一种高活性的重组人纤连蛋白及其制备方法和应用与流程 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种高活性的重组人纤连蛋白及其制备方法和应用。背景技术：2.纤连蛋白（fibronectin，fn）是高分子量糖蛋白，含糖4.5%-9.5%，其亚单位相对分子质量为22万－25万，是一种多功能的糖蛋白，在血浆中含量丰富，广泛分布于细胞外基质中，主要功能是介导细胞粘着。纯化的纤连蛋白可增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连。通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展。在胚胎发生过程中，纤连蛋白对于许多类型细胞的迁移和分化是必需的。在创伤修复中，纤连蛋白亦是重要的。在血凝块形成过程中，纤连蛋白促进血小板附着于血管受损部位。因此，纤连蛋白在医学、美容、护肤领域有广泛的应用前景。虽然动物组织、血液中含有纤连蛋白，但是含量极为有限，因此，组织来源的纤连蛋白存在产量低、成本高、产品纯度低的缺点。重组dna技术通过构建线路蛋白基因的表达载体，在原核或者真核生物中表达、制备高纯度的纤连蛋白。纤连蛋白单体约220～250kda，分子量较大，较长片段蛋白的重组表达效率往往较低，因此，现有的重组人fn蛋白片段均选择纤连蛋白上的部分结构域，通过重组dna技术制备含有纤连蛋白部分结构域，这些短片段表达的终产物大小在15-65kd，具有纤连蛋白的生物学活性。因此，如何筛选纤连蛋白的活性结构域进行重构，获得高活性、高稳定性的纤连蛋白是制约纤连蛋白应用的关键技术之一。此外，重组蛋白异源表达时，往往表达量低、活性低、可溶性低、纯度低，这也是制约纤连蛋白应用的另一关键技术。因此，如何设计fn功能结构域截短体的序列、提高表达效率、增强溶解性、活性和纯度，是亟待解决的技术问题。技术实现要素：3.针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种高活性的重组人纤连蛋白及其制备方法和应用。4.本发明提供一种高活性的重组人纤连蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示，为截短突变体，大小约为150kd。5.本发明还提供一种高活性的重组人纤连蛋白的编码序列，其核苷酸序列如seq id no.2所示。seq id no.2为原核密码子优化后的序列，seq id no.2所示的核苷酸序列表达后得到如seq id no.1所示的蛋白。6.本发明还提供所述的高活性的重组人纤连蛋白的制备方法，包括如下步骤：对人纤连蛋白全长进行大肠杆菌密码子优化，并进行全基因合成，设计的功能结构域截短体的编码序列如seq id no.2所示，利用宿主表达系统进行诱导表达，用标签进行纯化，收获所述高活性的重组人纤连蛋白。宿主表达系统如大肠杆菌表达系统。7.进一步的，所述的诱导表达步骤如下：挑取重组菌种单克隆至含有抗生素的培养基中，37℃摇床孵育过夜，稀释菌液，37℃摇床孵育至菌液od值为1-2，加入诱导剂诱导蛋白的表达，加入诱导剂后，摇床的温度降为16-30℃，诱导过夜；离心收集菌体，用裂解缓冲液重悬菌体，重悬后对菌体进行均质破碎；破碎后，裂解溶液进行离心取上清，滤膜过滤去除杂质，对裂解液上清进行超滤浓缩。所述诱导剂为iptg或阿拉伯糖。8.进一步的，所述裂解缓冲液中含20mm 磷酸盐缓冲液，nacl含量为0-300mm，ph值为7.2-7.8。9.进一步的，所述重悬菌体的操作中菌体与缓冲液重悬比例为1:10-1:40 w/v。10.进一步的，所述的纯化步骤如下：超滤浓缩后的重组人纤连蛋白进行亲和层析，上样缓冲液使用咪唑浓度梯度洗脱方式洗涤，将重组人纤连蛋白洗脱，电泳检测其各峰中重组人纤连蛋白的含量与纯度；超滤系统以pbs置换缓冲液除内毒素，并浓缩目的重组人纤连蛋白。11.进一步的，所述上样缓冲液含有20-50mm咪唑，使用50-500mm咪唑浓度梯度洗脱方式洗涤。12.本发明还提供所述高活性的重组人纤连蛋白在制备化妆品原料中的应用。13.本发明还提供所述高活性的重组人纤连蛋白在制备细胞培养试剂中的应用。14.综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：（1）现有技术表达的重组蛋白都是65kd以下的功能域蛋白，本发明表达的重组人纤连蛋白含有更为完整的功能结构域区段，最终蛋白大小约为150kd，提高了重组蛋白的活性。15.（2）本发明对于基因序列进行了大肠杆菌偏好密码子优化，提高大片段的重组fn蛋白的表达量，如图1。图中，hfn为以人的细胞的cdna为模板，pcr扩增与rehfn氨基酸序列相同的区段，并克隆到原核表达载体中进行表达。rehfn为针对大肠杆菌进行了原核密码子优化后的序列，基因合成并克隆到原核表达载体中进行表达。其中0h，2h，4h表示诱导时间。对比hfn和rehfn的表达情况，可以显著看出，优化后的重组fn表达效果显著强于未优化的基因序列表达量（分子量130-180kd之间的条带）。16.（3）本发明采用优化的培养条件和裂解缓冲体系，提高大肠杆菌表达的较大片段的重组人fn蛋白的可溶性，因为可溶性提高，省略了变复性步骤，简化了纯化步骤，提高了蛋白收率。17.（4）采用以聚丙烯酸酯微球为基质材料的ni-nta填料进行亲和层析，达到单步纯化即可收获高纯度的重组人fn蛋白。附图说明18.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。19.图1为人源序列载体与优化后序列载体表达情况对比；图2为本发明提出的重组人fn蛋白表达和纯化流程示意图；图3为本发明实施例2的sds-page凝胶电泳检测重组人fn蛋白的表达；图4为本发明实施例4的sds-page检测重组人fn蛋白的纯化情况；图5为本发明实施例4的样品高效液相色谱检测结果；图6为本发明实施例5的重组人fn蛋白促细胞粘附状态显微观察照片；图7为本发明实施例5的重组人fn蛋白促细胞粘附的cck8试验检测结果；图8为本发明实施例5的重组人fn蛋白促进细胞增殖活力实验中，48h时的cck8检测结果；图9为本发明实施例5的重组人fn蛋白细胞增殖活性浓度梯度与时间梯度实验检测结果。具体实施方式20.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。21.为了提高fn的表达效率，本发明对人纤维粘连蛋白fn全长进行大肠杆菌密码子优化，并进行全基因合成，设计的fn功能结构域截短体极大地保留了fn蛋白与细胞相作用区段及相关功能结构域，其最终蛋白大小约为150kd。利用大肠杆菌表达系统进行表达，用his标签进行纯化，收获高纯度且能够更好激活细胞增殖、粘附以及迁移能力的重组人fn蛋白。22.蛋白片段大容易不可溶，诱导表达强度高，蛋白产生速度过快，容易不可溶。本发明利用特有的序列设计，优化后的培养条件和缓冲体系，提高了大片段重组人fn蛋白的可溶性，收获了纯度约为95%的重组fn蛋白，且相比其他重组蛋白以及动物源提取的fn蛋白具有更好的活性。23.实施例1重组人fn序列设计与载体构建根据uniprot蛋白数据库中fibronectin（finc_human, p02751）蛋白氨基酸序列数据，以及ncbi中对应的人cds基因数据，将核苷酸序列设计优化为具有大肠杆菌偏好密码子的核苷酸序列并克隆到大肠杆菌表达载体中，该载体可以是但不限于pet28a，pbad-kan等，以pet28a载体为例，选用的酶切位点为ndei和hindiii。测序确认克隆到载体中的序列的正确性，并将密码子优化后的蛋白表达载体转化到表达用大肠杆菌bl21（de3）或bl21-ai中。挑选测序正确的单克隆菌株将转化有重组人fn蛋白的菌种建库，并命名为re-hfn-bl21（de3）。24.实施例2载体构建与重组人fn蛋白的表达将基因合成并组成dna双链结构重组人fn蛋白密码子优化基因的片段克隆到pet28a(+)原核表达载体中，选用酶切位点为ndei和hindiii，将质粒转化到大肠杆菌dh5α细胞中，扩增并提取质粒。再将质粒转入表达用大肠杆菌bl-21（de3）或bl21-ai中，命名为rehfn-de3或rehfn-ai，挑取单克隆，37℃培养10小时，以1%接种到新的含有卡那霉素的培养基中，培养3-4小时，待大肠杆菌的od600值达到约为0.8-1.2时，加入iptg进行诱导，此时，将摇床或发酵罐温度降为23℃，诱导过夜（约8-10小时），收集菌体，均质破碎后，sds-page凝胶电泳检测蛋白的表达情况，结果如图3所示。用两个不同的诱导方法分别选择3个菌落，分别进行诱导表达，收取和称重诱导前后大肠杆菌样品，调整上样比例使样品中所含大肠杆菌菌量一致。从图中可以看出，对照组与实验组上样菌量基本相同（杂蛋白条带浓度），而目的蛋白的表达量明显较高。25.实施例3重组人fn蛋白的破细胞与粗提取挑取重组菌种re-hfn-bl21（de3）单克隆至5ml含有硫酸卡那霉素的培养基中，37℃摇床转速200rpm孵育过夜，按照1：100的比例将菌液接入具挡摇瓶中，37℃摇床转速200rpm孵育至菌液od值为1-2左右，加入iptg或阿拉伯糖，诱导蛋白的表达，加入诱导剂后，采用特殊的低温诱导形式，将摇床的温度降为16-30℃，诱导过夜。离心收集菌体，用裂解缓冲液（其中含20mm 磷酸盐缓冲液，nacl含量为0-300 mm，其ph值7.2-7.8）重悬菌体（菌体与缓冲液重悬比例为1:20 w/v），重悬后用均质破碎机对菌体进行均质破碎。破碎后，裂解溶液进行离心取上清，0.45μm滤膜过滤去除杂质，并选用100kd超滤膜包对裂解液上清进行超滤浓缩。26.实施例4重组人fn蛋白层析纯化超滤浓缩后的蛋白用聚丙烯酸酯微球为基质材料的ni-nta填料进行亲和层析，上样缓冲液含有20-50mm咪唑，50-500mm咪唑浓度梯度洗脱方式洗涤并洗脱将重组fn蛋白洗脱，sds-page凝胶电泳检测其各峰中fn蛋白的含量与纯度。100kd超滤系统以pbs置换缓冲液除内毒素，并浓缩目的fn蛋白。sds-page检测纯化后重组人fn蛋白re-hfn蛋白的纯度，结果如图4所示，sds-page凝胶泳道图像显示，纯化后蛋白主带明显，且无显著的杂带说明蛋白纯度很高，纯度约为95%，如图5高效液相色谱图谱结果所示，最高的主峰占比约为95%。内毒素测定结果显示，内毒素小于1eu/μg。27.实施例5重组人fn蛋白细胞生物学活性检测（一）细胞粘附收获的重组人fn蛋白re-hfn按照20μg/ml浓度处理细胞培养板，以蛋白溶液处理作为对照，每组设8个复孔，2个非洗涤对照孔，观测fn对于细胞粘附性质的影响。实验方法：以20μg/ml的重组人fn蛋白包被96孔板，37℃或室温处理1小时，吸去蛋白溶液后用1%的无菌bsa室温封闭半小时。hela细胞用无血清培养基重悬，96板每孔铺2万个细胞，37℃培养1.5小时后，每孔用pbs洗3次，加入完全培养基观测拍照细胞粘附状态，培养12小时后，cck8检测细胞活性状态。结果显示，所收获的重组人fn蛋白re-hfn对于细胞粘附有显著促进作用，如图6和图7所示。在图6中，可以明显看到，pbs洗涤后，对照组孔内残余细胞很少，而重组人fn蛋白包被组孔内细胞几乎全部都在。在图7中可以看到，cck8细胞活性检测结果显示，重组人fn蛋白处理组细胞活力显著高于对照组，a450吸光度的值约为对照组的15倍，结合细胞影像结果，两者均证明重组人fn蛋白re-hfn具有良好的促进细胞黏附的活性。28.（二）细胞增殖收获的重组人fn蛋白按照浓度200μg/ml处理细胞，以相同浓度的血浆fn蛋白以及缓冲液处理作为阴性对照，培养48h进行cck8检测fn对于细胞增殖的影响。结果如图8所示，重组人fn蛋白re-hfn对于细胞增殖具有促进作用，且效果优于血浆fn蛋白pfn。29.（三）不同浓度rhfn蛋白对于细胞增殖的影响收获的重组人fn蛋白按照浓度0，100，500，1000 μg/ml的浓度加入每孔约4000个hela细胞的96孔板中培养细胞，每种浓度处理的细胞分别培养24h，48h和72h，对于48h和72h培养的细胞，检测前每日换液。在培养24h，48h，72h分别加入cck8试剂，2h后读取a450吸光值，判定细胞增殖活力。结果如图9所示，所有浓度的re-hfn对于hela细胞增殖均有促进作用，并且高浓度re-hfn没有细胞毒性。100μg/ml和500μg/ml浓度下对于细胞具有持续的良好促进细胞增殖的作用，且浓度越高效果越好，而1000μg/ml浓度下，对于细胞的促进作用并不如500μg/ml，其中原因可能是由于1000μg/ml浓度下，使用的re-hfn原液量较大，对于培养基有一定的稀释作用。因此在实际使用时，100-500μg/ml已经可以达到较好的促进效果。30.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。31.序列表seq id no.1 （功能结构域截短体蛋白氨基酸序列）mgsshhhhhhssglvprgshmlspptnlhleanpdtgvltvswersttpditgyritttptngqqgnsleevvhadqssctfdnlspgleynvsvytvkddkesvpisdtiipevpqltdlsfvditdssiglrwtplnsstiigyritvvaagegipifedfvdssvgyytvtglepgidydisvitlinggesapttltqqtavppptdlrftnigpdtmrvtwapppsidltnflvryspvkneedvaelsispsdnavvltnllpgteyvvsvssvyeqhestplrgrqktgldsptgidfsditansftvhwiapratitgyrirhhpehfsgrpredrvphsrnsitltnltpgteyvvsivalngreesplligqqstvsdvprdlevvaatptslliswdapavtvryyritygetggnspvqeftvpgskstatisglkpgvdytitvyavtgrgdspasskpisinyrteidkpsqmqvtdvqdnsisvkwlpssspvtgyrvtttpkngpgptktktagpdqtemtieglqptveyvvsvyaqnpsgesqplvqtavtnidrpkglaftdvdvdsikiawespqgqvsryrvtysspedgihelfpapdgeedtaelqglrpgseytvsvvalhddmesqpligtqstaipaptdlkftqvtptslsaqwtppnvqltgyrvrvtpkektgpmkeinlapdsssvvvsglmvatkyevsvyalkdtltsrpaqgvvttlenvspprrarvtdatettitiswrtktetitgfqvdavpangqtpiqrtikpdvrsytitglqpgtdykiylytlndnarsspvvidastaidapsnlrflattpnsllvswqppraritgyiikyekpgspprevvprprpgvteatitglepgteytiyvialknnqksepligrkktdelpqlvtlphpnlhgpeildvpstvqktpfvthpgydtgngiqlpgtsgqqpsvgqqmifeehgfrrttppttatpirhrprpyppnvgeeiqighipredvdyhlyphgpglnpnastgqealsqttiswapfqdtseyiischpvgtdeeplqfrvpgtstsatltgltrgatynvivealkdqqrhkvreevvtvgnsvneiklaaalehhhhhhseq id no.2（功能结构域截短体蛋白对应插入基因片段序列）catatgctgtctccgccgaccaaccttcacctggaggcgaatccggacaccggcgttctgactgtaagctgggagcgttccaccaccccggacattaccggctaccgcataaccactacgcctacgaacggtcagcaaggcaattcgctggaggaagttgtgcacgccgaccagagctcttgcactttcgacaacctgagcccgggtcttgaatataatgtctcagtgtacacggttaaagatgataaagaatccgttccgatttctgacacaattatcccagaggttccacagctgacggatttgtccttcgtagacatcaccgatagctccattggcctccgttggaccccactgaattcctctaccatcattggctaccgtattacggttgtcgctgccggtgagggcatcccgattttcgaggactttgttgacagctccgttggatattataccgttaccggtttggaaccgggcatcgattacgacatttccgtaatcactttaatcaacggcggtgagagtgccccaaccaccctaacccagcagactgcggttccgccgcctaccgacctgcgttttacaaatattggcccggacaccatgcgtgtcacatgggcaccgccgccgagcatcgacctgacgaactttctggttcgttattctccggttaagaacgaagaagacgtcgcagaactgtctatttcaccgagcgacaacgccgtggtgctcactaacctgctgccgggtactgagtatgtggtttctgtgagcagtgtctatgaacagcatgaaagcaccccgctgcgggggcgtcagaagaccggcctagactccccaaccgggatcgacttcagcgacattactgctaactccttcacggtgcattggattgcgccgcgtgctaccatcaccggataccgtattcgtcatcatccggagcacttcagcggtcgcccccgggaggaccgtgttcctcacagccgtaattccattacgctgaccaacttgacaccgggtacggaatatgtagtttccatcgttgcgctgaatggccgtgaagagagccccctcctgatcggacaacagagcaccgtttctgacgtaccgcgcgacctggaggttgtcgccgcaacccccaccagcctgttgatttcatgggatgcgccggcagtgaccgttcgatactatcgcatcacctacggcgaaaccggcggcaactccccggtgcaggagtttaccgtcccgggttcgaaaagcacggctacgattagcgggctgaagccgggtgttgattatacgatcactgtttacgccgtgaccggtagaggcgactccccggcgtcctcaaagcccatctcgatcaactaccgtaccgagattgacaagccgagccaaatgcaggtcaccgatgttcaagacaacagcatttccgttaaatggctgccgtcctcctcaccagtcaccgggtaccgcgtgacaactaccccgaagaacgggccgggtccgaccaaaaccaagacggctggtcccgaccaaaccgagatgaccattgagggacttcaaccgaccgtagagtacgtggtctccgtttatgcgcagaacccaagcggagaaagccaaccgctggtgcagaccgccgttaccaatatcgaccgtccaaaaggtctcgcgtttaccgatgtcgatgtcgacagcattaagattgcgtgggagtcaccgcagggtcaggtgagccgctatcgtgtgacgtattcctctccggaagacggaattcatgagctgtttccggcgcctgacggcgaggaggacacagcggagctgcagggtttacgaccgggttcggagtacaccgtgagtgtcgttgcgttgcacgatgacatggagagccagccattaattggtacccaaagcaccgcgattccggcgccgaccgatttaaagttcacccaagttaccccaacctccctctccgctcaatggaccccgccgaatgttcagctgaccggttaccgtgtccgtgttacgccgaaagagaagaccggtccgatgaaagagatcaatctggcgccggattcctcttctgtggtggtgtccggtctgatggttgctaccaagtacgaggttagtgtgtatgcgctgaaggataccctgacctctagacctgcgcagggtgtagtgaccaccctggaaaacgtgagcccccccaggcgtgcacgtgtgactgatgcgaccgaaaccaccatcaccattagctggcgcaccaagaccgagactattacaggttttcaggttgatgcagtgcctgcgaatggccaaacgccgatccagcgtaccattaagccggacgttcgtagctacaccatcaccggtctacaaccgggcaccgactataaaatttacctgtacacccttaacgataatgctcgttcgtcaccagttgtcatcgacgccagcacggcgattgatgccccgagcaacctgcgttttctggccacgactccgaatagcttgttagttagctggcagccgccacgagcgcgtattactggttacattattaagtacgaaaaaccgggttcaccaccgcgagaagtggtcccgcgtccgcgtccgggggtgaccgaggcgacgatcacgggtctggaaccgggtaccgaatacaccatttatgttatagctttgaagaataatcagaagagcgaaccgctgattggtagaaaaaaaaccgacgaacttccgcaactggttacccttccgcatcctaacctgcacggtccggaaatcctggatgtaccgagcacggttcaaaagaccccgtttgtgacacatcctggttatgataccggcaacggcatccagctgccgggcaccagtggtcagcaaccgtctgtaggccagcaaatgatttttgaagagcacgggtttcgtcgtaccacgccaccgaccaccgctaccccgattcgtcatcgtccgcgcccgtatccgccgaacgtgggtgaggagattcaaatcggtcacattcctcgggaggatgtggactatcacctgtatccgcatggtccggggctcaacccgaatgcgtctactggccaagaggcgcttagccagaccaccattagctgggcaccgttccaggatacctcggagtacatcatctcctgtcacccggtaggtacggacgaggaaccgctgcaatttagggttccgggcacgagcacctctgcgaccctgaccgggctgactcgcggcgcgacctataacgtgatcgttgaagcgcttaaggatcaacaacgccataaagttcgtgaggaagtggtaactgtgggtaatagtgtgaacgagattaagctt









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