化合物、乙醛脱氢酶2激活剂、医药组合物、以及治疗及/或预防药的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及化合物、乙醛脱氢酶2激活剂、医药组合物、以及治疗及/或预防药。背景技术：2.乙醛脱氢酶2(aldh2)是分解乙醛等醛类的酶，已报道了其与各种疾病(例如，范科尼贫血、骨质疏松症、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝损伤、胰腺炎、缺血再灌注损伤、外周动脉疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、食道癌、头颈癌、及疼痛)的关系。3.范科尼贫血(fa)是遗传性的骨髓衰竭疾病，伴有再生障碍性贫血、白血病、癌、畸形等症状。在骨髓中制作血液的干细胞中，适当地分解醛、修复损伤的基因组是重要的，然而，有报道称在fa患者中无法修复由醛导致的基因组损伤而导致贫血发展(例如，非专利文献1)。4.在与骨质疏松症的关系上，有报道称：在aldh2基因突变模型小鼠中呈现出骨质疏松症的症状，骨密度降低；前述模型小鼠的成骨细胞的分化形成能力显著降低；以及，在人类中，具有aldh2基因突变的成骨细胞的形成能力也降低(例如，非专利文献2)。5.nafld及nash是以代谢性疾病为背景、由于在肝脏中蓄积中性脂肪而发病的，有报道称：在aldh2的低活性基因型的人中，nafld的发病率高(例如，非专利文献3)。另外，酒精性肝损伤及胰腺炎是由于过量的饮酒而引起的，认为乙醇在生物体内被分解而产生的乙醛是其主要原因。此外，有报道称：在nafld、nash、酒精性肝损伤、及胰腺炎的病理模型中，通过aldh2激活化合物或aldh2基因的导入而改善了病状(例如，非专利文献4、5及6)。6.缺血再灌注损伤是因动脉的阻塞而使器官的缺血状态持续后、由于恢复血液供给而产生的组织损伤。为了针对缺血再灌注损伤进行保护，有报道称aldh2激活化合物是有效的(例如，专利文献1)。另外，还提示了外周动脉疾病与aldh2的关联(例如，非专利文献7)。7.阿尔茨海默病、帕金森氏病是原因不明的神经变性疾病，但有报道称饮酒、aldh2基因突变有助于病状的发病、发展(例如，非专利文献8及9)。8.食道癌的危险因素被认为是吸烟、饮酒、及热饮、食物的过量摄取，国际癌症研究机构(iarc)在2010年将酒精饮料认定为食道鳞状细胞癌的致癌物质。已报道了食道癌与饮酒及aldh2的关联性，即，有报道称：根据食道癌及头颈癌患者的分析，提示了通过戒酒来抑制食道癌进展的可能性；在敲入了低活性突变型的人ald h2基因的小鼠中，通过饮酒而更强烈地受到食道中的dna损伤；等等(例如，非专利文献10及11)。同样地，已报道了头颈癌与aldh2的关联性(例如，非专利文献12)。9.作为疼痛，大体上已知有炎症性(损伤感受性)、神经性、及原因不明的疼痛，有报道称：在使用了小鼠的炎症性疼痛模型中，aldh2突变型导入小鼠更容易感到疼痛刺激，可利用aldh2激活化合物解除(例如，非专利文献13)。10.如上所述，已报道了aldh2与各种疾病的关系，因此期待将aldh2激活对于各种疾病的治疗及/或预防而言有效。作为具有ald h2的激活作用的化合物，例如，已知有专利文献1～4中记载的化合物。11.现有技术文献12.专利文献13.专利文献1：国际公开第2008/112164号公报14.专利文献2：国际公开第2014/160185号公报15.专利文献3：国际公开第2015/127137号公报16.专利文献4：国际公开第2019/151241号公报17.非专利文献18.非专利文献1：blood(2013)122(18):3206-320919.非专利文献2：journal of bone and mineral research(2012)27(9):2015-202320.非专利文献3：nutrition&diabetes(2016)6,e21021.非专利文献4：redox biology(2019)24:10120522.非专利文献5：journal of hepatology(2015)62:647-65623.非专利文献6：biochemical and biophysical research commun ications(2020)522:518-52424.非专利文献7：pharmacological research(2017)115:96-10625.非专利文献8：biochemical and biophysical research commun ications(2000)273:192-19626.非专利文献9：neurology(2014)82:419-42627.非专利文献10：gastroenterology(2016)151:860-86928.非专利文献11：carcinogenesis(2020)41:194-20229.非专利文献12：international journal of oncology(2008)32:945-97330.非专利文献13：science translational medicine(2014)6:251ra118技术实现要素：31.发明所要解决的课题32.本发明的目的是提供具有aldh2激活作用的化合物、或包含前述化合物的aldh2激活剂、医药组合物、或者治疗或预防药。33.用于解决课题的手段34.本技术的发明人进行了深入研究，结果发现，具有规定结构的化合物具有aldh2激活作用，从而完成了本发明。35.本发明包括以下的实施方式。36.1.37.下述式(1)表示的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药。38.[化学式1][0039][0040][式中，[0041]a为杂环，[0042]r1及r2各自独立地为氢、烷基、烯基、或炔基，[0043]r3为烷基、烯基、或炔基，[0044]x1及x2各自独立地为卤素][0045][2][0046]如[1]所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，a包含至少1个氮原子作为环成员原子。[0047][3][0048]如[1]或[2]所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，a为5或6元环。[0049][4][0050]如[1]～[3]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，a为芳香族杂环。[0051][5][0052]如[1]～[4]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，式(1)表示的化合物为下述式(2)或(3)表示的化合物。[0053][化学式2][0054][0055][化学式3][0056][0057][式中，r1、r2、r3、x1及x2如上所述][0058][6][0059]如[1]～[5]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，r1为氢或烷基。[0060][6-1][0061]如[1]～[6]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，r1为氢或甲基。[0062][6-2][0063]如[1]～[6-1]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，r1为氢。[0064][7][0065]如[1]～[6-2]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，r2为氢或烷基。[0066][7-1][0067]如[1]～[7]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，r2为氢或甲基。[0068][7-2][0069]如[1]～[7-1]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，r2为氢。[0070][8][0071]如[1]～[7-2]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，r3为被卤素取代的烷基或未取代的烷基。[0072][8-1][0073]如[1]～[8]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，r3为被氟取代的甲基或未取代的甲基。[0074][8-2][0075]如[1]～[8-1]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，r3为未取代的甲基。[0076][9][0077]如[1]～[8-2]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，x1为氟或氯。[0078][10][0079]如[1]～[9]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，x2为氟。[0080][11][0081]如[1]～[10]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其中，式(1)表示的化合物选自由下述化合物组成的组。[0082][化学式4][0083][0084][12][0085]如[1]～[11]中任一项所述的前药或其医药上可容许的盐，其中，r1为-ch2-o-po3h2。[0086][13][0087]如[1]～[11]中任一项所述的前药或其医药上可容许的盐，其中，a包含至少1个氮原子作为环成员原子，前述氮原子中的至少1个被-ch2-o-po3h2取代。[0088][14][0089]如[1]～[13]中任一项所述的前药或其医药上可容许的盐，其中，前药或其医药上可容许的盐选自由下述化合物组成的组。[0090][化学式5][0091][0092][15][0093]乙醛脱氢酶2激活剂，其包含[1]～[14]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药。[0094][16][0095]医药组合物，其包含[1]～[14]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药。[0096][17][0097]疾病的治疗及/或预防药，所述疾病选自由范科尼贫血、骨质疏松症、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(na sh)、酒精性肝损伤、胰腺炎、缺血再灌注损伤、外周动脉疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、食道癌、头颈癌、及疼痛组成的组，所述治疗及/或预防药包含[1]～[14]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药。[0098][a1][0099]将乙醛脱氢酶2激活的方法，所述方法包括向有需要的患者施予有效量的[1]～[14]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药。[0100][a2][0101]治疗及/或预防疾病的方法，所述疾病选自由范科尼贫血、骨质疏松症、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝损伤、胰腺炎、缺血再灌注损伤、外周动脉疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、食道癌、头颈癌、及疼痛组成的组，所述方法包括向有需要的患者施予有效量的[1]～[14]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药。[0102][b1][0103]如[1]～[14]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其用于乙醛脱氢酶2的激活。[0104][b2][0105]如[1]～[14]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药，其用于疾病的治疗及/或预防，所述疾病选自由范科尼贫血、骨质疏松症、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝损伤、胰腺炎、缺血再灌注损伤、外周动脉疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、食道癌、头颈癌、及疼痛组成的组。[0106][c1][0107][1]～[14]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药用于将乙醛脱氢酶2激活的用途。[0108][c2][0109][1]～[14]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药用于治疗及/或预防疾病的用途，所述疾病选自由范科尼贫血、骨质疏松症、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝损伤、胰腺炎、缺血再灌注损伤、外周动脉疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、食道癌、头颈癌、及疼痛组成的组。[0110][d1][0111][1]～[14]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药在乙醛脱氢酶2激活剂的制造中的用途。[0112][d2][0113][1]～[14]中任一项所述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药在疾病的治疗及/或预防药的制造中的用途，所述疾病选自由范科尼贫血、骨质疏松症、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝损伤、胰腺炎、缺血再灌注损伤、外周动脉疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、食道癌、头颈癌、及疼痛组成的组。[0114]发明效果[0115]根据本发明，可以提供具有aldh2激活作用的化合物、或包含前述化合物的aldh2激活剂、医药组合物、或者治疗或预防药。具体实施方式[0116]以下，对本发明的实施方式进行具体说明，但本发明不限于此，可在不脱离其要旨的范围内进行各种变形。[0117]《化合物》[0118]本发明的一个实施方式涉及下述式(1)表示的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药。[0119][化学式6][0120][0121][式中，[0122]a为杂环，[0123]r1及r2各自独立地为氢、烷基、烯基、或炔基，[0124]r3为烷基、烯基、或炔基，[0125]x1及x2各自独立地为卤素][0126]式(1)中，a优选包含至少1个氮原子作为环成员原子。a优选为5或6元环。a优选为芳香族杂环。虽无特别限定，但a优选为吡啶环或吡唑环。[0127]式(1)中，r1～r3的烷基、烯基、及炔基可以为直链状，也可以为支链状。r1～r3的烷基、烯基、及炔基可以被取代基取代，也可以未取代。作为前述取代基，例如，可以举出卤素(氟、氯、溴、或碘)。具有取代基的情况下，作为取代基的数量，例如，可以举出1个、2个或3个。[0128]式(1)中，r1～r3的烷基各自独立地优选为碳原子数1～6的烷基，更优选为碳原子数1～3的烷基，进一步优选为甲基。r1～r3的烯基各自独立地优选为碳原子数2～6的烯基，更优选为碳原子数2～4的烯基。r1～r3的炔基各自独立地优选为碳原子数2～6的炔基，更优选为碳原子数2～4的炔基。[0129]式(1)中，从aldh2活性及代谢稳定性的观点考虑，r1优选为氢或烷基，更优选为氢或甲基，进一步优选为氢。[0130]式(1)中，从aldh2活性及代谢稳定性的观点考虑，r2优选为氢或烷基，更优选为氢或甲基，进一步优选为氢。[0131]式(1)中，从代谢稳定性的观点考虑，r3优选为被卤素取代的烷基或未取代的烷基，更优选为被氟取代的甲基或未取代的甲基，进一步优选为未取代的甲基。[0132]式(1)中，x1优选为氟、氯、溴、或碘，更优选为氟或氯，进一步优选为氟。[0133]式(1)中，x2优选为氟、氯、溴、或碘，更优选为氟或氯，进一步优选为氟。[0134]式(1)表示的化合物没有特别限定，优选为下述式(2)或(3)表示的化合物。[0135][化学式7][0136][0137][化学式8][0138][0139][式中，r1、r2、r3、x1及x2如上所述][0140]式(1)表示的化合物没有特别限定，但优选为下述的化合物。[0141][化学式9][0142][0143]作为上述的化合物的前药，例如，可以举出磷酸化前药，更具体而言，可以举出r1为-ch2-o-po3h2的前药、及作为a的环成员原子的氮原子中的至少1个被-ch2-o-po3h2取代的前药。[0144]前药或其医药上可容许的盐没有特别限定，但优选为下述的化合物。[0145][化学式10][0146][0147]上述的化合物或前药的医药上可容许的盐只要能用作医药即可，没有特别限定，例如，可以举出盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、氢溴酸盐等无机酸盐；富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、乙酸盐、乳酸盐、棕榈酸盐等有机酸盐；碱金属盐；及碱土金属盐。[0148]上述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药也可以形成水合物等溶剂合物。本说明书中，溶剂合物被包括在上述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药中。[0149]上述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药存在立体异构体(例如，对映异构体、非对映异构体)的情况下，各个立体异构体及它们的混合物(例如，消旋体)被包括在上述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药中。[0150]《乙醛脱氢酶2激活剂》[0151]本发明的一个实施方式涉及aldh2激活剂，其包含上述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药。本实施方式的aldh2激活剂不仅aldh2激活作用优异，而且具有更优异的性质(例如，优异的代谢稳定性，抑制反应性代谢物的生成，避免对herg的抑制)。[0152]通过使用本实施方式的aldh2激活剂，能够治疗及/或预防与aldh2相关的疾病。[0153]《医药组合物以及治疗及/或预防药》[0154]本发明的一个实施方式涉及医药组合物，其包含上述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药。另外，本发明的一个实施方式涉及治疗及/或预防药，其包含上述的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药。[0155]作为本实施方式的医药组合物以及治疗及/或预防药的对象疾病，例如，可举出范科尼贫血、骨质疏松症、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝损伤、胰腺炎、缺血再灌注损伤、外周动脉疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、食道癌、头颈癌、及疼痛等。[0156]本实施方式的医药组合物以及治疗及/或预防药可以经口或非经口地施予。作为经口施予用的剂型，例如，可举出片剂、丸剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、及混悬剂。作为非经口施予用的剂型，例如，可举出注射剂、注入剂、点滴剂、滴眼剂及栓剂。[0157]本实施方式的医药组合物以及治疗及/或预防药可以根据需要包含赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、甜味剂、表面活性剂、悬浮剂、乳化剂、着色剂、防腐剂、芳香剂、矫味剂、稳定剂、增粘剂等。[0158]本实施方式的医药组合物以及治疗及/或预防药的施予量(以有效成分为基准)根据患者的状态、体重、化合物的种类、疾病的种类、施予途径等而不同，医生可以确定适当的量。作为一例，在治疗范科尼贫血、骨质疏松症、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝损伤、胰腺炎、缺血再灌注损伤、外周动脉疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、食道癌、头颈癌、及疼痛等时，对于成人(体重为约60kg)而言，在经口施予的情况下，可以施予1～2000(mg)，在非经口施予的情况下，可以施予0.01～200(mg)。[0159]《化合物的制造方法》[0160]上述的化合物或其医药上可容许的盐可以适宜地利用已知的方法合成。作为合成方法的一例，可以举出下述的合成路径a。[0161][化学式11][0162]《合成路径a》[0163][0164][r2、r3、x1及x2如上所述，xa及xb各自独立地为卤素。][0165]工序a1中，使用碘甲烷将化合物(a1)酯化，得到化合物(a2)。[0166]工序a2中，使化合物(a2)与还原剂(例如，硼氢化钠)反应，得到化合物(a3)。[0167]工序a3中，使化合物(a3)与强碱(例如，氢化钠)反应后，使其与提供r3的卤化物(例如，碘甲烷)反应，得到化合物(a4)。[0168]工序a4中，使用氰基化试剂(例如，氰化锌)将化合物(a4)氰基化，得到化合物(a5)。[0169]工序a5中，使化合物(a5)与还原剂(例如，硼烷二甲硫醚络合物)反应，得到化合物(a6)。[0170]工序a6中，使化合物(a6)与化合物(a7)反应，得到化合物(a8)。[0171]工序a7中，使化合物(a8)与双(频哪醇合)二硼反应，得到化合物(a9)。[0172]工序a8中，使化合物(a9)与2-卤代吡啶3-甲醛反应，得到化合物(a10)。[0173]工序a9中，使化合物(a10)与还原剂(例如，硼氢化钠)或提供r2的格氏试剂反应，得到化合物(a11)。[0174]作为上述的化合物或其医药上可容许的盐的其他合成方法，也可以举出下述的合成路径b。[0175][化学式12][0176]《合成路径b》[0177][0178][r2、r3、x1及x2如上所述，xc为卤素。][0179]工序b1中，使化合物(b1)与化合物(b2)反应，得到化合物(b3)。[0180]工序b2中，使化合物(b3)与化合物(a6)反应，得到化合物(b4)。[0181]工序b3中，使化合物(b4)与还原剂(例如，硼氢化钠)反应，得到化合物(b5)。[0182]作为上述的化合物或其医药上可容许的盐的其他合成方法，也可以举出下述的合成路径c。[0183][化学式13][0184]《合成路径c》[0185][0186][r1～r3、x1及x2如上所述，xd为卤素。][0187]工序c1中，使化合物(c1)与化合物(a9)反应，得到化合物(c2)。[0188]上述的化合物或其医药上可容许的盐的合成方法不限于上述合成路径a～c，本领域技术人员可以根据最终化合物的结构而适宜地设定适当的合成路线及反应条件。例如，最终化合物具有吡啶环以外的杂环(例如吡唑环)的情况下，代替合成路径c中的化合物(c1)而使用具有对应的杂环的化合物即可。[0189]对于上述的化合物或其医药上可容许的盐的前药而言，利用已知的方法导入例如磷酸基来合成即可。[0190]式(1)表示的化合物、其医药上可容许的盐或它们的前药存在立体异构体的情况下，可以利用已知的方法对各异构体进行拆分。作为已知的方法，例如，可以举出色谱法、酶法、及结晶法。[0191]实施例[0192]以下，使用实施例及比较例对本发明进行更详细的说明，但本发明的技术范围不限于此。[0193][制造例1-1][0194]4-溴-2-氟苯甲酸甲酯[0195][化学式14][0196][0197]于室温向4-溴-2-氟苯甲酸(30g，0.14mol)、碳酸钾(38g，0.27mol)、及n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(300ml)的混合物中加入碘甲烷(16ml，0.27mol)，于相同温度搅拌16小时。向反应混合物中加入水(200ml)，用乙酸乙酯(300ml)萃取。用硫酸钠使有机层干燥，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到标题化合物(30g)。[0198]1h-nmr波谱(cdcl3)δ(ppm):3.94(3h,s),7.81(1h,s,j＝16hz),7.32(2h,m).[0199][制造例1-2][0200](4-溴-2-氟苯基)甲醇[0201][化学式15][0202][0203]于0℃，经30分钟将硼氢化钠(0.38g，10mmol)加入制造例1-1中得到的4-溴-2-氟苯甲酸甲酯(30g，0.13mol)与甲醇(300ml)的混合物中，于60℃搅拌16小时。向反应混合物中加入水(20ml)，在减压下将反应混合物中的甲醇蒸馏除去。向反应混合物中加入水(250ml)，用二氯甲烷(200ml，2次)萃取。将2个有机层合并，用硫酸钠使有机层干燥，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到标题化合物(25g)。[0204]1h-nmr波谱(cdcl3)δ(ppm):4.72(2h,s),7.25(1h,m),7.34(2h,m).[0205][制造例1-3][0206]4-溴-2-氟-1-(甲氧基甲基)苯[0207][化学式16][0208][0209]于0℃，经20分钟将制造例1-2中得到的(4-溴-2-氟苯基)甲醇(25g，0.12mol)与dmf(50ml)的混合物加入60％氢化钠(7.3g，0.18mol)与dmf(150ml)的混合物中。于室温向反应混合物中加入碘甲烷(15ml，0.24mol)，于相同温度搅拌16小时。将反应混合物冷却至0℃，加入冰冷却水(500ml)，用乙酸乙酯(250ml，接着150ml)萃取。将2个有机层合并，用硫酸钠使有机层干燥，在减压下将溶剂蒸馏除去，得到标题化合物(20g)。[0210]1h-nmr波谱(cdcl3)δ(ppm):3.40(3h,s),4.47(2h,s),7.23(1h,m),7.28(2h,m).[0211][制造例1-4][0212]3-氟-4-(甲氧基甲基)苯甲腈[0213][化学式17][0214][0215]使用氩气，对制造例1-3中得到的4-溴-2-氟-1-(甲氧基甲基)苯(20g，91mmol)、锌粉(0.29g，4.6mmol)、氰化锌(16g，0.14mol)、及dmf(250ml)的混合物进行脱气置换。于相同温度向反应混合物中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(4.2g，4.6mmol)及1,1’‑双(二苯基膦基)二茂铁(5.1g，9.1mmol)，再次使用氩气进行脱气置换。于100℃将反应混合物搅拌16小时。向反应混合物中加入水(500ml)，用乙酸乙酯(500ml，接着200ml)萃取。将2个有机层合并，用硫酸钠使有机层干燥，在减压下将溶剂蒸馏除去。利用硅胶柱色谱法(15～20％乙酸乙酯-正己烷溶液)对残余物进行纯化，得到标题化合物(10g)。[0216]1h-nmr波谱(cdcl3)δ(ppm):3.45(3h,s),4.56(2h,s),7.35(1h,d,j＝9.2hz),7.48(1h,d,j＝8hz),7.58(1h,t,j＝14hz).[0217][制造例1-5][0218](3-氟-4-(甲氧基甲基)苯基)甲胺盐酸盐[0219][化学式18][0220][0221]于0℃，经20分钟将硼烷-二甲硫醚络合物(18ml，0.24mol)滴加至制造例1-4中得到的3-氟-4-(甲氧基甲基)苯甲腈(10g，61mmol)与四氢呋喃(thf)(100ml)的混合物中，于80℃搅拌16小时。将反应混合物冷却至0℃，于相同温度加入甲醇(25～30ml)，在减压下将溶剂蒸馏除去。向残余物中加入二氯甲烷(100ml)，加入足以形成盐的量的4m盐酸-1,4-二氧杂环己烷溶液，于室温搅拌30分钟。在减压下将溶剂蒸馏除去，用乙醚对残余物进行洗涤，得到标题化合物(5.0g)。[0222]1h-nmr波谱(dmso-d6)δ(ppm):3.37(3h,s),4.00(2h,s),4.54(2h,s),7.31(1h,d,j＝7.6hz),7.39(1h,d,j＝11hz),7.46(1h,t,j＝7.6hz),8.19(3h,s).[0223][制造例1-6][0224]5-溴-2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)苯甲酰胺[0225][化学式19][0226][0227]于0℃，向5-溴-2-氟苯甲酸(5.0g，23mmol)、制造例1-5中得到的(3-氟-4-(甲氧基甲基)苯基)甲胺盐酸盐(5.6g，27mmol)、及dmf(50ml)的混合物中依次加入二异丙基乙基胺(13ml，46mmol)和丙烷磷酸酐(15ml，46mmol)。于室温将反应混合物搅拌3小时。向反应混合物中加入水(200ml)，搅拌30分钟。滤取所生成的固体，用水(100ml，2次)清洗。在减压下使固体干燥，得到标题化合物(5.2g)。[0228]1h-nmr波谱(dmso-d6)δ(ppm):3.28(3h,s),4.46(4h,m),7.16(2h,m),7.40(2h,m),7.78(2h,m),9.03(1h,m)[0229][制造例1-7][0230]2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酰胺[0231][化学式20][0232][0233]使用氩气，对制造例1-6中得到的5-溴-2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)苯甲酰胺(4.0g，19mmol)、双(频哪醇合)二硼(6.8g，10mmol)、乙酸钾(3.5g，9.1mmol)、及dmf(50ml)的混合物进行脱气置换。于相同温度向反应混合物中加入(1,1’‑双(二苯基膦基)二茂铁)二氯化钯(0.16g，0.23mmol)，再次使用氩气进行脱气置换。于100℃将反应混合物搅拌16小时。向反应混合物中加入水(100ml)，用乙酸乙酯(100ml，2次)萃取。将2个有机层合并，用硫酸钠使有机层干燥，在减压下将溶剂蒸馏除去。利用硅胶柱色谱法(15～20％乙酸乙酯-正己烷溶液)对残余物进行纯化，作为粗体而得到标题化合物(4g)。不进行进一步纯化地用于后面的反应。[0234][制造例1-8][0235]2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)-5-(3-甲酰基吡啶-2-基)苯甲酰胺[0236][化学式21][0237][0238]使用氮气，对制造例1-7中得到的2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)-5-(4,4,正己烷溶液)对残余物进行纯化，得到标题化合物(0.23g)。[0251]1h-nmr波谱(dmso-d6)δ(ppm):1.23(3h,d,j＝6.4hz),3.28(3h,s),4.42(2h,s),4.48(2h,d,j＝6hz),4.77-4.81(1h,m),5.30(1h,d,j＝4hz),7.13-7.18(2h,m),7.36-7.46(3h,m),7.64-7.67(1h,m),7.72-7.75(1h,m),8.03-8.04(1h,d,j＝6.4hz),8.52-8.54(1h,m),9.03(1h,t,j＝6hz).[0252][实施例3及4][0253]手性2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)-5-(3-(1-羟基乙基)吡啶-2-基)苯甲酰胺[0254][化学式24][0255][0256]针对实施例2中得到的外消旋的2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)-5-(3-(1-羟基乙基)吡啶-2-基)苯甲酰胺(0.80g)，使用超临界流体色谱法(sfc)将镜像异构体分离(chiralpak-ig，含有0.2％三乙胺的20％甲醇-二氧化碳)。得到早溶出的镜像异构体(0.26g，实施例3)和晚溶出的镜像异构体(0.32g，实施例4)。[0257][制造例5-1][0258]4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟苯甲腈[0259][化学式25][0260][0261]于室温，向4-(羟基甲基)-3-氟苯甲腈(1.0g，6.6mmol)与二氯甲烷(5ml)的混合物中依次加入2n氢氧化钠水溶液(0.53g，13mmol)和(溴二氟甲基)三甲基硅烷(1.6ml，9.9mmol)，于相同温度搅拌48小时。向反应混合物中加入水，用二氯甲烷(50ml，2次)萃取。将有机层合并，用饱和食盐水清洗，接着用硫酸钠干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去。利用硅胶柱色谱法(2％乙酸乙酯-正己烷溶液)对残余物进行纯化，得到标题化合物(0.25g)。[0262]1h-nmr波谱(dmso-d6)δ(ppm):5.05(2h,s),6.82(1h,t,j＝75hz),7.69-7.76(2h,m),7.91(1h,d,j＝9.2hz).[0263][制造例5-2][0264](4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟苯基)甲胺[0265][化学式26][0266][0267]于0℃，向制造例5-1中得到的4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟苯甲腈(0.30g，1.5mmol)与甲醇(5ml)的混合物中缓慢地加入六水合氯化镍(ii)(39mg，0.30mmol)和硼氢化钠(0.17g，4.5mmol)，于相同温度搅拌1小时。向反应混合物中加入冰水，用二氯甲烷(25ml，2次)萃取。将2个有机层合并，用饱和食盐水对有机层进行清洗，接着用硫酸钠干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去。利用硅胶柱色谱法(8％甲醇-二氯甲烷溶液)对残余物进行纯化，得到标题化合物(200mg)。[0268]1h-nmr波谱(dmso-d6)δ(ppm):3.72(2h,s),4.91(2h,s),6.77(1h,t,j＝75hz),7.15-7.23(2h,m),7.37-7.41(1h,m).[0269][制造例5-3][0270]5-(3-乙酰基吡啶-2-基)-2-氟苯甲酸[0271][化学式27][0272][0273]于室温将碳酸钾(4.5g，33mmol)加入3-羧基-4-氟苯硼酸(3.0g，16mmol)、3-乙酰基-2-溴吡啶(3.3g，16mmol)、1,4-二氧杂环己烷(30ml)、及水(10ml)的混合物中，使用氮气进行脱气置换。于相同温度向反应混合物中加入(1,1’‑双(二苯基膦基)二茂铁)二氯化钯二氯甲烷复合物(0.67g，0.82mmol)，于100℃搅拌16小时。使反应混合物成为室温，在减压下将溶剂蒸馏除去。向残余物中加入二氯甲烷(75ml)，进行过滤，用二氯甲烷(75ml)对残余物进行清洗。对于滤液，在减压下将溶剂蒸馏除去，利用硅胶柱色谱法(10％～12％甲醇-二氯甲烷溶液)对残余物进行纯化，得到标题化合物(2.1g)。[0274]1h-nmr波谱(dmso-d6)δ(ppm):2.37(3h,s),7.28-7.31(1h,m),7.37-7.42(1h,m),7.70-7.72(1h,m),7.98-8.00(1h,m),8.10-8.12(1h,m),8.76-8.77(1h,m),13.34(1h,bs).[0275][制造例5-4][0276]5-(3-乙酰基吡啶-2-基)-n-(4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟苄基)-2-氟苯甲酰胺[0277][化学式28][0278][0279]在氮气氛下，于0℃，向制造例5-3中得到的5-(3-乙酰基吡啶-2-基)-2-氟苯甲酸(0.10g，0.39mmol)与dmf(3ml)的混合物中依次加入二异丙基乙基胺(0.21ml，1.2mmol)和丙烷磷酸酐(50％乙酸乙酯溶液)(0.24ml，0.78mmol)，于相同温度搅拌15分钟。于相同温度向反应混合物中加入制造例5-2中得到的(4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟苯基)甲胺(79mg，0.39mmol)，于室温搅拌16小时。向反应混合物中加入水，用乙酸乙酯(20ml，2次)萃取。将2个有机层合并，用饱和食盐水对有机层进行清洗，接着用硫酸钠干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，利用硅胶柱色谱法(55％乙酸乙酯-正己烷溶液)对残余物进行纯化，得到标题化合物(60mg)。[0280]1h-nmr波谱(dmso-d6)δ(ppm):2.38(3h,s),4.02(2h,d,j＝5.6hz),4.93(2h,s),6.71(1h,t,j＝74hz),7.18-7.21(1h,m),7.44-7.79(4h,m),7.78-7.79(1h,m),8.11(1h,d,j＝7.6hz),8.76-8.77(1h,m),9.05-9.06(1h,m).[0281][实施例5][0282]n-(4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟苄基)-2-氟-5-(3-(1-羟基乙基)吡啶-2-基)苯甲酰胺[0283][化学式29][0284][0285]于0℃，向制造例5-4中得到的5-(3-乙酰基吡啶-2-基)-n-(4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟苄基)-2-氟苯甲酰胺(0.15g，0.34mmol)与甲醇(3ml)的混合物中缓慢地加入硼氢化钠(26mg，0.69mmol)，于室温搅拌6小时。向反应混合物中加入水，用乙酸乙酯(30ml，2次)萃取。将2个有机层合并，用饱和食盐水对有机层进行清洗，接着用硫酸钠干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去。利用硅胶柱色谱法(55％乙酸乙酯-正己烷溶液)对残余物进行纯化，得到标题化合物(30mg)。[0286]1h-nmr波谱(dmso-d6)δ(ppm):1.27(3h,d,j＝6.4hz),4.49(2h,d,j＝5.6hz),4.77-4.81(1h,m),4.93(2h,s),5.30(1h,j＝4hz),6.78(1h,t,j＝75hz),7.18-7.21(2h,m),7.39-7.47(3h,m),7.64-7.68(1h,m),7.73-7.75(1h,m),8.03(1h,d,j＝8hz),8.53(1h,d,j＝4.8hz),9.05(1h,t,j＝5.6hz).[0287][制造例6-1][0288]2-溴-3-(甲氧基甲基)吡啶[0289][化学式30][0290][0291]于0℃向60％氢化钠(0.057g，2.4mmol)与thf(3ml)的混合物中加入(2-溴吡啶-3-基)甲醇(0.30g，1.6mmol)与thf(3ml)的混合物。于室温向反应混合物中加入碘甲烷(0.15ml，2.4mm ol)，于相同温度搅拌16小时。将反应混合物冷却至0℃，加入冰冷却水，用乙酸乙酯(15ml，接着5ml)萃取。将2个有机层合并，用硫酸钠使有机层干燥，在减压下将溶剂蒸馏除去，作为粗体而得到标题化合物(0.15g)。不进行进一步纯化地用于后面的反应。[0292][实施例6][0293]2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)-5-(3-(甲氧基甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺[0294][化学式31][0295][0296]使用氩气，对制造例6-1中得到的2-溴-3-(甲氧基甲基)吡啶(49mg)、制造例1-7中得到的2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酰胺(0.10g)、碳酸钠(0.050g，0.47mmol)、1,4-二氧杂环己烷(3ml)、及水(0.5ml)的混合物进行脱气置换。于相同温度向反应混合物中加入(1,1’‑双(二苯基膦基)二茂铁)二氯化钯二氯甲烷复合物(8.0mg，0.0098mmol)，再次使用氩气进行脱气置换，于80℃将反应混合物搅拌16小时。使反应混合物成为室温，加入水(5ml)，用乙酸乙酯(10ml，接着5ml)萃取。将2个有机层合并，用硫酸钠使有机层干燥，在减压下将溶剂蒸馏除去。利用硅胶柱色谱法(20％乙酸乙酯-正己烷溶液)对残余物进行纯化，得到标题化合物(0.080g)。[0297]1h-nmr波谱(dmso-d6)δ(ppm):3.28(3h,s),3.29(3h,s),4.36(2h,s),4.42(2h,s),4.48(2h,d,j＝6hz),7.13-7.18(2h,m),7.36-7.45(3h,m),7.75-7.79(1h,m),7.87-7.89(1h,m),7.91-7.93(1h,m),8.61-8.63(1h,m),9.01(1h,t,j＝11hz).[0298][制造例7-1][0299](5-碘-1h-吡唑-4-基)甲醇[0300][化学式32][0301][0302]于0℃向5-碘-1h-吡唑-4-甲酸乙酯(4.0g，15mmol)与thf(4ml)的混合物中滴加硼烷-thf溶液(1m thf溶液，30ml)。于室温将反应混合物搅拌1小时。于相同温度向反应混合物中滴加甲醇(20ml)，搅拌30分钟。对于反应混合物，在减压下将溶剂蒸馏除去。利用高效液相色谱法对残余物进行纯化，得到标题化合物(1.5g)。[0303]esi-ms:m/z 224.9[m+1]+[0304][制造例7-2][0305](3-氟-4-(甲氧基甲基)苯基)甲胺[0306][化学式33][0307][0308]向制造例1-4中记载的3-氟-4-(甲氧基甲基)苯甲腈(8.0g，48mmol)与甲醇(50ml)的混合物中加入雷尼镍(20g)，在氢气氛下，于室温搅拌一整夜。利用氮对反应混合物进行脱气置换，使用硅藻土进行过滤。对于滤液，在减压下将溶剂蒸馏除去，作为粗体而得到标题化合物(7.5g)。作为粗体而直接用于后面的反应。[0309][制造例7-3][0310]5-溴-2-氯-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)苯甲酰胺[0311][化学式34][0312][0313]将5-溴-2-氯苯甲酸(1.9g，8.1mmol)与亚硫酰氯(15ml)的混合物加热回流1.5小时。使反应混合物成为室温，在减压下将溶剂蒸馏除去。于0℃向残余物与二氯甲烷(30ml)的混合物中滴加制造例7-2中得到的粗体(3-氟-4-(甲氧基甲基)苯基)甲胺(1.4g)、三乙胺(1.2g，12mmol)及二氯甲烷(15ml)的混合物。于室温将反应混合物搅拌一整夜。于室温向反应混合物中加入水，用二氯甲烷萃取(50ml，3次)。用饱和食盐水对有机层进行清洗后，用硫酸钠干燥，在减压下将溶剂蒸馏除去。利用硅胶柱色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)对残余物进行纯化，得到标题化合物(1.1g)。[0314]esi-ms:m/z 386.0[m+1]+[0315][制造例7-4][0316]2-氯-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酰胺[0317][化学式35][0318][0319]于室温，向制造例7-3中得到的5-溴-2-氯-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)苯甲酰胺(1.1g，2.8mmol)、双(频哪醇合)二硼(0.87g，3.4mmol)、1,4-二氧杂环己烷(20ml)的混合物中加入乙酸钾(0.84g，8.5mmol)和(1,1’‑双(二苯基膦基)二茂铁)二氯化钯(0.21g，0.28mmol)。于95℃将反应混合物搅拌3小时。使反应混合物成为室温，向反应混合物中加入水，用乙酸乙酯萃取(50ml，3次)。用饱和食盐水对有机层进行清洗，用硫酸钠干燥。在减压下将溶剂蒸馏除去，得到标题化合物(0.80g)。[0320]esi-ms:m/z 434.1[m+1]+[0321][实施例7][0322]2-氯-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)-5-(4-(羟基甲基)-1h-吡唑-3-基)苯甲酰胺[0323][化学式36][0324][0325]于室温，向制造例7-4中得到的2-氯-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)苄基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯甲酰胺(0.40g，0.92mmol)、制造例7-1中得到的(5-碘-1h-吡唑-4-基)甲醇(310mg，1.4mmol)、正丙醇(9ml)、及水(6ml)的混合物中加入碳酸钠(750mg，2.3mmol)和[1,1’‑双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(ii)(70mg，0.090mmol)，于95℃搅拌一整夜。使反应混合物成为室温，在减压下将溶剂蒸馏除去。利用高效液相色谱法对残余物进行纯化，得到标题化合物(57mg)。[0326]1h-nmr波谱(cd3od)δ(ppm):3.40(3h,s),4.53(2h,s),4.61(4h,d,j＝9.0hz),7.20(1h,d,j＝10.9hz),7.26(1h,d,j＝7.9hz),7.43(1h,t,j＝7.6hz),7.58(1h,s),7.70-7.99(3h,m).[0327][比较例1][0328]将作为市售品的下述化合物用作比较例1。需要说明的是，下述化合物为国际公开第2008/112164号公报中记载的化合物。[0329][化学式37][0330][0331][比较例2][0332]按照国际公开第2015/127137号公报中记载的方法合成下述化合物，用作比较例2。[0333][化学式38][0334][0335][比较例3][0336]按照国际公开第2019/151241号公报中记载的方法合成下述化合物，用作比较例3。[0337][化学式39][0338][0339][比较例4][0340]按照国际公开第2019/151241号公报中记载的方法合成下述化合物，用作比较例4。[0341][化学式40][0342][0343][比较例5][0344]按照国际公开第2019/151241号公报中记载的方法合成下述化合物，用作比较例5。[0345][化学式41][0346][0347][比较例6][0348]按照国际公开第2019/151241号公报中记载的方法合成下述化合物，用作比较例6。[0349][化学式42][0350][0351][试验例1：aldh2激活作用][0352]利用以下的方法测定试验化合物针对由aldh2引起的乙醛的氧化速度的激活作用。使用市售的picoprobetm乙醛脱氢酶活性检测试剂盒(aldehyde dehydrogenase activity assay kit)(biovision inc.制)，参考商品的操作说明书，在以下的条件下实施试验。利用移液管，向384孔板的各孔中依次添加以下(1)至(3)。[0353](1)将人重组aldh2酶(biovision inc.制)以成为3μg/ml的方式溶解于aldh检测缓冲液(assay buffer)中进行稀释而得到的溶液10μl。[0354](2)使用aldh检测缓冲液制备的30μm或90μm的试验化合物溶液10μl(包含3％dmso)。[0355](3)按aldh检测缓冲液8.6μl、picoprobe 0.6μl、底物混合物(substrate mix)0.3μl、及乙醛1.5μl的比率构成的反应混合物(reaction mix)10μl。[0356]在添加上述(3)之前，于室温孵育(incubation)5分钟。另外，在添加(3)之后，使用ensight(perkinelmer inc.制)，于室温，在180分钟内，每2.5分钟测定一次荧光强度。荧光强度使用了激发波长(excitation)为535nm、发射波长(emission)为587nm的波长。[0357]将不添加试验化合物的情况下的乙醛的氧化速度设为100％时的、添加了试验化合物的情况下的氧化速度示于表1中。由表1的结果确认到，实施例1～7的化合物具有aldh2激活作用。[0358][表1][0359]表1[0360][0361][试验例2：使用了小鼠肝微粒体的代谢稳定性][0362]利用以下的方法对小鼠肝微粒体中的代谢稳定性进行评价。[0363]1.材料[0364](1)小鼠肝微粒体：20mg/ml[0365](2)试验化合物：1.1mm dmso溶液[0366](3)磷酸钾缓冲液：66.7mm(ph7.4)[0367](4)nadph溶液：10mm磷酸钾缓冲液[0368](5)淬灭溶液：添加有华法林作为内标物质的0.5％甲酸-乙腈溶液[0369]2.方法[0370]向丙烯管中装入971.5μl的磷酸钾缓冲液和27.5μl的小鼠肝微粒体，使其悬浮。向其中加入1μl的试验化合物，将该混合物中的180μl移至另一个管中。于37℃对混合物进行5分钟预孵育，然后，加入20μl的nadph溶液(孵育时间为30分钟的情况)或20μl的磷酸钾缓冲液(孵育时间为0分钟的情况)。在孵育后，加入200μl的淬灭溶液，使反应停止。接着，以3220×g离心分离20分钟，利用lc-ms/ms对200μl的上清液中的试验化合物的未变化体浓度进行测定。基于所得到的未变化体的峰面积，将孵育时间0分钟时设为100％，算出未变化体的残存率(％)。[0371]3.结果[0372]将30分钟后的未变化体的残存率(％)示于表2中。确认到：与以往的aldh2激活剂相比，实施例1～7的化合物在小鼠肝微粒体中的代谢稳定性优异。[0373][表2][0374]表2[0375] 残存率(％)实施例190实施例268实施例364实施例460实施例552实施例624实施例774比较例1＜1比较例26比较例31比较例4＜1比较例5＜1比较例61[0376][试验例3：使用了人肝微粒体的代谢稳定性][0377]针对在小鼠肝微粒体试验中确认了稳定性的实施例1、2、5及6的化合物，测定使用了人肝微粒体的代谢稳定性。具体方法如下所述。[0378]2.方法[0379](1)各分取50μl用β-nadph溶液稀释而得的0.2μmol/l试验化合物。[0380](2)各添加50μl 0.2mg蛋白质/ml人肝微粒体溶液(反应时间为0分钟的试样除外)。[0381](3)于37℃，一边振荡一边孵育30分钟。(反应试样中的浓度：0.1μmol/l试验化合物，0.1mg蛋白质/ml人肝微粒体)[0382](4)孵育后，添加甲醇400μl，使反应停止。[0383](5)向反应时间为0分钟的试样中添加0.2mg蛋白质/ml肝微粒体溶液50μl。[0384](6)将上述(4)及(5)的试样于-20℃静置30分钟以上后，以4℃、3,000rpm的条件离心分离约10分钟。[0385](7)利用lc/ms/ms对上清液进行测定，基于所得到的未变化体的峰面积，将孵育时间o分钟时设为100％，算出未变化体的残存率(％)。[0386]将30分钟后的未变化体的残存率(％)示于表3中。[0387][表3][0388]表3[0389] 残存率(％)实施例190实施例287实施例572实施例675[0390][试验例4：反应性代谢物][0391]在人肝微粒体的存在下，利用lc-ms/ms对谷胱甘肽结合体的产生进行测定，由此研究了试验化合物的反应性代谢物产生风险。具体方法如下所述。[0392]1.方法[0393](1)向聚丙烯管中添加20mg/ml的人肝微粒体55ul、66.7mm的磷酸钾缓冲液(ph7.4)395ul、10mm的谷胱甘肽水溶液550ul。[0394](2)添加20mm的试验化合物或阳性对照(氯氮平(clozapine)、雷洛昔芬(reloxifen)、双氯芬酸(dicrofenac))0.55ul。[0395](3)以各180ul的量细分到4个管中，2个标记为t0，2个标记为t60，于37±1℃进行5分钟预孵育。[0396](4)将10mm的nadph溶液20ul加入t60管中，将磷酸钾缓冲液20ul加入t0管中。[0397](5)60分钟后，各加入10％三氯乙酸乙腈溶液200ul，使反应停止。[0398](6)利用离心分离装置(5810-r，eppendorf)以3220×g、20分钟的条件进行离心分离，针对上清液200ul，利用lc-ms/ms(lc：sil-htc，shimazu，mass：api-4000qtrap，mds sciex)对gsh结合体进行测定。[0399](7)算出在试验化合物中确认到的gsh结合体的面积/在氯氮平中确认到的gsh结合体的面积之比(％)。[0400]2.结果[0401]将结果示于表4中。由这些结果确认到，与氯氮平相比，实施例的化合物的反应性代谢物的生成量小。[0402][表4][0403]表4[0404][0405][试验例5：herg通道抑制作用][0406]利用以下的膜片钳法研究了试验化合物的herg(human ether-a-go-go related gene，人类ether-a-go-go相关基因)通道抑制作用。[0407]1.方法[0408]利用全细胞膜片钳法记录了在电位固定的条件下从整个细胞膜通过的herg电流。[0409]为了对herg电流进行确认，将保持电位设定为-80mv，-50mv、110msec及20mv、4sec的去极化脉冲之后的-50mv、2sec的复极化脉冲按照每15秒1次的频率赋予。确认所得到的herg尾电流稳定后，开始应用。在应用过程中也继续赋予脉冲。[0410]采样频率设定为5khz，低通滤波器(lowpass filter)设定为2khz。[0411]测定中的腔室内的细胞外液的温度设定为22～25℃。[0412]《细胞外液的组成》[0413]nacl:137mmol/l，kcl:4mmol/l，cacl2:1.8mmol/l，mg cl2:1mmol/l，d(+)-葡萄糖:10mmol/l，hepes:10mmol/l(用1mol/l naoh将ph调节为7.4)。[0414]《电极内液的组成》[0415]kcl:130mmol/l，mgcl2:1mmol/l，egta:5mmol/l，mg atp:5mmol/l，hepes:10mmol/l(用1mol/l koh将ph调节为7.2)。[0416]《玻璃电极的制作》[0417]使用拉制仪(p-97，sutter instrument company)对玻璃细管(g-1.5，株式会社成茂科学器械研究所)进行加工，将充满电极内液时的电阻值在2～5mω的范围内的管用于测定。[0418]《测定及分析》[0419]对于herg电流而言，使用膜片钳用放大器(axopatch 200b，molecular devices，llc)进行测定，经由膜片钳用记录分析软件(pclamp 10，molecular devices，llc)将所得到的电信号记录至计算机上。[0420]以-50mv、110msec的去极化脉冲时的电流值为基准求出最大尾电流值，算出相对于试验化合物应用前的最大尾电流值而言的应用开始5分钟后的变化率(抑制率)。[0421]2.结果[0422]将结果示于表5中。由这些结果确认到，实施例的化合物不显示herg通道抑制作用。[0423][表5][0424]表5[0425][0426][试验例6：由角叉菜胶诱发的疼痛的抑制效果][0427]本实验参考science translational medicine 6,2 51ra118(2014).来实施。动物使用了雄性c57bl/6j小鼠(charles river labora tories japan，inc.)，7周龄。为了在足底部诱发机械刺激痛觉超敏(allodynia)，将角叉菜胶皮下施予至小鼠的左后肢足底。使用向左后肢的足底面施加上行弯曲力(0.16克)的冯弗雷细丝(von frey filament)，对诱发180分钟后的针对机械刺激的逃避反应进行测定。垂直地刺激小鼠6秒钟直至细丝弯曲，将小鼠的逃避反应按3个等级进行评分(0：无反应或惊愕反应(挪动但未抬足)，1：抬足，2：舔足或晃动)。进行10次刺激，算出10次的评分的合计值(逃避评分)。[0428]将化合物(实施例1)溶解于dmso/peg400(1∶1的体积比)中，将2、6或20mg/kg的化合物(背景介质(vehicle)组不包含化合物)以5ml/kg的施予液量在注入角叉菜胶的15分钟前、注入角叉菜胶之后30分钟及150分钟后、共计3次等量地施予至颈背部皮下。角叉菜胶使用生理食盐液制备成1.5％溶液，以7μl/body的量皮下施予至左后肢足底。[0429]关于显著性检验，针对背景介质组与实施例1组的比较，进行steel的多重比较检验，算出显著性水平为5％。在显著性检验中，使用了市售的统计程序sas system(sas software release 9.1.3；sas institute japan ltd)。[0430]如表6所示，表明了实施例的化合物抑制由角叉菜胶诱发的疼痛。[0431][表6][0432]表6[0433][0434]各值表示平均值±se。[0435]pre：角叉菜胶施予前[0436]*：p＜0.05









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