b)10,000x。49.图18(a和b)示出由南瓜蛋白:藻酸盐的混合物制成的本发明的中空纤维的冷冻sem。(a)20,000x。(b)40,000x。50.图19(a-d)示出增加的放大倍数的由5:2的南瓜蛋白:藻酸盐制成的中空纤维。(a)比例尺＝10μm，(b)比例尺＝1μm，(c)比例尺＝100nm，(d)比例尺＝1μm。这些样品使用临界点干燥法来制备，然后sem。51.图20(a和b)示出由豌豆蛋白:藻酸盐的混合物制成的本发明的中空纤维的冷冻sem。(a)100x。(b)5000x。52.图21(a和b)示出牛肉蛋白:藻酸盐的混合物制成的本发明的中空纤维的冷冻sem。(a)1000x。(b)10,000x。53.图22(a和b)示出由牛肉蛋白:藻酸盐的混合物制成的本发明的中空纤维的冷冻sem。(a)20,000x。(b)40,000x。54.图23(a和b)示出进一步增加的放大倍数的由5:2的牛肉蛋白:藻酸盐制成的中空纤维。(a)比例尺＝1μm，(b)比例尺＝1μm。这些样品使用临界点干燥法来制备，随后sem。55.图24显示出(a)比例尺＝1μm，(b)比例尺＝100nm。这些样品使用临界点干燥法来制备，随后sem。来自图23a、23b和24a的1μm比例尺是来自所述中空纤维的不同区域。56.图25(a和b)示出由水稻蛋白:藻酸盐的混合物制成的本发明的中空纤维的冷冻sem。(a)1000x。(b)5000x。57.图26显示出在本发明的中空纤维上的c2c12鼠肌肉细胞的细胞生长。如通过表明atp生成的原始发光单元(rlu)所测量，细胞生长是相对的。参见实施例1c。58.图27(a-c)示出这样的细胞，所述细胞生长并附着至本发明的中空纤维，并如在实施例1c所述。(a)显示出对活细胞和死细胞二者的染色。(b)显示出对活细胞的染色。(c)显示对死细胞的染色。具体实施方式59.本发明考虑可食用和/或可溶解的中空纤维、用于制备例如结构性清洁肉的包含本发明的中空纤维的生物反应器、用其制备结构性清洁肉的方法和用本发明的中空纤维制备的结构性清洁肉。清洁肉在本领域中被限定为由在实验室、工厂或其它适合用于大规模的细胞培养的生产设施中的细胞培育的肉或如同肉的制品(在本文中被统称作“清洁肉”或“清洁肉制品”)。[0060]“结构性肉制品”或“结构性清洁肉制品”是指具有如同、类似于或让人联想到来自动物的天然肉的质地和结构的肉制品或清洁肉制品。本发明的结构性肉制品具有这样的质地和结构，所述质地和结构1)在质地和外观上，2)在当被准备烹饪和消费时(例如，当被切片、切碎、烹饪等时)的可操作性上和3)当被人消费时的口感上类似天然肉。本发明的材料和方法当被用于结构性清洁肉的制备中时，至少达到这些标准中的一个、这些标准中的两个或全部三个这些标准。现有技术无法制备出充分满足任意一个这些标准的结构性肉制品。[0061]本发明的结构性肉制品通过在包含本发明的中空纤维的生物反应器(在下文中描述)中培养合适的细胞(也在下文中描述)来满足这些标准。本发明的中空纤维至少在相当大的程度上为最终结构性清洁肉制品提供结构和质地，所述最终结构性清洁肉制品提供所述制品需要的外观、可操作性和口感。此外，本发明的中空纤维有助于为细胞生长成结构性清洁肉制品提供合适的环境。在本上下文中，本发明的中空纤维至少提供这样的表面，该表面适合用于培养细胞的附着、该细胞延伸成与肌细胞或如同肌细胞的细胞类似的形态(即在结构和外观上实质上类似肌细胞)和肌细胞形成为肌管或如同肌管的结构(即在结构和外观上实质上类似肌管)。[0062]考虑的是，本发明的可食用和/或可溶解的中空纤维由水胶体(例如黄原胶、一种或多种甲基纤维素、藻酸盐、琼脂、果胶、明胶、瓜耳胶/他拉胶/豆胶/其它胶)、蛋白(例如多肽、肽、糖蛋白和氨基酸)中的一种或多种制成；例如，各种淀粉(玉米/土豆/水稻/小麦/高梁)、植物分离物(例如大豆/玉米蛋白/酪蛋白/小麦蛋白)、脂质(例如游离脂肪酸、甘油三酯、天然蜡和磷脂)、醇类(例如多元醇)、碳水化合物和其它天然物质例如藻酸盐。此外，考虑的是，可将其它材料添加至所述中空纤维，或涂布在所述中空纤维上，该其它材料有助于细胞附着和细胞生长。例如，考虑的是中空纤维添加剂或涂层是蛋白、水凝胶或本领域技术人员已知的其它涂料中的一种或多种，包括本领域普通技术人员已知的从植物中分离的或由更简单的物质合成的细胞外基质(ecm)组分和提取物、聚-d-赖氨酸、层粘连蛋白、胶原(例如胶原i和胶原iv)、明胶、纤维连接蛋白、基于植物的ecm材料、如同胶原的材料、如同纤维连接蛋白的材料和如同层粘连蛋白的材料。总的结果是，本发明的纤维赋予肉和肉制品的质地和结构，将类似于真肉的质地、外观、可操作性和口感给予由本发明制备的结构性清洁肉制品。[0063]更具体地，本发明的中空纤维可包含纤维素、脱乙酰壳多糖、胶原、玉米蛋白、藻酸盐、琼脂、菊粉、面筋、果胶、豆类蛋白、一种或多种甲基纤维素、明胶、木薯淀粉、黄原胶/瓜耳胶/他拉胶(tara gum)/豆胶/其它胶、蛋白(例如多肽、肽、糖蛋白和氨基酸，包括但不限于各种形式的玉米/马铃薯/水稻/小麦/高梁淀粉、植物分离物和大豆/玉米蛋白/酪蛋白/小麦蛋白，所有这些是本领域技术人员已知的)、脂质(例如游离脂肪酸、甘油三酯、天然蜡和磷脂)中的一种或多种。纤维素聚合物可包括乙酸丁酸纤维素、丙酸纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、硝化纤维素等。更具体地，本发明的中空纤维可包含豆类蛋白和水胶体中的一种或多种的混合物。[0064]在一个实施方案中，考虑的是本发明的中空纤维是可食用的且可溶解的，或可食用的，或可溶解的。换句话说，纤维可以是或者可食用的或者可溶解的或者两者兼有。此外，对于可溶解的纤维，可存在不同程度的可溶解性。例如，在暴露于合适的溶剂(例如由food and drug administration(fda)或其它被认可为有资格评估可消费的物质的安全性的组织通常认可为安全的无毒溶剂)时，某些纤维可以是容易溶解的。其它纤维可以是不容易溶解的。在这方面，在培养的细胞已经达到必要水平的汇合度后，不容易溶解的纤维可以部分地溶解，从而留下足够的纤维以给本发明的结构性清洁肉提供需要的口感和质地，但不存在可使本发明的结构性清洁肉制品似乎嚼不动(tough)或耐嚼的过量的纤维。可溶解的中空纤维成分(constituent)是本领域技术人员已知的。例如，藻酸盐在暴露于ca2+螯合剂时是可溶解的。在本发明的一个实施方案中，考虑的是，本发明的中空纤维包含一定量的藻酸盐以使该纤维部分可溶解的，和/或在包含本发明的中空纤维的装置中的一定百分比的纤维包含藻酸盐。[0065]交联剂。在本发明的一个实施方案中，考虑的是，在本发明的中空纤维中使用一种或多种交联剂。交联剂，顾名思义，结合该中空纤维的一种或多种其它成分，以增强该纤维。在本发明的一个实施方案中，交联剂可以是本发明的中空纤维的可溶解的组分或可溶解的组分之一。由本发明考虑的示例性交联剂和交联机制包括但不限于共价键结合的酯交联(第7,247,191号美国专利)和紫外(uv)交联(第8,337,598号美国专利)，这两者均通过引用整体并入本文中。此外，交联剂在中空纤维的制备中的用途是本领域技术人员已知的。参见例如第9,718,031、8,337,598、7,247,191、6,932,859和6,755,900号美国专利，所有这些均通过引用整体并入本文中。[0066]中空纤维制备技术是本领域技术人员已知的(参见例如vandekar,v.d.,manufacturing of hollow fiber membrane,int’l j sci&res,2015,4:9,pp.1990–1994，和其中引用的参考文献)。已知的方法包括但不限于熔融纺丝、干式纺丝和湿式纺丝。在熔融纺丝中，聚合物通常在惰性气氛中被加热至熔融或以上。然后，熔融的聚合物通过“喷丝头”挤出，该“喷丝头”为具有制备所需尺寸的中空纤维的尺寸的喷嘴。挤出的聚合物立即凝固，并且形成具有均匀结构和直径的毛细管。该纤维可被进一步拉伸以制备具有小于50pm的直径和薄至5pm的壁厚的纤维。[0067]干式纺丝包括在非常易挥发的溶剂中溶解聚合物。在挤出后加热该溶剂/聚合物混合物，并且随着该溶剂的挥发，该聚合物凝固。[0068]湿式纺丝是更加通用的，因为该方法涉及更大数量的可变化的参数。聚合物和溶剂混合物被挤出至非溶剂浴中，在该浴中由于溶剂和非溶剂的交换而发生分层和/或相分离。在该挤出和该非溶剂浴之间存在空气间隙，在该空气间隙中该中空纤维膜形成开始。[0069]可以消除或最小化溶剂的使用的技术是具有冷拉伸的熔融纺丝(mscs)。这种方法导致具有成本效益的制备，但可能牺牲结构控制和食品材料的潜在降解。在这种技术中，材料被加热以用于挤出，然后在它们被冷却时被牵拉，以在中空纤维壁上机械地形成孔。所有三种这些技术已得到广泛研究，并且在本领域中是已知的，并已得到充分总结(参见tan,xm.and rodrigue,d.,polymers(basel),2019,aug 5:11(8))。[0070]这些技术的修改对于本领域技术人员而言也是已知的。参见例如wo 2011/108929(通过引用整体并入本文)，其中公开用于由多种聚合物和聚合物层组成的中空纤维的制备的修改的湿式纺丝挤出方法。由非合成的材料制备中空纤维对于本领域技术人员而言也是已知的。参见例如suzuki的第4,824,569号美国专利，该专利整体并入本文。[0071]在一个实施方案中，本发明的中空纤维的宏观结构被考虑以促进所述细胞沿着所述纤维的取向。在这方面，本发明期望的是构成所述中空纤维的组分分子取向为平行于、基本上平行于或主要平行于所述中空纤维的长度。另外考虑的是，该组分分子至少在所述中空纤维的外部表面上产生表面质感，该表面质感有助于细胞附着并有助于细胞取向。因此，在一个实施方案中，考虑的是，本发明的中空纤维的表面质感产生用于细胞附着的附着点。在另一个实施方案中，另外考虑的是在本发明的中空纤维上培育的细胞(特别是肌细胞、如同肌细胞的细胞或具有肌细胞的特征的细胞)沿着所述中空纤维的长度取向并延伸，如同和类似在体内的肌细胞。[0072]因此，支架的表面结构的取向与在形成期间的肌管的对准直接相互关联。这可以被认为是如同骨骼肌想要沿着先前存在的结构形成。可以设想的是，纤维束紧密地模拟骨骼肌结构以用于对准的肌管的形成。因此，中空纤维生物反应器不仅实现如同组织的细胞密度，而且实现其它技术无法实现的肌管对准，造成在所有所述技术中的最真实的口感。通过研究：my mistake:decellularized apium graveolens scaffold for cell culture and guided alignment of c2c12 murine myoblast-santiago campuzano,2020,ph.d.thesis,university or ottawa,pp 58-59.，可以更好地理解对准现象。[0073]考虑的是，本发明的中空纤维具有会适合用于本发明的尺寸范围。还考虑的是，本发明的中空纤维被间隔，使得在该中空纤维上培育的细胞达到这样的密度，该密度与真肉的密度相似并具有在该细胞之间的最低限度的空隙空间。在一个实施方案中，考虑的是本发明的中空纤维具有约0.1mm至约3.0mm的外径、约0％的孔隙率(使它基于扩散)至约75％的孔隙率和约0.008mm至约0.5mm或约0.01mm至约0.2mm的壁厚或0.008mm至0.5mm之间的以上未具体重复的任意厚度。本发明人发现了，该尺寸适合用于培养基传输穿过该纤维的空腔，并允许培养基充分流动穿过该中空纤维的壁，同时足够刚性以支持细胞生长，并另外提供所需的最终制品结构、质地、可操作性和口感。但是，依据所需的结构性清洁肉制品(例如牛肉、家禽、鱼、猪肉等)，考虑关于该纤维的直径、壁厚和孔隙率的变化的其它实施方案；在下文中描述。[0074]纤维孔隙度。本发明的中空纤维需要孔隙率以用于培养基穿过该纤维的壁的充分流动，同时确保用于细胞生长和细胞支持的合适的表面。该中空纤维的孔隙率部分地涉及该中空纤维的壁的厚度和涉及该中空纤维的组成。如果该壁足够薄，则0％的孔隙率可以足以允许该培养基扩散穿过该中空纤维壁。本发明的中空纤维的孔隙率可以高至75％。因此，本发明的中空纤维的孔隙率的范围为0％至约75％，约10％至约65％，约30％至约60％，或在0％至75％之间的上文未具体重复的任意百分比值。[0075]本发明的中空纤维也可经历孔隙形成步骤。孔隙形成机制将是在膜形成的领域中熟知的以下技术之一：ips＝热诱导的相分离，nips＝非溶剂诱导的相分离，vips＝蒸气诱导的相分离，mscs＝与拉伸组合的熔融纺丝，(参见review on porous polymeric membrane preparation.part ii:production techniques with polyethylene,polydimethylsiloxane,polypropylene,polyimide,and polytetrafluoroethylene xue mei tan 1,2,2019)。在所有设想中，聚合物通过或者热熔融它或者化学溶解而将处于液相中。从那里，该聚合物被挤出成圆柱形状，并被拉伸至轴上。在挤出步骤期间，钻孔流体可以用于防止该中空纤维自身塌陷。在挤出喷嘴和复卷(rewind)轴之间，还可存在孔形成腔室，例如水槽或大气环境腔室。[0076]本发明还考虑在生物反应器中的本发明的中空纤维的配置。纤维配置可包括纤维定位和间隔中的一者或二者。纤维可被配置为允许细胞群的生长的任意配置，该细胞群具有在汇合度下的细胞之间的最低限度的空隙空间。例如，纤维可取向为正方形/矩形(行和列，参见图1a)或三角形/六边形(蜂窝状，参见图1b)包装模式。在图2中示出其它包装/间隔配置。因此，在一个实施方案中，考虑的是排列纤维，使得当从末端观测时，该纤维形成行和列的有序图案。在另一个实施方案中，考虑的是该纤维当从末端观测时形成蜂窝状图案。在另一实施方案中，考虑的是随机地或半随机地排列本发明的纤维。在另一实施方案中，考虑的是以不同密度的有序的或半有序的图案排列该中空纤维。[0077]中空纤维的外径可以为约0.1mm至约3.0mm，约0.5mm至约2.0mm，约0.8mm至约1.3mm，和上述数值之间的任意数值。1.0mm的中空纤维在外径周围假定具有约0.3mm至约0.5mm的肉生长。约1.1mm的末端直径可以导致具有约85根中空纤维/cm2的肉。[0078]在另一实施方案中，考虑的是纤维具有在纤维之间的不同程度或量的间隔。例如，在更低密度的纤维之间散布数排的更高密度的纤维可用于产生最终结构性清洁肉制品的质地的变化，例如在天然鱼肉中常见的质地的变化。此外，考虑的是，具有不同的直径、孔隙率和壁厚的纤维可以用于同一中空纤维筒中，以再次模拟天然肉的外观、质地、可操作性和口感。[0079]在任意配置中，将该纤维间隔，使得该纤维之间的间隔具有这样的距离，该距离允许培养基(和其中含有的营养物、生长因子等)的充分流动以到达所有的细胞团。这当然将至少部分地与该培养基的流速和该中空纤维壁的孔隙率有关，但更大部分地与从该中空纤维的外壁的表面至该细胞的物理距离有关。换句话说，培养基和营养物将仅移动或扩散穿过细胞团的受限的距离。目前认为的是氧气和营养物的扩散的最大限度为200μm。rouwkema,j.,et al.,(2009)supply of nutrients to cells in engineered tissues,biotechnology and genetic engineering reviews,26:1,163-178。因此，纤维之间的间隔应该是从一根纤维的外壁至相邻纤维的外壁的约400μm。不限于任何特定尺寸，图2示出在中空纤维的配置上的细胞团的表示。不限于任何特定尺寸，图3示出单根的本发明的中空纤维的截面的一个实施方案的表示，其中a是该中空纤维的中心或空腔，b是多孔中空纤维壁，c是细胞团。在这样的培养条件下，在该培养条件中培养基流动穿过该中空纤维和穿过该中空纤维之间的间隔二者，该间隔可以更大。例如，间隔可以为从一根纤维的外壁至相邻纤维的外壁的800μm。这些数值是针对培养过程仅依赖于扩散的情况。然而，(例如)泵的使用将产生培养基从该中空纤维穿过该中空纤维之间的细胞培养空间和流至外壳出口(而不是仅依赖扩散)的流动，从而允许该纤维被进一步间隔分开。例如，在一些实施方案中，考虑的是纤维之间的最大距离为约0.05mm(50μm)至约5.0mm；约0.1mm至约3.0mm；约0.1mm至约2.0mm；约0.1mm至约1.0mm或约0.2mm至约0.5mm或上述数值之间的任意距离。尽管优选的实施方案是培养基从该中空纤维的中心穿过培养物流动至外壳出口，但也考虑的是，根据需要，培养基流动可以是反方向的，或可以从一个方向交替至另一个方向。据信，交替该培养基流动的方向有助于确保所有细胞具有充足的培养基供应。[0080]图4-7提供对本发明可接受的纤维、细胞和空隙空间之间比率的计算数据和示意性表示。图4示出基于不同的纤维直径(od＝外径)的清洁肉(“肉”)、纤维和空隙空间之间的示例性计算百分比。本领域技术人员将能够从这些数值中推断出更大或更窄od的纤维。图5示出三种不同的纤维od的清洁肉(“肉”)、纤维和空隙空间之间的示例性计算百分比。图6展示以表格形式的来自图5的示例性数据。图7示出以表格形式的关于本发明的中空纤维的实施方案的示例性计算数据。[0081]本发明的一个实施方案是，在本发明的中空纤维的距离中，一定程度的随机性会是固有的。在上一段落中给出的数值是对于给定组装的平均的纤维至纤维的距离。在本发明的一个实施方案中，间隔物和/或组装技术可用于确保、标准化或控制纤维之间的距离。参见，例如，han g,wang p,chung ts.,highly robust thin-film composite pressure retarded osmosis(pro)hollow fiber membranes with high power densities for renewable salinity-gradient energy generation,environ sci technol.2013jul 16；47(14):8070-7.epub 2013jun 28或chun feng wana,bofan li a,tianshi yang a,tai-shung chung,design and fabrication of inner-selective thin-film composite(tfc)hollow fiber modules for pressure retarded osmosis(pro),separation and purification technology,172:32–42,2017。[0082]一旦细胞密度变得过密或细胞团的厚度变得过厚，则培养基到达离中空纤维最远的细胞的能力变得困难。对于这些细胞而言缺乏培养基可造成在反应器中的死细胞和/或细胞不能生长的死空间。其必然结果是，培养基需要流动穿过中空纤维筒流至外壳出口。也就是说，需要维持培养基的流动，至少直到达到一定汇合度并且收获结构性清洁肉制品。基于本说明书的教导，本领域技术人员针对给定的所需结构性清洁肉制品将能够计算本发明的纤维的正确的间隔和孔隙率。[0083]在本文中被称作“中空纤维筒”的物体中，可以排列并固定本发明的中空纤维。在一个实施方案中，考虑的是通过将中空纤维的末端以需要的排列固定在端件(end piece)中来制备中空纤维筒。例如，每根纤维具有第一末端和第二末端。将每个末端固定在端件中，即第一和第二端件。端件可以是例如本领域已知的对细胞呈惰性且无毒性的树脂或塑料。所述中空纤维的所述第一或第二末端中的至少一个位于端件中，使得该中空纤维的内部空腔与外部环境流体连通。因此，用在端件中的该中空纤维的此类定位，可以引起培养基从该中空纤维的外部环境(即在该中空纤维的外部，但在例如无菌生物反应器的内部)流动进入该中空纤维的内部空腔。[0084]本领域技术人员理解如何将中空纤维组装成模块或筒。此类技术可应用于本发明的中空纤维。简而言之，在纺丝后，将中空纤维切割成一定长度，并且将该纤维的末端被包入(encased)(即灌封(potted))树脂中，该树脂将围绕该纤维末端流动并凝固。有时，该纤维的部分可被包入物质(例如熟石膏或本领域技术人员已知的其它容易移除的材料)中，以封闭该纤维的孔，使得“灌封溶液”，即液体树脂，不进入或堵塞在该纤维中的孔。参见例如vandekar,v.d.,manufacturing of hollow fiber membrane,int’l j sci&res,2015,4:9,pp.1990–1994，和其中引用的参考文献)。在本发明中，“灌封的”纤维束的末端中的一者或二者被修剪或切割，以暴露该纤维的开口的末端，以允许培养基的流动，一旦将纤维束插入至用于在本发明的结构性清洁肉的制备中使用的外壳中。[0085]此外，在一些实施方案中，考虑的是本发明的中空纤维筒具有固定装置，以维持在第一和第二端件之间的需要的距离。这可以是必要的或优选的，例如以用于将本发明的中空纤维筒更容易地插入至例如生物反应器外壳中。[0086]因此，在一个实施方案中，考虑的是，本发明的中空纤维筒容纳以需要的排列方式所排列的大量的中空纤维。本发明的中空纤维具有第一末端和第二末端。通过将所述中空纤维的所述第一末端和所述第二末端固定在第一和第二端件中，来维持该排列。该中空纤维一旦如所述被固定，则被定位成彼此平行、实质上平行或基本上平行。此外，所述第一和第二端件定位成彼此平行、实质上平行或基本上平行。此外，本发明的中空纤维筒的中空纤维被定位成垂直于、实质上垂直于或基本上垂直于本发明的中空纤维筒的端件。该中空纤维筒的直径和长度将取决于所制备的需要的结构性清洁肉制品和生物反应器的配置。[0087]在本发明的一个实施方案中，考虑的是，本发明的中空纤维筒的中空纤维是在约40至约120根/cm2的平均密度下，在约60至约100根/cm2的平均密度下，在约70至约90根/cm2的平均密度下，或上述给定的数值之间的但未具体重复的任何数值的平均密度下。[0088]在本发明的一个实施方案中，考虑的是，在细胞的添加之前，本发明的中空纤维筒中的中空纤维具有在中空纤维之间的空隙空间，并且在该中空纤维之间的所述空隙空间占所述中空纤维筒的总面积的约25％至约75％，或所述中空纤维筒的总面积的约40％至约60％，或上述给定的数值之间的但未具体重复的任何数值。[0089]在本发明的一个实施方案中，考虑的是，将本发明的中空纤维筒设计成可移除地插入至外壳中。也就是说，对于对本发明的结构性清洁肉制品的任何进一步需要的加工，在生产运行的开始时，可以将该筒插入至该外壳中，并在生产运行的结束时，可以将该筒移除即收获。在该结构性清洁肉制品的收获后，可将本发明的新的中空纤维筒插入至该外壳中并重复该过程。在这方面，用于本发明的中空纤维筒的外壳是生物反应器或生物反应器体系的一部分。[0090]反应器配置。本发明不限于任何特定的反应器配置或反应器体系配置，只要可以维持穿过培养物的足够的培养基流动并且将废弃品移除。中空纤维反应器通常为管状，尽管它们可以是卵形、平坦的(如同片材)、矩形或任意其它形状。在一个优选的实施方案中，反应器包含可插入的/可移除的插入物，该插入物包括本发明的中空纤维。在达到汇合的细胞生长(如在本文中所限定)后，可以移除插入物，并通过该插入物的末端的移除和任何进一步需要的加工来最终确定制品。进一步的加工可采取例如切片、表面纹饰(texturing)、添加香料等的形式。可替代地，在收获和装置拆卸之前，可以进行进一步的肉强化。例如，可以将所述培养基从该中空纤维装置中冲洗出来，然后将添加剂直接泵入至该纤维中或泵入该纤维的周围。[0091]合适的反应器体系的非限制性实例。最合适的类型的反应器体系是进料分批体系，尽管考虑的是任何可用的反应器将适合与本发明的中空纤维和中空纤维筒一起使用。例如，体系(milliporesigma，burlington，ma)是商业体系的实例，该商业体系可以容易地转换至与本发明一起使用。在制备结构性清洁肉制品的生物反应器(即包含本发明的中空纤维的反应器)中可接种在另一生物反应器中培育的细胞。正在接种中空纤维装置的生物反应器(适合细胞生长(增殖)和细胞扩增(expansion)的反应器)可以是现有的商业反应器，例如搅拌罐或波动式反应器。增殖/扩增的生物反应器被考虑为例如搅拌罐或波型反应器(如本领域普通技术人员已知的)，并且被考虑为悬浮液、聚结的生物质、微载体培养物或本领域普通技术人员已知的其它合适的反应器。考虑的是，制备反应器(即包含本发明的中空纤维的反应器)可为例如单次使用、多次使用、半连续或连续的。本发明另外考虑包含本发明的中空纤维的多个反应器的歧管。[0092]因此，考虑的是，本发明的示例性反应器体系包含一个或多个本发明的中空纤维筒、具有容纳所述中空纤维筒的尺寸的外壳；与在该外壳中的一个或多个入口流体连通的培养基来源；在该外壳中的一个或多个培养基出口；和一个或多个泵，以通过所述培养基的一个或多个入口和/或一个或多个出口向所述中空纤维筒供应该培养基和/或从所述中空纤维筒移除废弃培养基。此外，所述入口与该中空纤维的内部流体连通。还此外，该中空纤维生物反应器可包含自动控制器或自动控制体系。[0093]本发明还考虑肉制品的制备方法，其包括：在本发明的中空纤维反应器中的中空纤维之间的空隙空间中以例如100,000细胞至100,000,000(105至108)细胞的密度(radisic,et al.,biotechnol bioeng,2003may 20:82(4):403-414)接种肌细胞、如同肌细胞的细胞或表达一种或多种如同肌细胞的特征的工程细胞中的一种或多种，和培养所述细胞直至达到约80％至约99％的汇合度、85％至约99％的汇合度、约90％至约99％的汇合度、约95％至约99％的汇合度、约98％至约99％的汇合度或约100％的汇合度(或所述百分比值之间的任何数值)，分别从所述中空纤维的所述第一末端和第二末端移除所述第一保持装置和所述第二保持装置。2018,“engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue”nat commun.,9(1):1–12)，并且为本领域普通技术人员所熟知。[0105]除非另有限定，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。[0106]当介绍本公开或本公开的一个或多个优选的实施方案中的元素时，冠词“一”、“一个”、“该”和“所述”旨在表示存在一个或多个元素。术语“包括”、“包含”和“具有”旨在是包容性，并且意味着除了所列元素之外可存在额外的元素。[0107]过渡短语“包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”具有在mpep 2111.03(manual of patent examining procedure；united states patent and trademark office)中给出的含义；使用过渡短语“基本上由…组成”的任意权利要求将被理解为仅列举本发明的必要元素，在从属权利要求中列举的任何其它元素被理解为对它们从属的权利要求中所列举的发明而言是非必要的。[0108]所有范围包括引用范围内的所有数值，包括包容性的所有整数、分数和十进制数。[0109]实施例[0110]实施例1a[0111]本发明的中空纤维的制备的预见性范例。[0112]将玉米蛋白、面筋和藻酸盐的共混物混合至甘油和乙醇的溶剂共混物中。然后，通过具有0.5μm的内径的加热的喷丝头，将该粘性混合物挤出。在离开该喷嘴时，富溶剂的纤维浸入水浴中，完成中空纤维的相分离。在复卷期间的所述纤维上的张力造成牵拉效应进一步使该纤维结构化。然后，在该纤维处于平行取向的情况下切割该纤维的线卷，产生纤维束。然后，将该纤维束从该处插入所述筒中，灌封，然后切割。额外的封端步骤完成通过空腔的流体路径。[0113]含有中空部分的装置可以是以或者圆柱形(筒式)形式或者矩形(盒式)形式。在该两种配置中，在开始灌封步骤前，中空纤维将按要求取向。在芯周围可包裹(wrap)该中空纤维，以辅助在该纤维周围的培养基的流动。作为芯组件的替代，在外部的外壳和该中空纤维之间可以使用扩散阻隔。灌封材料可以是与该中空纤维相同的材料或另一经gras批准的材料；或可替代地，食品级合成聚合物。该灌封材料的凝固可以是热固性的或热塑性的。在将封端(endcap)结合至外壳之前，将存在某些切割程序以暴露该中空纤维的所有开口的末端。该封端会具有该纤维的空腔的入口/出口。在该纤维周围的流体路径的入口/出口可被整合入至所述外壳或所述封端中。[0114]实施例1b[0115]本发明的示例性中空纤维的制备的范例[0116]玉米蛋白在乙醇中的溶解度使它成为来自该应用中的受关注的材料。不幸的是，由于它在水浴中的部分溶解性，它在基于挤出的相分离技术中会效果很差。本发明人考虑了这样的体系，其中玉米蛋白是一种组分，并且使用了第二聚合物例如藻酸盐、脱乙酰壳多糖或纤维素以辅助设立三维结构。然而，此类亲水性和疏水性聚合物的共混是困难的。[0117]藻酸盐可以用乙醇沉淀出来。本发明人发现了2％的藻酸盐在约25％的乙醇中开始凝胶化。本发明人考虑了这样的体系，其中醇类被包含至或者纺丝浴或者聚合物纺丝液(polymer dope)本身中，据信将有助于孔形成性能，可能增加终端制品的孔径。[0118]藻酸盐和蛋白体系：[0119]使该体系如此令人惊讶和出人意料的是这样的能力，该能力能够在大量的蛋白内容物中混合并且在不使用苛刻的溶剂、酸或碱的情况下仍然能够立即凝固中空纤维结构。[0120]本发明人通过称取2g藻酸钠的干组分、7g蛋白粉末和具有15g/l的氯化钙作为交联剂的91g的水或缓冲液来制备混合物。得到2:7的藻酸盐:蛋白的固体比率。另外也得到藻酸盐:蛋白的比率为2:0、2:2、2:4、2:5、2:7、2:9。该体系可被推进至甚至更高的蛋白比率，并且该蛋白可具有植物或动物源。如在图8中示出，此处示例的蛋白样品为(从左至右依次为)大豆酸解产物、牛肉蛋白分离物、乳清蛋白分离物、糙米蛋白分离物、豌豆蛋白分离物、大豆蛋白分离物。虽然未显示，但我们也已用南瓜蛋白分离物、葵花籽蛋白分离物等实验。[0121]此类组合通过均化器混合，然后在40℃下混合(hybridizer)过夜。据观测，从所观看到的透明度的水平来看，衍生自动物的蛋白具有溶解潜力。这可能是由于植物蛋白分离物中的非溶解性组分(通常少于10％的固体)。[0122]经由注射泵通过来自ramé‑hart instrument co.(succasunna，nj)的同轴针，挤出了此类蛋白分离物。所使用的凝固浴是具有15g/l的氯化钙的milliq水(milliporesigma，bedford，ma)。在钙浴中放置几分钟后，将该纤维移除，并在milliq水中冲洗。一旦冲洗后，则将它们浸入milliq水的广口瓶中，并在126℃下高压灭菌一小时。[0123]本发明人接下来使用了不具有蛋白内容物(即不含蛋白)的藻酸盐纤维以证实是否有来自热处理/高压灭菌的影响。该纤维的固体含量为100％的藻酸盐。在图9示出的更大的广口瓶经过了高压灭菌，其中更小的广口瓶未经过高压灭菌。由于经高压灭菌的纤维变白，可以得出结论，光不再穿过它们，表明存在聚合物链的结构性变化。[0124]图12-25示出sem，示出本实施例中的可食用的中空纤维的多孔本质。出人意料的是，每种此类混合物会具有显著不同的表面结构、剥皮效果(skinning effect)、表面孔隙率以及内部孔隙率。基于植物的蛋白分离物倾向于在整个纤维表面上具有宏观的空隙，该宏观的空隙预期是由从表面上去除的不溶粒子而形成。这些数据还表明，令人惊讶和出人意料的是，通过改变蛋白的来源或组合(即一种或多种)蛋白，可以控制表面结构和孔径。[0125]图10示出纤维的外径和内径。经由通过同轴针的纺丝液流速，控制了纤维的外径和内径。通过喷嘴直径、流速、离所述浴的距离和理论上在纤维上的拉伸/张力，调整了该纤维的直径。图11显示出，制成的纤维可以容易地支持它们的湿重，因为它们将需要进入生物反应器。在图11示出的实例具有2米的纤维，但是可以制备更长的纤维，并且可以支持它们自身的重量。[0126]实施例1c[0127]在本发明的中空纤维上的细胞生长。[0128]将如在实施例1b中详述的所制备的包含牛肉蛋白:藻酸盐、糙米蛋白:藻酸盐或豌豆蛋白:藻酸盐的中空纤维用pbs洗涤，并与dmem/f12、1x谷氨酰胺和10％的胎牛血清(fbs)在15ml锥形管中被培养过夜。以100,000个细胞/2ml接种了c2c12细胞(鼠肌肉细胞系，atcc，manassas，va)。将细胞培育了6天，并在3天和6天的两个时间点分析了该细胞。通过atp生成(2.0细胞活力检测，目录编号g9421，promega，madison，wi)检测了细胞生长。读数是以原始发光单元(rlu)表示，结果是相对的且线性的。参见图26，其中示出第3天的数据。每种中空纤维配制物(牛肉:藻酸盐、水稻:藻酸盐、豌豆:藻酸盐)在两个不同的生产运行中被制备，并在数据中被表示为1或2。一式三份地运行每个条件。条形表示标准偏差。糙米:藻酸盐混合物显示出支持强劲的细胞生长。牛肉蛋白:藻酸盐和豌豆蛋白:藻酸盐混合物也支持细胞生长。[0129]在根据本发明的方案制备的糙米蛋白:藻酸盐中空纤维上的细胞生长和细胞附着是其它纤维和生产运行的表示。图27示出在细胞培养的第3天运行用糙米:藻酸盐1中空纤维制成的中空纤维上的细胞附着和生长。图27a示出使用live/deadtm细胞成像试剂盒(thermofisher，waltham，ma)的对活细胞和死细胞二者的染色，其中活细胞用celltracetm钙黄绿素绿色，am检测，而死细胞用bobotm-3碘化物检测。图27b示出用钙黄绿素绿色，am对活细胞的染色，而图27c示出同一视野中的用bobotm-3对死细胞的染色。从该组合的图像中明显的是，活细胞占细胞团的显著的大部分。该实施例表明，本发明的中空纤维支持细胞附着和生长。[0130]实施例2[0131]本发明的筒的设计的预见性范例。[0132]所述筒被工程改造至具有特定的流体路径。第一流体路径具有允许培养基排他地穿过所述纤维的入口和出口。该流体路径被连通至特定的培养基贮存器。第二流体路径被设计以用于在该纤维周围的单向流动。两个入口位于一个封端上，而两个出口位于另一封端上。为了产生均质流，芯位于该筒的中心，其中在该筒的芯壁和外壳之间存在大致相同数量的纤维。该筒的长度是基于中空纤维的内径和壁厚而设计的，以优化整个筒内的细胞生长的均匀性。[0133]实施例3[0134]将本发明的中空纤维组装至本发明的生物反应器中的预见性范例。[0135]该装置在它被实施至整个细胞生长体系中之后被视为生物反应器。如先前的实施例中所述，用两条单独的流体路径将所述中空纤维生物反应器铺设(plumb)进至所述体系中。第一个描述的流体路径在该反应器中围绕所述纤维均匀移动。该流体路径负责在可食用的中空纤维的表面上接种细胞。在接种过程完成后，该流体路径具有培养基穿过所述筒和围绕所述中空纤维的层流。该流体路径是可调节的，以防止细胞从所述纤维表面移除。第二流体路径是穿过所述中空纤维的空腔。通过平衡在该筒内的纤维长径比、纤维计数和流速，细胞密度梯度被最小化，从而允许基本上均匀的细胞团的形成。[0136]实施例4[0137]利用本发明的中空纤维的实施方案的反应器的预见性范例。在该实施例中，将包含中空纤维的反应器组装成具有约83根纤维/cm3的中空纤维设备，该中空纤维包含藻酸盐或类似的材料，具有1.1mm至1.2mm的外径和0.1mm的壁厚。在该反应器中接种衍生自ipsc的细胞，并被编程以分化为具有肌细胞形态特征的细胞。以107/cm3的密度接种该细胞。在仍处于扩增培养基中或已经处于促进分化的培养基中时，可以接种经接种的所述细胞。在接种所述细胞后，培养基将是如同肌细胞的细胞所偏好的培养基。将反应器无菌地连通至培养基供应源，并基于接种密度和细胞类型运行14至21天，直至获得细胞汇合度，所述细胞汇合度在此被限定为小于10％的在所述纤维之间的自由空间，并且细胞形成了如同肌细胞的特征，包括形成粘附至所述中空纤维的如同肌管的结构。此时，将细胞/中空纤维混合物从反应器中移除，并且如果有的话用于进一步的加工，和最后用于消费。[0138]实施例5[0139]利用本发明的中空纤维的实施方案的第二反应器的预见性范例。在该实施例中，将包含中空纤维的反应器组装成约83根纤维/cm3的中空纤维设备，该中空纤维包含藻酸盐或类似的材料，具有1.1mm至1.2mm的外径，0.1mm的壁厚。在该反应器中接种衍生自ipsc的细胞，并被编程至分化为具有肌细胞形态特征的细胞，或被编程至分化为具有脂肪细胞特征的细胞，以约90:10的比率的被编程至分化成具有肌细胞形态特征的细胞:被编程至分化为具有脂肪细胞特征的细胞。所述细胞以107/cm3的总密度来接种。将所述反应器无菌地连通至培养基供应源并运行14至21天，直至获得细胞汇合度，所述细胞汇合度此处被限定为小于10％的在所述纤维之间的自由空间，并且细胞形成了如同肌细胞的特征，包括形成粘附至中空纤维的如同肌管的结构。此时，将细胞/中空纤维混合物从反应器中移除，并且如果有的话用于进一步的加工，和最后用于消费。[0140]实施例6[0141]在达到一定的细胞培养物的汇合度后，将脂肪、香料等加入至所述中空纤维的空腔中的预见性范例。在本发明的培养的结构性清洁肉制品达到所需的汇合度后，将残留的培养基冲洗掉，并用例如盐溶液灌注该制品。该盐溶液的浓度通过例如终端制品所需的含盐量来确定。如果需要加盐的肉制品，则用更高浓度的一种或多种盐灌注本发明的结构性清洁肉制品，或如果需要未加盐的肉制品，则用接近零的更低浓度的盐灌注。此外，根据需要和根据最终制品所确定，将脂肪、香料、防腐剂等灌注至本发明的培养的结构性清洁肉制品的空隙空间和中空纤维空腔中。[0142]实施例7[0143]显示出收获的细胞/中空纤维的加工的预见性范例。一旦通过本发明的培养方法制备培养的肉制品(即“结构性清洁肉”)，并且任何需要的香料、脂肪或其它添加剂被灌注至所述中空纤维的空腔和/或剩余的空隙空间中，则将本发明的中空纤维筒从外壳中移除。然后，对所述中空纤维筒进行进一步加工。至少，从所述中空纤维筒中移除第一和第二端件，使培养的结构性清洁肉制品在本发明的中空纤维上是完整无缺的。然后，所述结构性清洁肉制品可被切片、涂饰、调味或进一步调味等，并根据需要被包装成或者批发或零售。









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