用于鉴定菲牛蛭的特异性引物及快速PCR方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术末端位于菲牛蛭与日本医蛭、宽体金线蛭、天目山蛭的差异区域，tm值为55～65℃，预期扩增长度为251bp，得到所述特异性引物。10.一种用于鉴定菲牛蛭的pcr方法，包括上述的上游引物l315和下游引物h566。11.优选的是，pcr反应体系为：takara premix ex taq 12.5μl，上游引物l315、下游引物h566各1μl，并使引物终浓度为0.4μm，dna模板1μl，加无菌双蒸水至25μl；12.pcr扩增程序为：94℃预变性1min，94℃变性30s，52℃退火30s，28个循环。13.优选的是，在pcr扩增产物中加入sybr green i于365nm紫外波长下检测荧光，产生强烈绿色荧光的为菲牛蛭。14.本发明至少包括以下有益效果：15.第一、本发明针对现有pcr技术在菲牛蛭鉴别应用中的不足，以菲牛蛭及其他物种在co1序列具有稳定差异的snp位点为基础设计了菲牛蛭的特异性引物，并利用快速pcr建立了菲牛蛭区别于其他蛭类的鉴定方法。16.第二、本发明的创造性的结合了快速pcr技术对菲牛蛭进行鉴定，采用碱裂解法提取dna，其较一般提取方法操作更为简便和快速，优化的pcr反应参数较一般的分子鉴定方法也耗时更短。17.第三、本发明引入荧光染料对扩增产物进行检测，可达到快速鉴别目的。样品不需要经过测序等方法，只需根据紫外灯下荧光检测结果即可完成菲牛蛭的鉴定，也适用于快速鉴定大批量样品，较大提高了鉴别效率，解决菲牛蛭市场掺伪的问题，对于保证菲牛蛭临床用药安全和疗效、规范菲牛蛭市场秩序具有重要意义。18.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明19.图1为co1通用引物pcr扩增产物电泳结果，其中，m为d2000 dna marker；w为空白对照；1～10为菲牛蛭(鲜品)；11～13为菲牛蛭(药材)；14～19为宽体金线蛭(药材)；20～28为宽体金线蛭(鲜品)；29～37为日本医蛭(鲜品)；38～43为天目山蛭(鲜品)；20.图2为特异性引物pcr扩增产物电泳结果，其中，注：m为d2000 dna marker；w为空白对照；1～10为菲牛蛭(鲜品)；11～13为菲牛蛭(药材)；14～19为宽体金线蛭(药材)；20～28为宽体金线蛭(鲜品)；29～37为日本医蛭(鲜品)；38～43为天目山蛭(鲜品)；21.图3为快速pcr扩增产物的荧光检测结果图。具体实施方式22.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。23.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。24.需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。25.实施例1、基因组dna提取及检测26.一、溶液的配置27.溶液a：用量筒量取97ml灭菌水于烧杯中，再用移液器吸取曲拉通100(纯度为98％)1ml，搅拌溶解。28.溶液b：取氢氧化钠固体0.8g于一小烧杯中，加入20ml灭菌水。称取tris-hcl固体7.88g，于另一小烧杯中，先加入约40ml的灭菌水，后续少量多次加入适量的氢氧化钠溶液和灭菌水，调节至溶液的总体积为50ml，ph＝8。得到50ml 1m的tris-hcl溶液(ph＝8)，取该溶液10ml于玻璃瓶中，量筒量取90ml灭菌水，稀释得到0.1m的tris-hcl溶液(ph＝8)，待用。29.试剂c：分别取0.5g氢氧化钠、0.25g聚乙烯吡咯烷酮至烧杯中，溶于溶液a(25ml)中，配成dna提取缓冲液，轻微摇晃振荡，完全溶解后待用。30.二、基因组总dna的提取31.使用75％酒精擦拭样品(样品来源如表1所示)表面，晾干。取样品肌肉组织约30mg，鲜品样品用手术剪剪碎，灭菌水洗净，药材剪成小碎块。放入2ml编号管中。使用75％酒精对磁珠进行灭菌，每个编号管分别加入灭菌后干燥的磁珠，dna提取研磨仪研碎，得到研磨样品。32.使用时向研磨样品中加入200μldna提取缓冲液，涡旋振荡充分混匀；加入800μl溶液b，涡旋振荡充分混匀，12000rpm离心1min；取500μl上清液至新的2ml离心管内，分别加入500μl溶液b，涡旋振荡混匀；-20℃保存备用。33.表1样品来源[0034][0035]三、pcr扩增目的基因[0036]使用co1通用引物(lco1490:5′‑ggtcaacaaatcataaagatattgg-3′、hco2198:5′‑taaacttcagggtgaccaaaaaatca-3′)对所上述提取的dna样品进行pcr扩增，扩增条件如表2所示。[0037]表2引物及pcr反应条件[0038][0039]四、pcr扩增产物检测[0040]配置浓度为1％琼脂糖凝胶，即称取1g琼脂糖于锥形瓶中，加入100ml 1×tae缓冲溶液放入微波炉加热3min，移液器吸取1μl核酸染料，加入溶解的凝胶溶液中，并充分混匀倒入制胶板中，30min后凝胶成形，放置于电泳仪上，加入1×tae电泳缓冲液浸泡过琼脂糖凝胶。[0041]取3μl扩增好dna样品和2μl 6×loading buffer充分混匀后，每孔5μl点样到点样孔中，并在样品两侧点入5μl d2000 dna marker和空白对照。上样完毕后，设置电压135v运行30～40min。[0042]电泳结束取出凝胶放置于syngene凝胶成像系统观察、拍照，检测所提dna的质量。凝胶电泳检测结果见图1。琼脂糖凝胶电泳图结果显示所提取的dna样品均能扩增目的片段，获得约700bp dna条带，表明采用碱裂解法提取样品所得的dna是有效的，可以满足后续的实验研究。[0043]实施例2、特异性引物设计与合成[0044]一、序列比对[0045]从ncbi数据库(national center for biotechnology information)中下载菲牛蛭、日本医蛭、宽体金线蛭、天目山蛭的coi序列，下载的序列一起利用bioedit软件进行多重序列比对，找出具有稳定差异的变异位点，选择菲牛蛭与其他蛭种差异大的区域进行引物设计。[0046]二、引物设计[0047]使用引物设计软件premier primer 5.0设计特异性引物，调整参数使引物的3'末端位于菲牛蛭与其他蛭种差异区域，tm值为55～65℃，预期扩增长度为251bp。最终确定引物(l315：5’‑tgttggtacaggatgaacta-3’，h566：5’‑gctgctgctaatactggta-3’)，所设计的引物由南宁捷尼斯生物科技有限公司合成。[0048]实施例3、pcr扩展条件优化[0049]以菲牛蛭及其他蛭类样品的基因组dna为模板，特异性鉴别引物l315、h566进行快速pcr扩增反应条件优化，分别考察退火温度、循环次数、退火时间、引物终浓度、模板体积以及不同dna酶种类、不同型号pcr扩增仪对pcr反应稳定性的影响。具体影响因素见表3。[0050]表3pcr反应因素考察表[0051][0052]一、退火温度[0053]影响特异性快速pcr反应的关键因素有很多，首先考察了退火温度，分别考察了45℃，52℃，58℃和65℃。结果显示，当退火温度为45℃时，除菲牛蛭药材有目的条带出现外，其他蛭类物种无目的条带存在，但总体条带有些淡；当退火温度为52℃时，菲牛蛭样品在约251bp处有一清晰明亮的目的条带，其他蛭类样品未检测出目的条带；当退火温度设置为58℃时，菲牛蛭样品有明亮目的条带，但其中有1个样品无目的条带存在，其他蛭类样品未检测出目的条带；当退火温度设置为65℃时，菲牛蛭和其他蛭类样品均无目的条带存在。荧光检测结果与电泳结果一致。可见，在四个退火温度中，只有45℃和52℃能完全扩增出目的条带，且52℃较45℃出现的目的条带亮度更强，因此，最终选择退火温度为52℃。[0054]二、循环次数[0055]循环次数分别设置为20次、28次、31次和35次考察特异性快速pcr反应条件。结果显示，当循环次数为20次时，所有菲牛蛭样品有目的条带出现，但比较浅，荧光不明显，其他蛭类样品条带均不出；当循环次数为28次时，菲牛蛭样品均有明亮的目的条带，荧光明显，其他蛭类样品条带均不出；分别设置循环次数为31和35次时，菲牛蛭样品虽有明亮的目的条带，但偶有条带比较浅。荧光检测结果与电泳结果一致。可见，在四个循环次数中，虽然菲牛蛭样品均能出现目的条带，由于循环次数越多，pcr反应所需时间越长，四个循环次数(20次、28次、31次和35次)所用时长分别为：43分钟、55分钟、65分钟、74分钟，因此，兼顾pcr扩增效率，最终选择循环次数为28次。[0056]三、退火时间[0057]退火时间分别设置为5s，10s，20s和30s。结果显示，当退火时间为5s时，菲牛蛭样品的目的条带总体都较浅，其中有1个样品无目的条带，其他蛭类样品均无目的条带；当退火时间为10s时，菲牛蛭样品的目的条带也较浅，其中有1个样品无目的条带，三个样品条带极浅，其他蛭类样品均无目的条带；当退火时间为20s时，菲牛蛭样品的目的条带明亮，但其中有三个样品目的条带极浅，其他蛭类样品均无目的条带；当退火时间为30s时，菲牛蛭样品均有明亮的目的条带，荧光明显，其他蛭类样品条带均不出。因此，最终选择退火时间选择为30s。[0058]四、引物终浓度[0059]引物终浓度分别考察了0.1μm，0.2μm，0.4μm，0.6μm。结果显示，当引物最终浓度为0.1μm，0.2μm和0.6μm时，有部分菲牛蛭药材样品无目的条带；当引物最终浓度为0.4μm时，菲牛蛭药材样品均检测出明亮的目的条带，其他蛭类物种条带均不出。荧光检测结果与电泳结果一致，浓度为0.4μm时荧光最明显。因此，最终选择引物终浓度为0.4μm用于菲牛蛭快速pcr法鉴别。[0060]五、模板体积[0061]模板体积分别考察了0.5μl，1μl，3μl，6μl。结果显示，当模板体积分别为0.5μl，3μl，6μl时，菲牛蛭样品的目的条带总体均较浅，其他蛭类样品无目的条带，其中模板体积为3μl时，菲牛蛭样品中有1个样品不出条带，模板体积为6μl时，菲牛蛭样品中有6个样品不出条带，只有当模板体积为1μl时，菲牛蛭样品均检测出明亮的目的条带，其他物蛭类样品条带均不出。荧光检测结果与电泳结果一致。因此，最终选择模板体积为1μl选用于菲牛蛭快速pcr法鉴别。[0062]六、dna酶种类[0063]dna酶种类分别考察了takara taq酶、takara ex taq酶和天根taq酶，琼脂糖凝胶电泳检测结果图表明，当使用天根taq酶时，仅有一个菲牛蛭样品产生目的条带，菲牛蛭其他样品及其他蛭类样品均无目的条带。当使用takara taq酶时，部分菲牛蛭样品未能扩增出目的条带；当使用takara ex taq酶时，菲牛蛭样品均检测出明亮的目的条带，其他蛭类样品条带均不出。因此，最终选择takara ex taq酶用于菲牛蛭快速pcr法鉴别。[0064]七、pcr扩增仪[0065]pcr扩增仪考察了美国伯乐(bio-rad)t100 pcr仪、德国耶拿(biometra)型pcr仪和瑞士罗氏(roche)lightcyclerpcr仪，琼脂糖凝胶电泳结果表明，三种pcr扩增仪均能把菲牛蛭样品扩增出目的条带，且差别不大，其他蛭类样品均未能扩增出目的条带，荧光检测结果与电泳结果一致，表明pcr反应条件在不同厂家型号的pcr扩增仪的扩增的结果具有稳定性。[0066]综合以上实验结果，最终确定菲牛蛭快速pcr鉴别方法为：pcr扩增反应体系为25μl，包括takara premix ex taq 12.5μl，上游引物、下游引物各1μl(引物最终浓度为0.4μm)，dna模板1μl，加无菌双蒸水至25μl。pcr扩增程序为94℃预变性1min，94℃变性30s，52℃复性30s，28次循环。以1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，所有菲牛蛭样品在251bp附近有一清晰特异性条带，而其他蛭类样品无条带。在扩增产物加入2μl100×sybr green i染料，菲牛蛭样品显示出明亮绿色荧光，而其他蛭类样品不显示荧光。[0067]实施例4、菲牛蛭的pcr鉴定[0068]采用碱裂解法提取样品所得的dna，选择优化的pcr反应参数对菲牛蛭样品及其混伪品进行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果表明，菲牛蛭样品均能获得有效扩增，在251bp处有一清晰条带，如图2所示；在pcr扩增产物中加入2μl 100×sybr green i于365nm紫外波长下检测荧光，菲牛蛭样品均产生强烈绿色荧光，而其他样品无荧光，结果见图3。与凝胶电泳结果一致，鉴别结果准确。[0069]本发明的快速pcr鉴别方法，提取基因组dna时间少于10分钟，pcr扩增约50分钟，整个菲牛蛭的分子鉴别操作可在1小时内完成。[0070]采用普通的pcr鉴别方法，如申请号cn201810824002.0提供的方法，提取基因组dna至少需要3小时，pcr扩增至少需要2.5小时，琼脂糖凝胶电泳需要30分钟，整个菲牛蛭的分子鉴别操作至少需要6小时。可见，本发明方法的鉴别效率大大提高。[0071]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!