ZmWIK-ZmBLK1-ZmRBOH4免疫信号通路蛋白在植物抗灰斑病中的应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术zmwik-zmblk1-zmrboh4免疫信号通路蛋白在植物抗灰斑病中的应用技术领域1.本技术涉及zmwik-zmblk1-zmrboh4免疫信号通路蛋白在植物抗灰斑病中的应用。背景技术：2.玉米病害是影响玉米产量和质量的重要因素，其中玉米灰斑病(gray leafspot，gls)是由玉蜀黍尾孢菌(cercosporazeae-maydis)和玉米尾胞菌(cercospora zeina)引起的一种全球性真菌病害，该病使叶片损伤和凋萎导致光合组织丧失功能，最终引起产量的损失。近年来，灰斑病已经成为我国玉米生产上主要的叶部病害之一，具有传染迅速、危害严重的特点，难于控制等特点，严重危害我国玉米生产安全。3.目前，玉米灰斑病的防治主要以化学防治为主。化学防治会增加生产成本，并对生态环境造成污染，不利于农业绿色和可持续发展。技术实现要素：4.基于上述问题，本身请提供了zmwik-zmblk1-zmrboh4免疫信号通路相关蛋白及其生物材料在植物抗灰斑病中的应用。解决的技术问题是提高植物灰斑病抗性，尤其是玉米。5.为了解决上述问题，本技术提供了下述应用。6.蛋白质、调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控所述蛋白质的活性或含量的物质在调控植物灰斑病抗性和/或制备调控植物灰斑病抗性产品和/或植物育种中的用途，所述蛋白质为zmwik蛋白、zmrboh4蛋白和zmblk1蛋白中的至少一种：7.所述zmwik蛋白为如下任一种：8.a1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；9.a2)将a1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具调控植物灰斑病抗性的蛋白质；10.a3)将a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；11.所述zmblk1蛋白为如下任一种：12.b1)氨基酸序列是序列9所示的蛋白质；13.b2)将b1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具调控植物灰斑病抗性的蛋白质；14.b3)将b1)或b2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质；15.所述zmrboh4蛋白为如下任一种：16.c1)氨基酸序列是序列12所示的蛋白质；17.c2)将c1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与c1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具调控植物灰斑病抗性的蛋白质；18.c3)将c1)或c2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。19.seq id no.3所述的氨基酸序列(zmwik蛋白)具体如下：20.mgsflwkqpsylfiliilhlvaheartlssdgeallafkkavtnsdgvflnwreqdadpcnwkgvrcdshskrvidlilayhrlvgpippeigklnqlqtlslqgnslygslppelgnctklqqlylqgnylsgyipsefgdlvelealdlssntlsgsvphsldklskltlfnvsmnfltgaipssgslvnfnetsfvgnlglcgkqinlvckdalqsssnglqspspddminkrngknstrlvisavatvgalllvalmcfwgcflyknfgkkdmrgfrvelcggssvvmfhgdlpysskdilkkletideeniigaggfgtvyklamddgnvfalkrivktnegldrffdreleilgsvkhrylvnlrgycnspssklliydylqggsldevlhekseqldwdariniilgaakglsylhhdcspriihrdikssnilldgsfearvsdfglaklledeeshittivagtfgylapeymqfgratektdvysfgvlvleilsgkrptdasfiekglnivgwlnflasenrereivdlncegvqtetldallslakqcvssspeerptmhrvvhmlesdvitpcpsdfydse21.seq id no.9所述的氨基酸序列(zmblk1蛋白)具体如下：22.mgncwgarikdgsphpgasgmfskssgkdgsrlsgcssrassasmppsakteceilrsanvkiftfnnlkaatrnfrpdsvlgeggfgsvykgwidentlspcrpgtgiavavkrlnheglqghrewlaevnylgqfchpnlvkligycledehrllvyefmprgnmenhlfrrgsyfqplswnlrmkvalgaakglaylhsaeakviyrdfktsnilldtdysaklsdfglakdgpvgekshvstrvmgtygyaapeylstghltaksdiysfgvvllemlsgrraidknrpqgehnlvewarpylthkrkifrildtrlegqynlngaqtiaalaleclsyeakmrptmdavvaileelqgsgeaekklqepkagtkqapaavsasmsssrkprrkslgdtketvgvpdpkplahsr23.seq id no.12所述的氨基酸序列(zmrboh4)具体如下：24.mhnprpgggdivemsssataegrviphsgplskksgarksarfaesvsaplsappprasannnnnnddddyveitldvrddsvavhsvkpahgggagagagaggddpdvtllartlesrrsssyghsvirnassrikqvsqelrriasinrrgaagpridrsksaaahalkglkfiskaegaagweaverrfdklaengllhrskfgqcigmkepefagelfdalsrrrnisgdsiskaellefwdqisdtsfdgrlqtffdmvdkdadgriteeevkevtpstaflqlvkpspspspwpqarteiqitkcfflsrpqiitlsasanklskitdqaeeyarlimeeldpgnlgyielynlemlllqapsqsvrigttnsrnlsqmlsqslrptaepnplrrwyrraqyflednwrrvwvmllwlcicaglfawkfiqyrqryvfqvmgycvcvakggaetlkfnmalillpvcrntitwirnrtagvgrvvpfddnlnfhkvvavgiavgaglhiishltcdfprllhatdaeyaplgqyfgvprppnywwfvrgtegwtglvmlvlmavaftlatpwfrrgrialpgplrrltgfnafwyshhcfvvvyallivhghylylthkwykkstwmylavpmvlyacerltralrssvrpvrilkvavypgnvlslhfskpqgfryksgqyifvncaavspfqwhpfsitsapqddyvsvhirtlgdwtrelknvfsrvcrpptegksgllraeydrdgsavanpsfpkvlidgpygapaqdykqydivllvglgigatpmisiikdiinnmrqldgggdleasdasassssmasfrtrrayfywvtreqgsfewfrgvmdevaetdrkgvielhnyctsvyeegdarsaliamlqslnhakhgvdvvsgtrvkthfarpnwrnvykrialnhqnqrvgvfycgapvltkelrelaqdfsrktntkfefhkenf25.上文中，实验证明zmwik蛋白质、zmrboh4蛋白和zmblk1蛋白存在相互作用，存在于同一信号通路中，zmwik蛋白与zmblk1互作，zmblk1蛋白接收zmwik蛋白的磷酸化信号，被磷酸化的zmblk1蛋白与zmrboh4蛋白互作，将磷酸化信号传递给zmrboh4蛋白。26.上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。27.上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。28.上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。29.上述蛋白质中，序列3(seq id no.2)由个594个氨基酸残基组成。30.上述蛋白质中，序列9(seq id no.9)由个419个氨基酸残基组成。31.上述蛋白质中，序列12(seq id no.12)由个971个氨基酸残基组成。32.上述的用途中，其特征在于，所述蛋白来源于玉米。33.上文中，玉米学名玉蜀黍。34.上文中，所述玉米可为玉米自交系b73。35.上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。36.上述的用途中，其特征在于，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：37.d1)、编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；38.d2)、含有d1)所述核酸分子的表达盒；39.d3)、含有d1)所述核酸分子的重组载体、或含有d2)所述表达盒的重组载体；40.d4)、含有d1)所述核酸分子的重组微生物、或含有d2)所述表达盒的重组微生物、或含有d3)所述重组载体的重组微生物；41.d5)、含有d1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有d2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有d3)所述重组载体的转基因植物细胞系；42.d6)、含有d1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有d2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有d3)所述重组载体的转基因植物组织；43.d7)、含有d1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有d2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有d3)所述重组载体的转基因植物器官；44.d8)抑制或降低或下调权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达核酸分子；45.d9)表达d8)所述rna分子的编码基因；46.d10)含有d9)所述基因的表达盒；47.d11)含有d9)所述基因的重组载体、或含有d10)所述表达盒的重组载体；48.d12)含有d9)所述基因的重组微生物、或含有d10)所述表达盒的重组微生物、或含有d11)所述重组载体的重组微生物；49.d13)含有d9)所述基因的转基因植物细胞系、或含有d10)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有d11)所述重组载体的转基因植物细胞系；50.d14)含有d6)所述基因的转基因植物组织、或含有d10)所述表达盒的转基因植物组织、或含有d11)所述重组载体的转基因植物组织；51.d15)含有d9)所述基因的转基因植物器官、或含有d10)所述表达盒的转基因植物器官、或含有d11)所述重组载体的转基因植物器官。52.4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，b1)所述的核酸分子为下列任一中：53.c1)编码链的核苷酸序列为序列2、8或11的dna分子；54.c2)将c1)所述核酸分子的经过核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与c1)所示的核酸分子具有80％以上的同一性且具调控植物灰斑病抗性的核酸分子。55.d1)和d7)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质zmwik、蛋白质zmblk1或蛋白质zmrboh4的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质zmwik、蛋白质zmblk1或蛋白质zmrboh4的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质zmwik、蛋白质zmblk1或蛋白质zmrboh4且具有蛋白质zmwik、蛋白质zmblk1或蛋白质zmrboh4功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。56.上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。57.本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。58.本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。具体可为载体peasy-blunt和/或pcambia-139；59.上述生物材料中，d2)和d10)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的dna，该dna不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature 313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacid res.,15:9627)。60.上述d3)和d11)中，可用植物表达载体构建含有所述基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体可为gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pgwb411、pgwb412、pgwb405、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb。使用tahsfc2al构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛生素基因ubiqutin启动子(pubi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。61.上述的用途中，所述植物为如下任一种：62.g1)双子叶植物或单子叶植物；63.g2)禾本科植物；64.g3)玉蜀黍属植物；65.g4)玉米。66.为了解决上述问题，本技术提供了一种调控植物灰斑病抗性的方法。67.所述方法包括通过调控植物中上述蛋白质的编码基因的表达或调控上述蛋白质的活性和/或含量来调控植物灰斑病抗性。68.上述的方法中，所述调控为上调或增强或提高，或，所述调控为下调或降低或减弱。69.所述调控可为上调或增强或提高。上调或增强或提高可增强植物灰斑病抗性。70.所述调控植物中所述蛋白质的编码基因的表达可包括向所述植物中导入所述蛋白质的编码基因。71.所述调控可为下调或降低或减弱。下调或降低或减弱可降低植物灰斑病抗性。72.所述调控植物中所述蛋白质的编码基因的表达可包括向所述植物中导入所述蛋白质的编码基因。73.所述调控植物中所述蛋白质的编码基因的表达可为通过敲除目的植物中所述zmrboh4蛋白的编码基因实现。所述目的植物可为玉米，所述敲除目的植物中所述zmrboh4蛋白的编码基因可为将玉米基因组中的编码链的核苷酸序列是序列10的所述编码基因进行下述至少一种突变：74.1)在seq id no.10的第115-116位核苷酸之间插入1个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸残基(t)，75.2)缺失seq id no.10的第116位腺嘌呤脱氧核糖核苷酸残基(a)。76.为了解决上述问题，本技术提供了一种培育灰斑病抗性植物的方法。77.所述方法包括上调或增强或提高目的植物中上所述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的活性和/或含量得到灰斑病抗性植物，所述灰斑病抗性植物的灰斑病抗性高于所述目的植物。78.所述灰斑病抗性可为叶片灰斑病抗性。所述叶片灰斑病抗性在喇叭口处。所述叶片灰斑病抗性可在喇叭口期抗性。所述喇叭口期也称作v10-10叶期。所述叶片灰斑病抗性可为玉米叶片灰斑病抗性。79.本技术通过外援插入目的蛋白的编码基因来增加目的蛋白编码基因的转录丰度，增加目的植株的耐热性。所述外援插入目的蛋白的编码基因可通过基因手段来实验。80.所述转基因手段所使用的植物表达载体可为或双元农杆菌载体。81.具体的，本技术使用载体的可为双元农杆菌载体。82.具体的，本技术使用侵染介质为农杆菌。所述农杆菌可为eha105。83.具体的，本技术使用的双元农杆菌载体可为pbcxun系列载体。84.具体的，本技术使用的基因编辑载体可为pbue411载体。基因编辑的靶点序列为：5’‑ggaagagcgcgcggttcgc-3’。85.上述的方法中，所述上调或增强或提高目的植物中上述蛋白质的编码基因的表达包括向所述目的植物中导入上述的蛋白质的编码基因。86.上文中，所述编码基因可为zmwik编码基因、zmblk1编码基因和zmrboh4编码基因中的至少一种。87.zmwik编码基因序列为序列表中序列2所示。zmblk1编码基因序列为序列表中序列8所示。zmrboh4编码基因序列为序列表中序列11所示。88.上文中，所述将所述zmwik基因编码的氨基酸序列的在61位终止可通过将植物基因组中序列为seq id no.1区域的第264个氨基酸由鸟嘌呤脱氧核苷酸残基突变为腺嘌呤(adenine)脱氧核苷酸残基。89.上述的用途或方法中，所述植物为如下任一种：90.g1)双子叶植物或单子叶植物；91.g2)禾本科植物；92.g3)玉蜀黍属；93.g4)玉蜀黍。94.上文中，所述玉蜀黍可为玉米自交系b73。95.本技术中，所述调控可为上调或增强或提高。所述调控还可为敲除或下调或降低或减弱。96.上文中，所述上调或增强或提高上述蛋白质的编码基因表达或上述蛋白的活性或含量可提高植物灰斑病抗性。97.上文中，敲除或下调或降低或减弱上述蛋白质的编码基因表达或上述蛋白的活性或含量可降低植物灰斑病抗性。98.上文中，所述植物育种为获得高灰斑病抗性的植株。99.上文中，所述植物育种为获得低灰斑病抗性的植株。100.有益效果101.本技术提供了zmwik-zmblk1-zmrboh4免疫信号通路蛋白在植物抗灰斑病中的应用。102.本技术通过实验发现一条与灰斑病抗性成正相关的信号通路；即，zmwik-zmblk1-zmrboh4免疫信号通路。zmwik蛋白与zmblk1互作，接收zmwik蛋白的磷酸化信号，被磷酸化的zmblk1蛋白与zmrboh4蛋白互作，将磷酸化信号传递给zmrboh4蛋白。103.本技术构建植物表达载体，将zmwik编码基因导入目标植物，获得的过表达转基因植株与野生型相比，灰斑病抗性明显提升。并且找到一种zmwik基因提前终止的植株，通过有性繁殖获得纯合zmwik基因提前终止的植株和相同背景的野生型zmwik基因植株，上述突变体和野生型相比灰斑病抗性明显降低。104.并且构建zmrboh4基因敲除载体，获得zmrboh4基因敲除的转基因植株，其转基因植株与野生型相比灰斑病抗性明显降低。105.玉米病害最经济有效的防治方法是培育抗病品种，选用抗灰斑病的品种是防治灰斑病的根本措施。因此，筛选抗灰斑病的种质资源，挖掘抗病基因，解析抗灰斑病的遗传基础，结合生物技术进行抗病分子设计育种，可以从根本上防控玉米灰斑病的危害，促进商业化玉米育种进程，对于保证玉米的品质和高产稳产具有重要的意义。附图说明106.图1为过表达载体pbcxun示意图。107.图2为zmwik基因的相对表达量。108.图3为zmwik基因过表达转基因植株抗性鉴定；a,zmwik过表达材料灰斑病抗性表型。b，zmwik过表达材料病情等级统计结果，图中箱线图下方数字表示统计植株数目。109.图4为zmwik与zmwik基因结构示意图；zmwik(seq id no.1)的第265位核苷酸变异(g-a)导致提前终止。110.图5为zmwik和zmwik测序检测结果；a,野生型zmwik测序结果，b,突变体zmwik测序结果。111.图6为zmwik和zmwik材料抗性鉴定；a,zmwik野生型和突变体灰斑病抗性表型。b，zmwik野生型和突变体病情等级统计结果，图中箱线图下方数字表示统计植株数目。112.图7为在植物体内zmwik能够与zmblk1互作；a,zmwik在烟草中与zmblk1互作，b，免疫共沉淀实验表明zmwik与zmblk1互作。113.图8为zmwik胞内激酶功能域能够磷酸化zmblk1。114.图9为zmblk1与zmrboh4互作和磷酸化反应图片；a,zmblk1在烟草中与zmrboh4互作。b，mbp共沉淀实验表明zmwik与zmblk1互作。c，zmblk1能够磷酸化zmrboh4的氮端。115.图10为zmrboh4基因敲除材料测序鉴定结果。116.图11为zmrboh4基因敲除材料抗性鉴定结果；a,转基因受体和zmrboh4敲除材料灰斑病抗性表型，b，转基因受体和zmrboh4敲除材料病情等级统计结果，图中箱线图下方数字表示统计植株数目。具体实施方式117.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。118.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。119.下述实施例采用graphpad prism 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准差表示，采用one-way anova检验，不同的小写字母表示差异显著，p＜0.05。120.下述实施例中的玉米尾孢菌(cercospora zeina)，记载于如下文献：first report ofgray leaf spot ofmaize caused by cercospora zeina in china，plant disease/vol.97no.12。121.下述实施例中的pbcxun载体(pbcxun vector)，记载于如下文献：zmhak5andzmhak1 function in k+uptake and distribution in maize under low k+conditions.journal ofintergrative plant biology(2018)doi:10.1111/jipb.12756。pbcxun载体的结构示意图见图1。122.下述实施例中的pbue411载体(pbue411 vector)，记载于如下文献：zmcct9enhances maize adaptation to higher latitudes.huang ect.，pnas(2018)115(2):e334-e341doi:10.1073/pnas.1718058115。123.实施例1、zmwik蛋白及其编码基因的获得124.本技术的发明人经过广泛而深入的研究，从玉米自交系b73中分离克隆出一个编码富含亮氨酸重复的类受体激酶的基因，该基因参与植物免疫信号传导，将其命名为zmwik基因(其编码的蛋白质名称为zmwik)。玉米自交系b73的基因组dna中的zmwik基因如序列表的seq id no.1所示，其基因的编码序列(cds)如序列表的seq id no.2所示，其编码的蛋白质zmwik的氨基酸序列如序列表的seq id no.3所示。125.seq id no.1序列(zmwik基因dna序列)具体如下：126.atgggctctttcctgtggaaacagcccagctacctcttcattttgataattctccaccttgttgctcatgagg127.caagaacgctgagttcagatggtatgtgatgttatggctgctatttgtggcacattttttcagcttgtccaa128.aatgctaacacttattggtgttctacaggtgaagcacttcttgccttcaagaaggcagttacaaattcagat129.ggagtctttctaaattggcgtgagcaagatgcagacccctgcaattggaagggtgttagatgtgatagtcat130.agcaagagagtgattgatctgtaagaacaaagaaccattctttaagctaacttggtttgttgttacttgctt131.aatattgtatctagctatctacagttttgcaacactaacaatttttatgggatagaatttctctaatactagag132.aatgaaatttcagtatcttctagcaatgtagcataaatatctgacttactcctttattcaggattcttgcatac133.cacagattagttgggcccataccacccgaaattggaaagttaaatcagttgcaaaccttgtaagtgtgttct134.aaaaatggcatttttaatcttttctttcttattagtatccccttcatatcatttgttattaatctaaatgtgttg135.tttttttggcataggtcactgcaggggaacagtttgtatggttcactccctcctgaactggggaattgtacc136.aagctgcaacaattgtaagttttataatggctagagtgcactgttcagggcaacaattctagataaagtaac137.aaatgatccctgaatagcactgaaccatatcagttcaattgcacgcttcttatgtataacagactttactgtg138.tatagtatggcttttgttctgatgtgtgatgacttgcaggtatctacaaggaaactatttaagtggatacatc139.ccttcagaatttggcgatctggtggaactcgaggcattgtaagttcagattttagaaggaaaattctaaatt140.tcaattgaatattgatcagtttttttttcaatatatcagtgctggctctttattgtccattccacatcagataga141.tctcttcaattagactgtttcaagtttccggagagatttactaattactatagtagtagaccaaacctaaaag142.cctgggagggaaagatttacgagtagcagtgtctccagcaaggcaacaagcctggtagtaaaaaaacccg143.tccgggaagggaaagaccgccctcccgatattatattaagatgagaccgaaacatggtcccgactgaacca144.aaattaccgaaccctgccccccatcactagtgggccgtcattgcccactctgaacggcccagccggagggt145.ggcgcgcaggatgtaccccaggagcaggcggggcacaacgaagggatttttttaaccaagccaaaaaatc146.gccctgagagggatcgaacctgggacctagaggtgctactcgaaagccttaaccattacactagagaccct147.ttcaaagaagtgcccatcaaagaagagtagaccaagctggtgtagctagttgtgcctcgtatgatgttgga148.ggcgatggtgcgtagctcgaacacctgtagagttgcccagcggagttcatcaaagatggtcgtgcgtgttc149.tgatgctatcgatggcgttgggccgtcactgatttgtcgctcggctcatgtagtagcgtggtaagggcgaca150.gagacagtgactgaggcgggggtgtgagctgtcgaggtgctgacgtgatcaatgtcggggtgaggaggg151.cgaggacattttgtggtgcataatgatcgtggatgttggtgaaggtgatggtgtgcttgccccgtttaaact152.acacctcgagggatgcgttccagaggacattgctgaggtcaagtagccatggcgtgccgaggatgatttcg153.atgttggtgttgacttaggagagcatcgatctagaatgtctcggtgtcgatgcggagcggatcgttgaagc154.aattaatcttgttaacgcttgatgaggattgtggtgttgatgcggcgcttcatgagatagcctagtcggaca155.aagttgatgtcaatgacgttgtgggtggcgcatgtgtcgacgagaatgcgcacaccctctctaagtacaac156.gcctaccaagaacatggtgtgccaaacatgcacacctgagttctaggtgcctatcatcatgaggttgatatc157.gagatcgtcgttgtcttagtctttgacgagtgtgatgtcgaatgagtgcttgcacttgtggttgcaggtga158.agggctcttcacaattgaagcacaaccccatacatcggtgcaccatcatcttcgatgtcgggtgtctgaag159.gggcgaggtggtgtagctggcggagatgctgatgacaatgctagagttggtggagtagctagtgttgatgt160.gccttcaaggaagaggacgagctgttaaaggtactgttggttgtcggtttgttggtgtccgtgatggcagt161.tgcccaatgttcatatgcttgggcgagggacatggccctctccatgtcttgtgggttttggacctcctccat162.gtcatcttgaaatgttgctcattgagggtctcagcgcgtcccacgtgcgccaggaagcgcttcgtgtgctc163.attgacgatgatggtctttcgtaggggcaccagctgggagagcgggttgcattggttgggcgggctgaag164.cgcttgttgagacaagtgaagtatgccaagtcgttcaccttgtcatgtgtcagacacatgtaccattgttgg165.gcgccacccgttagatgaaaagaggcattcaagacttgcttgttgttggagctgttctgtccttcgaaaat166.tgctctcagcggttaagccatggtaacggatcctcctagccatcaaatgtggggaacgaccgtttgtgtatg167.ataagagccgggtgttgtcaatgggtgggggatggtggtgacatgggcgccttgggggtgcctccttgtca168.acattgacaatgagtagcttgttcgtcacctcctccatgagtttcaggatagccgatgatggggactcctcc169.ttgaggaaggcgcatccacgacctccattgaacgcttgatctccgccttgagcaccttggcggtggcctca170.aattccatctttgccttcgctacagtggtgtcggcatcctccttggagcctcattgctccatgttgctagatg171.accttgacgaagtgctctctgaccttgtcaaagtgcttgttgaggttggcacctaggcccttgatcagcac172.cttcatctctgtggtgttgttgttatcgcccatgaatgcggtctggccttcggataccggtatcgcagtccaa173.tccagggaaggggactgtgggcggctgtggctactgctgtgtgggcagctgtggctaggtaggcactggt174.gcaggaagggaggggcagcgacggacgcaccttctggcctgcgtgcccccctgcccactcgagcgaaga175.ggctgaggccgtccagggcccaatgctgggcctctcttggcccgatgtggggggccatatttggcgggtaa176.cagtgttacagtttgtgctagccatggaaataaaaactatagattgattgttctatctcgatcttttttttctc177.atacagggacttgtccagtaatacattgagtggatctgttccacattctcttgataagttgtccaaacttaca178.ttattgtaagtgattttttatttggataaattcatctaattgttatgaaaagttgatgactcagatacaaatca179.tttacctgcaaccttgtgcagcaatgtttccatgaacttcctgacaggagccataccatcttctggttcact180.tgtcaatttcaatgagacatcgtgagtgatcttaccctgttttatttatggccatatctatcttattcactatca181.cacctatgtatttgtgtttgatcttgtggatacagagatattgattcattagcttctcaaatttatccctccatt182.atccaaggagtagcaatactactttcccattccttagattccaactgattttgattctggtaatgtagctttg183.ttggcaaccttggtttatgtgggaagcagataaacttggtgtgcaaagatgcacttcaatcatcatcaaatg184.gtctgcagtcaccttcaccaggtactaactgtattctagtaacgtagtttttagttgtaagcgtgatcatgtt185.gtgtatcaacatctggtgtgtttaatcaccagtaggaaacatggccttagcagttttgagttgtgcaagttg186.gtatttttaggtacatttcatttaggtcaagaaatggacctacaggctgtgtcttctaatcttagcatgctga187.ggtgcaaagaaccatgtgcctaactgtggtcccatattccttttggagaactaaaagctattgaataaggta188.tcattaagtgctaaactctgataaggtccaatagtcgacgtagggaattaaaagctttcttagatgacagca189.tttttaagtgttaaagttaaactctagtaactgatacccatgtaacccatatgcctcatagttgtggtctgga190.tcagattttgtgaaaaccaggtgtatgcatgttatcaaatatgaatcttgtggagaaccaaaatggttttaat191.gaagtagacattttaatagggaaaaaagttggtgaaagcgccatttagctacaacatcgaaagagcacaa192.atgattatttctaacttacagccttttgagcctggatctttattaagcgtccgcagtcctcacacttgtcatc193.cggtggggggggagggggggtttacagatctgcatgctaatatgattagtataagaatccctctagattcac194.ccctttcaagaatttaaacaattcaaacatgcattttttttcccgagaaccttttgtgttcgataagtttaca195.tgcaaggccttttgtgcttaacaactgctcacatttatttcttcgcatttcaactcttgttttctggcattctt196.atgtattttggtgttgtcttacaacagatgacatgattaataaaaggaatgggaagaattcgaccagacttg197.ttataagtgcagtggcaacagtgggagctctcctattggtggctttaatgtgtttctggggttgctttcttta198.caaaaattttggaaaaaaagatatgcgtggtttcagagtggagctctgtggaggtaaccgtggcatgtaat199.atgttgtgcaagtatttattatttttcaaaggaaattgtcttatgacattgctagatttttcaggctcttctgt200.cgtgatgttccatggggacctcccttactcctcaaaagacatcctcaagaagctagagactatagatgaag201.aaaatatcattggagcaggaggcttcggaactgtttataaacttgcaatggatgatggcaatgtctttgctt202.tgaaaaggatagtgaaaacaaatgaagggctagatcggttctttgatagagaacttgagatattgggaagt203.gttaaacatcgctatttggtcaatctccgtggttattgcaactccccttcatcaaaacttttgatatatgatta204.tcttcaaggtggaagcctggatgaagtgcttcatggtaagtgtcattttttatcaactcacatctcctcgatt205.gcgtttatctttcatctttagttgttttttaaataacacgttaacaagcttgttaccagtccctttcccactac206.aagttaatcatgtttttgttcaatgcgaacaacaattttaggtttctgaatattgtgggcacacaagagtat207.gggacgctaggtcacactaagcaattgattctgatatagagcaatgatctaaaggtcgaaaagatttttgga208.gcacaacaattccatgttctcttttgaggttatctacaacccttataaaagaaaaccccactagcatgcattt209.atgatattctaactcttcatgtaagctattcacaccatcccacatttgttggcttgttgctgcccaatttgcca210.ctacaaatcccatctgtccaatggcatcctgtcttagatatttacacaagcccagtcaatggaaactatagtt211.tgtactagcctggtagcccatgtacagtctgagaagatacaatagtagcattgaaacaataatttttcttcc212.acaaacgctgtcacttgagagtattgtctatttaagtgcaaattctaatgcacttctcatttctcatcataaa213.tttgttagtccacaaaatagtcatcgcatttatacatttttatttaaataatgctcctgcataacttctgtgat214.ccctaaagcaatgcgcagggcatcatttctagtgcttaaagaatttgcagccggtctcaacgaatcttttat215.gattcacacattttttttcttgatctgacatagtgcaaaatagcattaatgttttatgtttgctccttacattg216.tttttgcgtgtaaatctatgcagaaaaatctgaacagttggattgggatgcacgtattaacattatacttgga217.gctgcaaaaggcttgtcttacttgcatcatgactgttcgcctcgaataatacatcgtgatattaagtctagca218.acatcttgcttgatggcagtttcgaggcccgtgtatcagactttggacttgcaaagcttttagaggatgaa219.gaatcacatattactacaatagttgcaggaacatttggctaccttgcaccaggtatgtggaagtccctctgtt220.acatcctgaggggaaagagaagaaatgaacttctgtttactctttaatcgccgcttcagactttctctggtt221.gctaaaatatcattgttaatgctctgagctaacaccaacgaaatccgaatccacagagtatatgcaatttgg222.cagagccaccgagaagactgatgtctacagttttggggttttggtactcgaaatactcagtggaaagcggc223.ctactgatgcatccttcattgagaagggactaaacattgttggatgggtatgtcctgctcgattattttaatt224.cttaaggcttgcatactttcttctatcgagttggagtaacctgaaaggatcatcttgtcttttggcagttaaa225.ttttcttgctagtgagaaccgggagagggaaattgtcgacctgaactgtgaaggagtgcagactgagacc226.ttagatgccctgctctctcttgccaagcaatgtgttagctcctcgccagaggagaggccgacaatgcacag227.ggtggtacatatgctggagtcggatgtaattacaccgtgccctagcgacttctatgattcagagtagseq id no.2(zmwik基因编码序列)序列具体如下：228.atgggctctttcctgtggaaacagcccagctacctcttcattttgataattctccaccttgttgctcatgagg229.caagaacgctgagttcagatggtgaagcacttcttgccttcaagaaggcagttacaaattcagatggagt230.ctttctaaattggcgtgagcaagatgcagacccctgcaattggaagggtgttagatgtgatagtcatagca231.agagagtgattgatctgattcttgcataccacagattagttgggcccataccacccgaaattggaaagttaa232.atcagttgcaaaccttgtcactgcaggggaacagtttgtatggttcactccctcctgaactggggaattgt233.accaagctgcaacaattgtatctacaaggaaactatttaagtggatacatcccttcagaatttggcgatctg234.gtggaactcgaggcattggacttgtccagtaatacattgagtggatctgttccacattctcttgataagttg235.tccaaacttacattattcaatgtttccatgaacttcctgacaggagccataccatcttctggttcacttgtca236.atttcaatgagacatcctttgttggcaaccttggtttatgtgggaagcagataaacttggtgtgcaaagatg237.cacttcaatcatcatcaaatggtctgcagtcaccttcaccagatgacatgattaataaaaggaatgggaaga238.attcgaccagacttgttataagtgcagtggcaacagtgggagctctcctattggtggctttaatgtgtttct239.ggggttgctttctttacaaaaattttggaaaaaaagatatgcgtggtttcagagtggagctctgtggaggc240.tcttctgtcgtgatgttccatggggacctcccttactcctcaaaagacatcctcaagaagctagagactata241.gatgaagaaaatatcattggagcaggaggcttcggaactgtttataaacttgcaatggatgatggcaatgtc242.tttgctttgaaaaggatagtgaaaacaaatgaagggctagatcggttctttgatagagaacttgagatatt243.gggaagtgttaaacatcgctatttggtcaatctccgtggttattgcaactccccttcatcaaaacttttgata244.tatgattatcttcaaggtggaagcctggatgaagtgcttcatgaaaaatctgaacagttggattgggatgca245.cgtattaacattatacttggagctgcaaaaggcttgtcttacttgcatcatgactgttcgcctcgaataatac246.atcgtgatattaagtctagcaacatcttgcttgatggcagtttcgaggcccgtgtatcagactttggacttg247.caaagcttttagaggatgaagaatcacatattactacaatagttgcaggaacatttggctaccttgcaccag248.agtatatgcaatttggcagagccaccgagaagactgatgtctacagttttggggttttggtactcgaaatac249.tcagtggaaagcggcctactgatgcatccttcattgagaagggactaaacattgttggatggttaaattttc250.ttgctagtgagaaccgggagagggaaattgtcgacctgaactgtgaaggagtgcagactgagaccttaga251.tgccctgctctctcttgccaagcaatgtgttagctcctcgccagaggagaggccgacaatgcacagggtgg252.tacatatgctggagtcggatgtaattacaccgtgccctagcgacttctatgattcagagtag253.实施例2、zmwik基因过表达植物的获得和抗性鉴定254.一、重组表达载体的构建255.1、取玉米自交系b73的新鲜叶片，提取总rna，反转录得到cdna。256.2、以步骤1得到的cdna为模板，采用zmwik-cds-f和zmwik-cds-r组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。257.zmwik-cds-f：5’‑atgggctctttcctgtggaa-3’；258.zmwik-cds-r：5’‑ctactctgaatcatagaagt-3’。259.3、取pbcxun载体(图1)，采用限制性内切酶xcm i进行酶切，回收载体骨架。260.4、将步骤2得到的pcr扩增产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒，命名为pbcxun-zmwik。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：重组质粒pbcxun-zmwik是在pbcxun载体的xcm i酶切位点，采用ta克隆的方式插入了核苷酸序列是序列表中seq id no.2的第1-1785位的dna片段后得到的重组质粒。实际应用中，也可以分别直接合成外源片段然后插入pbcxun载体的xcm i酶切位点，从而得到重组质粒。261.二、过表达植物的获得262.1、将重组质粒pbcxun-zmwik导入根癌农杆菌eha105，得到重组农杆菌eha105/pbcxun-zmwik。263.2、取步骤1得到的重组农杆菌eha105/pbcxun-zmwik，采用农杆菌介导法对玉米自交系b73的幼胚进行遗传转化，得到t0代植株。264.3、将t0代植株进行pcr鉴定。pcr鉴定方法：取植株叶片，提取基因组dna，采用bar-f和bar-r组成的引物对进行pcr扩增，如果得到约262bp的扩增产物、pcr鉴定为阳性、该植株为转基因植株，如果没有得到扩增产物、pcr鉴定为阴性、该植株为非转基因植株。pcr鉴定引物序列如下：265.bar-f：5’‑gaaggcacgcaacgcctacga-3’；266.bar-r：5’‑ccagaaacccacgtcatgcca-3’。267.对获得两个pcr检测阳性的转基因植株进行命名，分别为zmwik-oe#1植株和zmwik-oe#2植株。268.三、纯合转基因后代的获得269.t0代植株自交，收获籽粒，将籽粒培育为植株，即为t1代植株。从t1代植株中筛选转基因植株(pcr鉴定)进行自交，收获籽粒，将籽粒培育为植株即为t2代植株。从t2代植株中筛选转基因植株(pcr鉴定)进行自交，收获籽粒，将籽粒培育为植株即为t3代植株。pcr鉴定方法同步骤二的3。对于某一t2代植株，如果其自交得到的t3代植株均为转基因植株，该t2代植株为纯合的转基因植株。纯合的转基因植株自交得到的后代为纯合的转基因株系。270.按照上述方法分别得到纯和的zmwik-oe#1株系的t3代植株和zmwik-oe#2株系的t3代植株。271.四、植株的抗病性鉴定272.供试植株为：纯合转基因zmwik-oe#1植株，纯合转基因zmwik-oe#2植株和非转基因植株(野生型玉米自交系b73)。273.1、基因表达水平鉴定274.提取供试植株叶片的总rna并反转录得到cdna，以gapdh基因为内参基因，通过qpcr检测zmwik基因的相对表达水平。结果见图2。结果表明，与转基因受体b73相比，转基因植株的表达量均显著升高。275.用于检测zmwik基因表达量的引物对：276.zmwik-qrt-f：5’‑ttggaagggtgttagatgtgatag-3’；277.zmwik-qrt-r：5’‑tccaatttcgggtggtatgg-3’。278.用于检测gapdh基因表达量的引物对：279.zmgapdh-qrt-f：5’‑atcaacggcttcggaaggat-3’；280.zmgapdh-qrt-r：5’‑ccgtggacggtgtcgtactt-3’。281.2、抗病性鉴定282.抗病性鉴定在中国农业大学上庄实验基地进行。283.灰斑病致病菌：玉米尾孢菌(cercosporazeina)。284.正常培养供试植株，喇叭口期(v10-10叶期)接种致病菌，然后继续正常培养，授粉两周后进行表型调查，采用分级调查的方法。接种致病菌的具体方法(菌液灌心法)：用无菌水悬浮灰斑病致病菌的孢子，得到孢子浓度为2-4×105个/ml的孢子悬液，利用注射器将孢子悬液灌注于玉米(v10)喇叭口中，每株玉米灌注5ml。纯合转基因zmwik-oe#1植株78株，纯合转基因zmwik-oe#2植株75株和野生型玉米自交系b73各112株，每个植株统计穗位叶的发病情况。统计结果采用one-wayanovn检验，不同的小写字母表示差异显著，p＜0.05。285.病情等级的分级标准(x表示玉米穗位叶的病斑面积)：286.1级：x≤5％；287.3级：5％＜x≤10％；288.5级：10％＜x≤30％；289.7级：30％＜x≤70％；290.9级：70％＜x≤100％。291.抗病性鉴定结果见图3。图3中，箱线图下方数字表示各组植株数量，星号表示平均值，具有不同小写字母的处理间具有显著差异。结果表明，与转基因受体b73相比，转基因植株的病情等级显著降低，抗病性显著升高。292.实施例3、zmwik基因提前终止突变体植物的获得和抗性鉴定293.一、ems突变体植株的筛选294.我们从商业化b73背景ems突变体库(http://www.elabcaas.cn/memd/public/index.html#/)，获得一个能够导致zmwik基因提前终止的植株(mutant id:ems4-0073f9,zmwik seq idno.1第265位核苷酸由g变为a，导致提前终止)。该突变体植株的zmwik蛋白仅包含61个氨基酸，序列如序列表的seq id no.6所示。将该突变体命名为zmwik，其基因组dna序列如序列表的seq id no.4所示，其对应的编码序列如序列表的seq id no.5所示。该ems突变体的示意图如图4所示。295.seq id no.4(zmwik基因dna序列)序列具体如下：296.atgggctctttcctgtggaaacagcccagctacctcttcattttgataattctccaccttgttgctcatgaggcaagaacgctgagttcagatggtatgtgatgttatggctgctatttgtggcacattttttcagcttgtccaaaatgctaacacttattggtgttctacaggtgaagcacttcttgccttcaagaaggcagttacaaattcagatggagtctttctaaattggcgtgagcaagatgcagacccctgcaattgaaagggtgttagatgtgatagtcatagcaagagagtgattgatctgtaagaacaaagaaccattctttaagctaacttggtttgttgttacttgcttaatattgtatctagctatctacagttttgcaacactaacaatttttatgggatagaatttctctaatactagagaatgaaatttcagtatcttctagcaatgtagcataaatatctgacttactcctttattcaggattcttgcataccacagattagttgggcccataccacccgaaattggaaagttaaatcagttgcaaaccttgtaagtgtgttctaaaaatggcatttttaatcttttctttcttattagtatccccttcatatcatttgttattaatctaaatgtgttgtttttttggcataggtcactgcaggggaacagtttgtatggttcactccctcctgaactggggaattgtaccaagctgcaacaattgtaagttttataatggctagagtgcactgttcagggcaacaattctagataaagtaacaaatgatccctgaatagcactgaaccatatcagttcaattgcacgcttcttatgtataacagactttactgtgtatagtatggcttttgttctgatgtgtgatgacttgcaggtatctacaaggaaactatttaagtggatacatcccttcagaatttggcgatctggtggaactcgaggcattgtaagttcagattttagaaggaaaattctaaatttcaattgaatattgatcagtttttttttcaatatatcagtgctggctctttattgtccattccacatcagatagatctcttcaattagactgtttcaagtttccggagagatttactaattactatagtagtagaccaaacctaaaagcctgggagggaaagatttacgagtagcagtgtctccagcaaggcaacaagcctggtagtaaaaaaacccgtccgggaagggaaagaccgccctcccgatattatattaagatgagaccgaaacatggtcccgactgaaccaaaattaccgaaccctgccccccatcactagtgggccgtcattgcccactctgaacggcccagccggagggtggcgcgcaggatgtaccccaggagcaggcggggcacaacgaagggatttttttaaccaagccaaaaaatcgccctgagagggatcgaacctgggacctagaggtgctactcgaaagccttaaccattacactagagaccctttcaaagaagtgcccatcaaagaagagtagaccaagctggtgtagctagttgtgcctcgtatgatgttggaggcgatggtgcgtagctcgaacacctgtagagttgcccagcggagttcatcaaagatggtcgtgcgtgttctgatgctatcgatggcgttgggccgtcactgatttgtcgctcggctcatgtagtagcgtggtaagggcgacagagacagtgactgaggcgggggtgtgagctgtcgaggtgctgacgtgatcaatgtcggggtgaggagggcgaggacattttgtggtgcataatgatcgtggatgttggtgaaggtgatggtgtgcttgccccgtttaaactacacctcgagggatgcgttccagaggacattgctgaggtcaagtagccatggcgtgccgaggatgatttcgatgttggtgttgacttaggagagcatcgatctagaatgtctcggtgtcgatgcggagcggatcgttgaagcaattaatcttgttaacgcttgatgaggattgtggtgttgatgcggcgcttcatgagatagcctagtcggacaaagttgatgtcaatgacgttgtgggtggcgcatgtgtcgacgagaatgcgcacaccctctctaagtacaacgcctaccaagaacatggtgtgccaaacatgcacacctgagttctaggtgcctatcatcatgaggttgatatcgagatcgtcgttgtcttagtctttgacgagtgtgatgtcgaatgagtgcttgcacttgtggttgcaggtgaagggctcttcacaattgaagcacaaccccatacatcggtgcaccatcatcttcgatgtcgggtgtctgaaggggcgaggtggtgtagctggcggagatgctgatgacaatgctagagttggtggagtagctagtgttgatgtgccttcaaggaagaggacgagctgttaaaggtactgttggttgtcggtttgttggtgtccgtgatggcagttgcccaatgttcatatgcttgggcgagggacatggccctctccatgtcttgtgggttttggacctcctccatgtcatcttgaaatgttgctcattgagggtctcagcgcgtcccacgtgcgccaggaagcgcttcgtgtgctcattgacgatgatggtctttcgtaggggcaccagctgggagagcgggttgcattggttgggcgggctgaagcgcttgttgagacaagtgaagtatgccaagtcgttcaccttgtcatgtgtcagacacatgtaccattgttgggcgccacccgttagatgaaaagaggcattcaagacttgcttgttgttggagctgttctgtccttcgaaaattgctctcagcggttaagccatggtaacggatcctcctagccatcaaatgtggggaacgaccgtttgtgtatgataagagccgggtgttgtcaatgggtgggggatggtggtgacatgggcgccttgggggtgcctccttgtcaacattgacaatgagtagcttgttcgtcacctcctccatgagtttcaggatagccgatgatggggactcctccttgaggaaggcgcatccacgacctccattgaacgcttgatctccgccttgagcaccttggcggtggcctcaaattccatctttgccttcgctacagtggtgtcggcatcctccttggagcctcattgctccatgttgctagatgaccttgacgaagtgctctctgaccttgtcaaagtgcttgttgaggttggcacctaggcccttgatcagcaccttcatctctgtggtgttgttgttatcgcccatgaatgcggtctggccttcggataccggtatcgcagtccaatccagggaaggggactgtgggcggctgtggctactgctgtgtgggcagctgtggctaggtaggcactggtgcaggaagggaggggcagcgacggacgcaccttctggcctgcgtgcccccctgcccactcgagcgaagaggctgaggccgtccagggcccaatgctgggcctctcttggcccgatgtggggggccatatttggcgggtaacagtgttacagtttgtgctagccatggaaataaaaactatagattgattgttctatctcgatcttttttttctcatacagggacttgtccagtaatacattgagtggatctgttccacattctcttgataagttgtccaaacttacattattgtaagtgattttttatttggataaattcatctaattgttatgaaaagttgatgactcagatacaaatcatttacctgcaaccttgtgcagcaatgtttccatgaacttcctgacaggagccataccatcttctggttcacttgtcaatttcaatgagacatcgtgagtgatcttaccctgttttatttatggccatatctatcttattcactatcacacctatgtatttgtgtttgatcttgtggatacagagatattgattcattagcttctcaaatttatccctccattatccaaggagtagcaatactactttcccattccttagattccaactgattttgattctggtaatgtagctttgttggcaaccttggtttatgtgggaagcagataaacttggtgtgcaaagatgcacttcaatcatcatcaaatggtctgcagtcaccttcaccaggtactaactgtattctagtaacgtagtttttagttgtaagcgtgatcatgttgtgtatcaacatctggtgtgtttaatcaccagtaggaaacatggccttagcagttttgagttgtgcaagttggtatttttaggtacatttcatttaggtcaagaaatggacctacaggctgtgtcttctaatcttagcatgctgaggtgcaaagaaccatgtgcctaactgtggtcccatattccttttggagaactaaaagctattgaataaggtatcattaagtgctaaactctgataaggtccaatagtcgacgtagggaattaaaagctttcttagatgacagcatttttaagtgttaaagttaaactctagtaactgatacccatgtaacccatatgcctcatagttgtggtctggatcagattttgtgaaaaccaggtgtatgcatgttatcaaatatgaatcttgtggagaaccaaaatggttttaatgaagtagacattttaatagggaaaaaagttggtgaaagcgccatttagctacaacatcgaaagagcacaaatgattatttctaacttacagccttttgagcctggatctttattaagcgtccgcagtcctcacacttgtcatccggtggggggggagggggggtttacagatctgcatgctaatatgattagtataagaatccctctagattcacccctttcaagaatttaaacaattcaaacatgcattttttttcccgagaaccttttgtgttcgataagtttacatgcaaggccttttgtgcttaacaactgctcacatttatttcttcgcatttcaactcttgttttctggcattcttatgtattttggtgttgtcttacaacagatgacatgattaataaaaggaatgggaagaattcgaccagacttgttataagtgcagtggcaacagtgggagctctcctattggtggctttaatgtgtttctggggttgctttctttacaaaaattttggaaaaaaagatatgcgtggtttcagagtggagctctgtggaggtaaccgtggcatgtaatatgttgtgcaagtatttattatttttcaaaggaaattgtcttatgacattgctagatttttcaggctcttctgtcgtgatgttccatggggacctcccttactcctcaaaagacatcctcaagaagctagagactatagatgaagaaaatatcattggagcaggaggcttcggaactgtttataaacttgcaatggatgatggcaatgtctttgctttgaaaaggatagtgaaaacaaatgaagggctagatcggttctttgatagagaacttgagatattgggaagtgttaaacatcgctatttggtcaatctccgtggttattgcaactccccttcatcaaaacttttgatatatgattatcttcaaggtggaagcctggatgaagtgcttcatggtaagtgtcattttttatcaactcacatctcctcgattgcgtttatctttcatctttagttgttttttaaataacacgttaacaagcttgttaccagtccctttcccactacaagttaatcatgtttttgttcaatgcgaacaacaattttaggtttctgaatattgtgggcacacaagagtatgggacgctaggtcacactaagcaattgattctgatatagagcaatgatctaaaggtcgaaaagatttttggagcacaacaattccatgttctcttttgaggttatctacaacccttataaaagaaaaccccactagcatgcatttatgatattctaactcttcatgtaagctattcacaccatcccacatttgttggcttgttgctgcccaatttgccactacaaatcccatctgtccaatggcatcctgtcttagatatttacacaagcccagtcaatggaaactatagtttgtactagcctggtagcccatgtacagtctgagaagatacaatagtagcattgaaacaataatttttcttccacaaacgctgtcacttgagagtattgtctatttaagtgcaaattctaatgcacttctcatttctcatcataaatttgttagtccacaaaatagtcatcgcatttatacatttttatttaaataatgctcctgcataacttctgtgatccctaaagcaatgcgcagggcatcatttctagtgcttaaagaatttgcagccggtctcaacgaatcttttatgattcacacattttttttcttgatctgacatagtgcaaaatagcattaatgttttatgtttgctccttacattgtttttgcgtgtaaatctatgcagaaaaatctgaacagttggattgggatgcacgtattaacattatacttggagctgcaaaaggcttgtcttacttgcatcatgactgttcgcctcgaataatacatcgtgatattaagtctagcaacatcttgcttgatggcagtttcgaggcccgtgtatcagactttggacttgcaaagcttttagaggatgaagaatcacatattactacaatagttgcaggaacatttggctaccttgcaccaggtatgtggaagtccctctgttacatcctgaggggaaagagaagaaatgaacttctgtttactctttaatcgccgcttcagactttctctggttgctaaaatatcattgttaatgctctgagctaacaccaacgaaatccgaatccacagagtatatgcaatttggcagagccaccgagaagactgatgtctacagttttggggttttggtactcgaaatactcagtggaaagcggcctactgatgcatccttcattgagaagggactaaacattgttggatgggtatgtcctgctcgattattttaattcttaaggcttgcatactttcttctatcgagttggagtaacctgaaaggatcatcttgtcttttggcagttaaattttcttgctagtgagaaccgggagagggaaattgtcgacctgaactgtgaaggagtgcagactgagaccttagatgccctgctctctcttgccaagcaatgtgttagctcctcgccagaggagaggccgacaatgcacagggtggtacatatgctggagtcggatgtaattacaccgtgccctagcgacttctatgattcagagtag297.seq id no.5序列(zmwik基因编码序列)具体如下：298.atgggctctttcctgtggaaacagcccagctacctcttcattttgataattctccaccttgttgctcatgaggcaagaacgctgagttcagatggtgaagcacttcttgccttcaagaaggcagttacaaattcagatggagtctttctaaattggcgtgagcaagatgcagacccctgcaattga299.seq id no.6具体序列(zmwik蛋白氨基酸序列)如下：300.mgsflwkqpsylfiliilhlvaheartlssdgeallafkkavtnsdgvflnwreqdadpcn301.二、zmwik纯合突变体和野生型植株的获得302.将上述购买到的zmwik突变体自交，通过测序鉴定获得纯合突变体材料zmwik和纯合野生型材料zmwik。303.用于检测zmwik的引物对：304.zmwik-f：5’‑gcccagctacctcttcattt-3’；305.zmwik-r：5’‑tccaatttcgggtggtatgg-3’。306.纯合突变体材料zmwik和纯合野生型材料zmwik测序检测结果如图5所示。307.三、突变体植株的抗性鉴定308.供试植株为：纯合突变体材料zmwik和相同背景的野生型材料zmwik。309.抗性鉴定方法同实施例2的步骤四中步骤2。310.抗病性鉴定结果见图6。图6中，箱线图下方数字表示各组植株数量，星号表示平均值。结果显示，相对于野生型植株zmwik，突变体材料zmwik的病情指数显著增加，抗病降低。再次说明zmwik基因正调控玉米灰斑病抗性。311.实施例4、zmblk1与zmrboh4蛋白及其编码基因的获得312.一，zmblk1蛋白及其编码基因的获得313.鉴于zmwik是一个定位在细胞质膜的免疫相关类受体激酶，该类受体激酶下游往往有一个细胞质相关受体激酶接受并传导zmwik的免疫信号。为了鉴定zmwik下游的细胞质相关受体激酶，我们采用烟草分裂荧光素酶系统和免疫共沉淀技术，最终鉴定到zmblk1能够与zmwik互作(图7)，并接收zmwik的磷酸化信号(图8)。314.玉米自交系b73的基因组dna中的zmblk1基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。所述zmblk1基因的编码序列为seq id no.8，编码氨基酸序列是seq id no.9。315.二，zmrboh4蛋白及其编码基因的获得316.为了寻找zmblk1的下游靶基因，我们又进行了大量的体内和体外互作验证。我们发现zmrboh4能够与zmblk1互作，并被zmblk1磷酸化(图9)。zmrboh4能够调控植物基础防御反应。因此，我们认为zmrboh4是zmwik和zmblk1下游的基因。317.玉米自交系b73的基因组dna中的zmrboh4基因的核苷酸序列如seq id no.10所示。所述zmrboh4基因的编码序列为seq id no.11，编码氨基酸序列是seq id no.12。318.seq id no.7(zmblk1基因核苷酸序列)具体序列如下：319.atggggaactgctggggtgcgcggatcaaggatgggagccctcaccctggcgcctcaggttcgtcca320.tcttatcctagccgttgcttggtaccgttggttcatggggcgatgcgatgagggtcttcggcgatccgt321.gcttgctagttgcgctctacgatcaggcggagggggtttgagatgtgaaaattccggctcgttgctac322.atgctcgcgacacatgtatctttttgcgaaatgatgtgcactcgtctgtgtgatgcgttttccccgggg323.tggggatttgacaacagaggggaactttgatcgaatcaggtatgcaatggcatgctgctgattgggct324.attccagtgggtcttgttctgttacatgattccaacctttcagctgtcttgccaacttcaaaatgtcca325.aggagctagaagtgagccatcgcaatcgctttagagtggttttgctaaagcgcgcttggaacctgag326.gcgttgtactttgtaggtcgttctgcagtctgcacttgtgcaaaaagagcttatcctttataagatgat327.agtcattaccttatttcttaaggtaatggacgggacatgtgcagtggttctttcgttatccgctcgacc328.gctcggtagcacttgccctcctgaaatgacattaataagtgacatgaggttgacttcacttaaagaaa329.ttttattactaccttattagatagcaatgctttgtgttgaccatccacctgcatgtgtagttccaaccac330.cctgtattctgtttcttgacctaggtgtaggatccaagcaggaccagtactgtggcagagtaataatta331.gtatgacttctcttgtagcattgtgtgtacagtgtaccccggatggccactgtttggcatgcttatact332.gttgagcattggtcttcactattcacattttccctcttgctaaatatatcacacaaacaaagggaaaaa333.tatttcaggagttgattaattgtttcatgttgttattatatttttattcatttgcttaatgtaccgtgtaga334.tacgaaattaggaaaagtactgaaattctaccttgatttatttttatagtgtcatgacaaggctagtaat335.gtcaaccaattcacatcagatagtcggtttctatgacctattgattaaatgttttgagtagttagtcaca336.gttatattaatgccaacttatattgtttttttctcataaaaggcatgcatgtttactgtgttatcatatgcc337.cacatcggttgctcttcactaaaatgttttaggatcctctaggaaaattgatttctggagctgattctt338.cgacatcaacaatccagcagtgctagattttttgccaaagatggcaattgttactgcctatagctgtct339.gtaggttctcttgtcaatctttagagatgaccgggcaatgattttcaatagacgcttaagtggatgtct340.cttctgggtagtgattgttgttatttatatgggcctcagatatatcggtgcaatcttattcaccattggaa341.caatatgagacttttgttcggtgttttctttttactcttcctgtttaatctttaccaaatgcatgatctgc342.aggaatgttctcaaagagtagtggtaaggatgggagtaggcttagcggctgtagtagtcgagcctct343.tcagcttctatgccaccaagtgcgaagactgaatgtgaaatcctgcgatccgccaatgttaagatctt344.caccttcaataatctcaaggcagccacaaggaatttccgtcctgatagtgttctaggtgaaggagggt345.ttggatctgtctataaaggatggatcgatgagaacacattatcaccttgcaggcctggcactgggattg346.ctgttgctgtgaaaagactcaaccatgagggtttgcaagggcaccgagagtggttggtgagtatatt347.gctattctatgctattgccctgtgaatacatgattgttcatgtttttttttaaaattttcctctcgtgtcc348.cacttttctgtgctgcctttgattactaacatagataagtattccgttcataggcggaagttaattacct349.aggtcagttctgtcatcccaaccttgtcaagctgattggatactgcttagaggatgagcaccgactgc350.tagtatacgagttcatgccccgtgggaacatggaaaaccatctgtttaggagtaagttacccaggacc351.tcggtaccgaacttttatttttgtgttcatattatgatattattactgtgatagtatatcttctgatttatta352.attgctctatgaatcctttgtgtaggaggctcatacttccaacctctgtcatggaaccttagaatgaag353.gttgcactgggagcagcaaaaggactagcttaccttcatagtgcagaggcaaaagttatttaccgag354.attttaagacttcgaacatcctccttgacacagtaagtgaaagagaatctgtaaatagggtacttcat355.gccaagatttgtttgctgtactgaaatatgtacactgtatcaatatgcaggattattctgcgaagctttc356.tgattttggattggctaaggatggtcctgtcggtgagaagagccatgtgtccacaagagttatgggaa357.catatggttatgcagctcctgagtatctttcaacaggtgacatttttgacgtgcagctctgtgtttccc358.ctccaaatttctgtaattttgcttgacaaaaacctagctaatggcgtacatatacattaaatgacacatt359.cgatataaaaatcctaaactccttaaaaatggtagggttgtataagcgggcactcctaagaccatacaa360.gaatatattaactggatattagtttaacatgttccaagcagtattgtactcattagcataagtacgattc361.cagtaagtttgttcgttttggtagcctgagttttcgatctgtatatacatgcaaaagggatcctttctg362.gctaaagatgtcctaagggcataatgaataccataaagatgcattagctatttattacataaaggtgttc363.gcgtataatcaacattagcaccacatctggtacacaatcacatgcacccattattttgttcctaaatgaa364.caaatgtatatgtaaaaggtaaggaaaaatacaaggaggttttttattttttgtaaaattaggaaaaa365.cgctagccttattcactgcaaggctcaacaggagtgttttttatttttaaaattaaaagaatagaataa366.aagaagagaagattgccaccgtcaaacagggatcgaacggctgaaattaaaaagttgatgtggctct367.ccctgttggcgtctagatgcacagcttttatatataactaaataccataaaaatgcattagctatttatta368.cataaaggtgtttgcctataatcaacattagcaccacatctggtacacaaccgcaggcacccattagc369.accacataaagatgtcattttatgaattcaatttaccgcgcttctggctttggtgcgaatatgcagtgg370.ttgtgtcttgttaggaaaagggcgccattttattttgctagccttgtatgaacagctcattcagtatgt371.gatatggatccctttctttgaacaatgccacacttttcaggtcacctaactgcaaagagcgacatctat372.agctttggggtagtgcttctggagatgctgtcaggccgccgcgccatcgacaagaaccgcccccagg373.gtgagcacaatctcgtggagtgggctcggccttacctcacacataagcgcaagatattccggatcctg374.gatacgaggctggaaggtcaatacaatctgaacggtgcacaaacaattgctgcccttgctctcgaatg375.cctatcctacgaagctaagatgaggccgactatggacgctgtggttgctattctagaagagctccagg376.gctctggtgaagccgagaagaagcttcaagaacccaaggccggaaccaaacaggcacctgctgctg377.tgagtgctagcatgagcagcagccgcaagcctcgccggaaaagtctgggagacacaaaggagactg378.ttggtgttccagatcccaaaccattggcccattctcgttag379.seq id no.8(zmblk1基因编码区序列)具体序列如下：380.atggggaactgctggggtgcgcggatcaaggatgggagccctcaccctggcgcctcaggaatgttct381.caaagagtagtggtaaggatgggagtaggcttagcggctgtagtagtcgagcctcttcagcttctatg382.ccaccaagtgcgaagactgaatgtgaaatcctgcgatccgccaatgttaagatcttcaccttcaataa383.tctcaaggcagccacaaggaatttccgtcctgatagtgttctaggtgaaggagggtttggatctgtct384.ataaaggatggatcgatgagaacacattatcaccttgcaggcctggcactgggattgctgttgctgtg385.aaaagactcaaccatgagggtttgcaagggcaccgagagtggttggcggaagttaattacctaggtc386.agttctgtcatcccaaccttgtcaagctgattggatactgcttagaggatgagcaccgactgctagtat387.acgagttcatgccccgtgggaacatggaaaaccatctgtttaggagaggctcatacttccaacctctg388.tcatggaaccttagaatgaaggttgcactgggagcagcaaaaggactagcttaccttcatagtgcag389.aggcaaaagttatttaccgagattttaagacttcgaacatcctccttgacacagattattctgcgaag390.ctttctgattttggattggctaaggatggtcctgtcggtgagaagagccatgtgtccacaagagttat391.gggaacatatggttatgcagctcctgagtatctttcaacaggtcacctaactgcaaagagcgacatct392.atagctttggggtagtgcttctggagatgctgtcaggccgccgcgccatcgacaagaaccgccccca393.gggtgagcacaatctcgtggagtgggctcggccttacctcacacataagcgcaagatattccggatcc394.tggatacgaggctggaaggtcaatacaatctgaacggtgcacaaacaattgctgcccttgctctcgaa395.tgcctatcctacgaagctaagatgaggccgactatggacgctgtggttgctattctagaagagctcca396.gggctctggtgaagccgagaagaagcttcaagaacccaaggccggaaccaaacaggcacctgctgc397.tgtgagtgctagcatgagcagcagccgcaagcctcgccggaaaagtctgggagacacaaaggagac398.tgttggtgttccagatcccaaaccattggcccattctcgttagseq id no.9具体序列(zmblk1蛋白氨基酸序列)如下mgncwgarikdgsphpgasgmfskssgkdgsrlsgcssrassasmppsakteceilrsanvkiftfnnlkaatrnfrpdsvlgeggfgsvykgwidentlspcrpgtgiavavkrlnheglqghrewlaevnylgqfchpnlvkligycledehrllvyefmprgnmenhlfrrgsyfqplswnlrmkvalgaakglaylhsaeakviyrdfktsnilldtdysaklsdfglakdgpvgekshvstrvmgtygyaapeylstghltaksdiysfgvvllemlsgrraidknrpqgehnlvewarpylthkrkifrildtrlegqynlngaqtiaalaleclsyeakmrptmdavvaileelqgsgeaekklqepkagtkqapaavsasmsssrkprrkslgdtketvgvpdpkplahsr399.seq id no.10(zmrboh4基因核苷酸序列)具体序列如下：400.atgcataaccccaggccgggcggcggggacatcgtcgagatgtcgtcgtccgccaccgccgaggggc401.gggtgatcccgcacagcggcccgctgagcaagaagtcgggcgcccggaagagcgcgcggttcgcgg402.agtccgtgtcggcgccgctgtccgcgccgccgccgcgcgcctccgccaacaacaacaacaacaacg403.acgacgacgactacgtggagatcaccctcgacgtgcgcgacgactcggtggcggtgcacagcgtca404.agcccgcccacggcggcggcgccggcgccggcgccggcgcgggcggcgacgacccggacgtgacg405.ctgctggcgcgcacgctcgagagccggcgctcctcgtcctacggccactccgtcatccggaacgcct406.cgtcgcggatcaagcaggtgtcgcaggagctccgccgcatcgcctccatcaaccgccgcggcgccgc407.ggggccccggatcgaccgctccaagtccgccgccgcgcacgcgctcaaggggctcaagttcatcagc408.aaggccgagggcgccgccggatgggaggccgtcgagaggcgcttcgacaagctcgccgagaacgg409.cctcctccaccggtccaagttcggccagtgcatcggtgagtgagtgcctgagtggtcggagccagga410.gaattggtcgagcgagcatctttcgatcgagcgtttccatcggctttttgtctttgtcgcgtgttgatt411.acgatatatgatgggtatatgaacaccactgtctgtctacagggatgaaggagccggagttcgccggc412.gagctgttcgacgcgctgtcgcggcgccgcaacatctccggcgacagcatcagcaaggcggagctg413.ctcgagttctgggaccaaatctccgacaccagcttcgacggccggctgcagacgttcttcgacatgt414.acgattgattcactgcatgttgctgctactagcctttctccaccacacacagcaagtaataataccatc415.gatcggtttgcccctgcagggtggacaaggacgccgacggaaggatcaccgaggaggaggtcaaag416.aggtaactccgtcaacagcctttctccagttggttaagccgtcgccgtcgccgtcgccgtggcccca417.agctagaacagaaatccaaataaccaaatgcttcttcctctcccggccgcagatcatcacgctgagcg418.cgtcggcgaacaagctttcgaagatcacggatcaggcggaggagtacgcccggctgatcatggagga419.gctggacccgggcaacctgggctacatcgagctgtacaacctggagatgctgctcctgcaggcgccg420.agccagtcggtgcgcatcggcacgaccaacagccggaacctgagccagatgctgagccagagcctc421.cgtccgacggcggagccgaaccctctccggcggtggtaccggcgcgcgcagtacttcctggaggac422.aactggcggcgcgtgtgggtgatgcttctgtggctgtgcatctgcgcggggctgttcgcctggaagt423.tcatccagtaccggcagcgctacgtgttccaggtgatggggtactgcgtgtgcgtggccaagggcgg424.cgcggagacgctcaagttcaacatggcgctgatcctgctcccggtgtgccggaacaccatcacctgg425.atccgcaaccgcaccgccggcgtggggcgcgtggtgcccttcgacgacaacctcaacttccacaagg426.tggtggcggtgggcatcgcggtcggggccgggctgcacatcatctcccacctgacgtgcgacttccc427.gcggctgctccacgccacggacgccgagtacgcgccgctggggcagtacttcggggtgccccgcccg428.cccaactactggtggttcgtgcgcggcacggaggggtggacggggctggtgatgctggtgctcatgg429.ccgtggcgttcaccctggcgacgccgtggttccggcggggccgcatcgcgctgcctggcccgctgcg430.gcggctgacggggttcaacgcgttctggtactcgcaccactgcttcgtggtggtgtacgcgctgctg431.atcgtgcacgggcactacctgtacctgacgcacaagtggtacaagaagtcgacgtggatgtacctgg432.ccgtgcccatggtgctgtacgcgtgcgagcgcctcaccagggcgctgcgctccagcgtcaggcccgt433.caggatcctcaaggtggccgtgtacccgggcaacgtcctctcgctccacttctccaagccgcagggc434.ttccgctacaagagcgggcagtacatcttcgtcaactgcgccgccgtgtcgccgttccagtggtaatt435.aagcaagcatcgtcttaatttgttgaggtccatgctgctgctttagctagactaggactagctagtttg436.ctgggaggaagcaaggcacagatgcttgcgctaatggcgctggatagatggatcaacgatgggatgg437.ctaaggtagactagctaatttgttggttgcaggcacccgttctccatcacgtcggccccgcaggacga438.ctacgtgagcgtccacatcaggacgctgggcgactggacccgcgagctcaagaacgtcttctcaagg439.gtacgtacgcacgcgctgatgaccgattcgctcgcagattaacgcgcgcgtgctgatctattggtgac440.cgatgcgcaggtgtgccggccgccgacggagggcaagagcgggctgctccgcgccgagtacgaccg441.cgacggcagcgccgtggccaacccgaggtgagaaatctgtcccttgaccgatggaatgcgctggcgt442.acgtctccatgacaaaaacgtggcggtggcgtcgtagttgggtgggaggtcggagcaagaagatgc443.ctatgcaggcaggcaggggttcttcttcttcttccgtgtggtagcatttgttgaccttgacccctgtgc444.ggaatttctgccaccaaatactactagtacttagtggcacggtaggtggctagctgacttattattgcg445.ttcagtttggccgttgggcatgatgagctcggcgaaccaaccacaaccaacggcggtgaccgctggc446.cggtgatattcccggcggcggatcggaacacgagctgcgactgttggtcctggtttttatccgtgggc447.cacggccggccatgcatgtctgcacgacgacggacagacagtggctgcgactgtacgggggaagcta448.ttgaccattattattagttcggactaaataactaaaccacctgtcgtgtgtcgtgtgcagcttccccaa449.ggtgctgatcgacgggccgtacggcgcgccggcgcaggactacaagcagtacgacatcgtgctgctg450.gtggggctaggcatcggcgccacgcccatgatctccatcatcaaggacatcatcaacaacatgaggca451.gctggacggcggcggcgacctggaggcctcggacgcgtcggcgtcgtcgtcgtcgatggcctcgttc452.cgcacccggcgtgcctacttctactgggtgacccgggagcaggggtccttcgagtggttccgcggcg453.tgatggacgaggtggcggagacggacaggaagggcgtcatcgagctgcacaactactgcaccagcg454.tgtacgaggaaggggacgcccggtccgcgctcatcgccatgctccagtcgctcaaccacgccaagca455.cggcgtcgacgtggtgtccggcacccgcgtcaagacccacttcgccaggcctaactggcgcaacgtc456.tacaagcgcatcgcgctcaaccaccagaaccagcgcgtcggtgagttgttgttgttgttgttcttctt457.cttcttctttgttgtgcattcctcgaccggtcgccattctacttcggtccattcgtcgaacacgtggca458.tgcattactacttgcttctctcatgacccggcggtgaaagaagctttctaccaaacccgatatgcatga459.caggccggtggtggacaggtgtgatgcgcgtgcggggagtagcagtagtagtgcaatgcggctggcc460.taactttcgttatagaagacagacagacacatgcattagaggatatagctaatcattgttgctgagact461.tgatattaattaattaattgcaggagtgttctactgcggcgccccggtgctgaccaaggagctgcgcg462.agctggcgcaggacttctcgcggaagaccaacaccaagttcgagttccacaaggagaacttctag463.seq id no.11(zmrboh4基因编码区序列)具体序列如下：464.atgcataaccccaggccgggcggcggggacatcgtcgagatgtcgtcgtccgccaccgccgaggggc465.gggtgatcccgcacagcggcccgctgagcaagaagtcgggcgcccggaagagcgcgcggttcgcgg466.agtccgtgtcggcgccgctgtccgcgccgccgccgcgcgcctccgccaacaacaacaacaacaacg467.acgacgacgactacgtggagatcaccctcgacgtgcgcgacgactcggtggcggtgcacagcgtca468.agcccgcccacggcggcggcgccggcgccggcgccggcgcgggcggcgacgacccggacgtgacg469.ctgctggcgcgcacgctcgagagccggcgctcctcgtcctacggccactccgtcatccggaacgcct470.cgtcgcggatcaagcaggtgtcgcaggagctccgccgcatcgcctccatcaaccgccgcggcgccgc471.ggggccccggatcgaccgctccaagtccgccgccgcgcacgcgctcaaggggctcaagttcatcagc472.aaggccgagggcgccgccggatgggaggccgtcgagaggcgcttcgacaagctcgccgagaacgg473.cctcctccaccggtccaagttcggccagtgcatcgggatgaaggagccggagttcgccggcgagctg474.ttcgacgcgctgtcgcggcgccgcaacatctccggcgacagcatcagcaaggcggagctgctcgagt475.tctgggaccaaatctccgacaccagcttcgacggccggctgcagacgttcttcgacatggtggacaa476.ggacgccgacggaaggatcaccgaggaggaggtcaaagaggtaactccgtcaacagcctttctcca477.gttggttaagccgtcgccgtcgccgtcgccgtggccccaagctagaacagaaatccaaataaccaaa478.tgcttcttcctctcccggccgcagatcatcacgctgagcgcgtcggcgaacaagctttcgaagatcac479.ggatcaggcggaggagtacgcccggctgatcatggaggagctggacccgggcaacctgggctacatc480.gagctgtacaacctggagatgctgctcctgcaggcgccgagccagtcggtgcgcatcggcacgacca481.acagccggaacctgagccagatgctgagccagagcctccgtccgacggcggagccgaaccctctcc482.ggcggtggtaccggcgcgcgcagtacttcctggaggacaactggcggcgcgtgtgggtgatgcttct483.gtggctgtgcatctgcgcggggctgttcgcctggaagttcatccagtaccggcagcgctacgtgttcc484.aggtgatggggtactgcgtgtgcgtggccaagggcggcgcggagacgctcaagttcaacatggcgc485.tgatcctgctcccggtgtgccggaacaccatcacctggatccgcaaccgcaccgccggcgtggggcg486.cgtggtgcccttcgacgacaacctcaacttccacaaggtggtggcggtgggcatcgcggtcggggcc487.gggctgcacatcatctcccacctgacgtgcgacttcccgcggctgctccacgccacggacgccgagt488.acgcgccgctggggcagtacttcggggtgccccgcccgcccaactactggtggttcgtgcgcggcac489.ggaggggtggacggggctggtgatgctggtgctcatggccgtggcgttcaccctggcgacgccgtgg490.ttccggcggggccgcatcgcgctgcctggcccgctgcggcggctgacggggttcaacgcgttctggt491.actcgcaccactgcttcgtggtggtgtacgcgctgctgatcgtgcacgggcactacctgtacctgacg492.cacaagtggtacaagaagtcgacgtggatgtacctggccgtgcccatggtgctgtacgcgtgcgagc493.gcctcaccagggcgctgcgctccagcgtcaggcccgtcaggatcctcaaggtggccgtgtacccggg494.caacgtcctctcgctccacttctccaagccgcagggcttccgctacaagagcgggcagtacatcttcg495.tcaactgcgccgccgtgtcgccgttccagtggcacccgttctccatcacgtcggccccgcaggacga496.ctacgtgagcgtccacatcaggacgctgggcgactggacccgcgagctcaagaacgtcttctcaagg497.gtgtgccggccgccgacggagggcaagagcgggctgctccgcgccgagtacgaccgcgacggcagc498.gccgtggccaacccgagcttccccaaggtgctgatcgacgggccgtacggcgcgccggcgcaggact499.acaagcagtacgacatcgtgctgctggtggggctaggcatcggcgccacgcccatgatctccatcatc500.aaggacatcatcaacaacatgaggcagctggacggcggcggcgacctggaggcctcggacgcgtcg501.gcgtcgtcgtcgtcgatggcctcgttccgcacccggcgtgcctacttctactgggtgacccgggagca502.ggggtccttcgagtggttccgcggcgtgatggacgaggtggcggagacggacaggaagggcgtcat503.cgagctgcacaactactgcaccagcgtgtacgaggaaggggacgcccggtccgcgctcatcgccatg504.ctccagtcgctcaaccacgccaagcacggcgtcgacgtggtgtccggcacccgcgtcaagacccact505.tcgccaggcctaactggcgcaacgtctacaagcgcatcgcgctcaaccaccagaaccagcgcgtcgg506.agtgttctactgcggcgccccggtgctgaccaaggagctgcgcgagctggcgcaggacttctcgcgg507.aagaccaacaccaagttcgagttccacaaggagaacttctag508.seq id no.12(zmrboh4蛋白氨基酸序列)具体序列如下：mhnprpgggdivemsssataegrviphsgplskksgarksarfaesvsaplsappprasannnnnnddddyveitldvrddsvavhsvkpahgggagagagaggddpdvtllartlesrrsssyghsvirnassrikqvsqelrriasinrrgaagpridrsksaaahalkglkfiskaegaagweaverrfdklaengllhrskfgqcigmkepefagelfdalsrrrnisgdsiskaellefwdqisdtsfdgrlqtffdmvdkdadgriteeevkevtpstaflqlvkpspspspwpqarteiqitkcfflsrpqiitlsasanklskitdqaeeyarlimeeldpgnlgyielynlemlllqapsqsvrigttnsrnlsqmlsqslrptaepnplrrwyrraqyflednwrrvwvmllwlcicaglfawkfiqyrqryvfqvmgycvcvakggaetlkfnmalillpvcrntitwirnrtagvgrvvpfddnlnfhkvvavgiavgaglhiishltcdfprllhatdaeyaplgqyfgvprppnywwfvrgtegwtglvmlvlmavaftlatpwfrrgrialpgplrrltgfnafwyshhcfvvvyallivhghylylthkwykkstwmylavpmvlyacerltralrssvrpvrilkvavypgnvlslhfskpqgfryksgqyifvncaavspfqwhpfsitsapqddyvsvhirtlgdwtrelknvfsrvcrpptegksgllraeydrdgsavanpsfpkvlidgpygapaqdykqydivllvglgigatpmisiikdiinnmrqldgggdleasdasassssmasfrtrrayfywvtreqgsfewfrgvmdevaetdrkgvielhnyctsvyeegdarsaliamlqslnhakhgvdvvsgtrvkthfarpnwrnvykrialnhqnqrvgvfycgapvltkelrelaqdfsrktntkfefhkenf509.实施例5、zmrboh4基因编辑植株的获得和鉴定510.一，基因编辑载体的构建511.设计基因编辑的靶点序列为：5’‑ggaagagcgcgcggttcgc-3’(seq id no.13)512.构建基因编辑载体，即如下重组质粒pbue411-sgrna：在pbue411载体的bsai识别位点插入序列表的seq id no.13所示的双链dna分子后得到的重组质粒。重组质粒pbue411-sgrna已进行测序验证。基因编辑载体中具有cas9基因，并表达得到cas9蛋白。构建的基因编辑载体pbue411-sgrna用于对zmrboh4基因进行基因敲除。513.seq id no.13具体序列(zmrboh4基因编辑靶点)如下：ggaagagcgcgcggttcgc二，基因编辑植株的获得514.1、将重组质粒pbue411-sgrna导入根癌农杆菌eha105，得到重组农杆菌eha105/pbue411-sgrna。515.2、取步骤1得到的重组农杆菌eha105/pbue411-sgrna，采用农杆菌介导法对玉米自交系b73的幼胚进行遗传转化，得到t0代植株。516.3、从t0代植株中筛选目标序列发生变异的植株。517.具体方法：取植株叶片，提取基因组dna，采用rboh4cas f和rboh4cas r组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物并进行测序，将测序结果与野生型序列进行比较，筛选得到具有差异序列的植株。518.rboh4cas f:5’‑atgcataaccccaggccgggcgg-3’519.rboh4cas r:5’‑tcctgcgacacctgcttgat-3’520.4、取步骤3筛选的t0代植株，自交并收获籽粒，将籽粒培育为植株，即为t1代植株。521.5、从t1代植株中筛选基因编辑植株。522.(1)将植株进行以基因编辑载体中的bar基因为靶标的pcr鉴定。鉴定引物同实施例2中的bar-f和bar-r。pcr鉴定方法：523.取植株叶片，提取基因组dna，采用bar-f和bar-r组成的引物对进行pcr扩增，如果没有得到扩增产物、pcr鉴定为阴性。524.(2)将植株进行以基因编辑目标区域为靶标的鉴定。鉴定方法同步骤3。525.如果某一植株bar基因pcr鉴定为阴性，且编辑位点的鉴定结果显示与野生型序列具有差异且为纯合型(且两条同源染色体一致)，该植株为纯合突变基因编辑植株。526.获得了两株纯合突变基因编辑植株，分别命名为zmrboh4 ko#1植株和zmrboh4 ko#2植株。测序鉴定结果如图10。与野生型玉米自交系b73相比，两条同源染色体中zmrboh4基因均发生突变：527.zmrboh4 ko#1植株是在野生型植株基因组序列的序列seq id no.10的第115-116位核苷酸之间插入了1个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸残基(t)，zmrboh4 ko#2植株缺失野生型植株的序列seq id no.10的第115位腺嘌呤脱氧核糖核苷酸残基(a)，两种突变均造成移码突变，从而将zmrboh4基因敲除。528.6、取基因编辑植株zmrboh4 ko#1和zmrboh4 ko#2，自交2代，获得后代植株，即为基因编辑纯合株系。529.获得了两个基因编辑株系，分别命名为zmrboh4 ko#1株系和zmrboh4 ko#2株系。530.三、基因编辑植株的抗病性鉴定531.供试植株为：zmrboh4 ko#1株系的t2代植株66株、zmrboh4 ko#2株系的t2代植株78株和玉米自交系b73植株120株。532.方法同实施例2的步骤四的中步骤2。533.抗病性鉴定结果见图11。图11中，不同字母表示差异显著性，箱线图下面数字表示株系数目。结果显示，相对于玉米自交系b73植株，基因编辑植株的病情等级显著增加。534.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。









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