用于保存体液的稳定组合物和方法与流程 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术clifford(2014)《hpv的尿检：使用首段尿的根本原因(urine testing for hpv:rationale for using first void)》.《英国医学杂志(bmj)》349:g6252)。4.尽管在各种临床领域，尤其是肿瘤学和产前诊断领域，对无细胞dna(cfdna)分析的兴趣越来越大，但关于样本处理的研究报道很少，并且没有可用的分析共识。尿液中天然存在的有核细胞可以将基因组dna释放到尿液中，导致样本处理和储存过程中dna背景增加。此外，酶降解有可能掩盖真实的cfdna水平，因为考虑到它们的分子量相对较小。因此，尿液标本需要特殊处理，例如在收集后的短时间内(2至4小时)进行处理，收集后冷藏，或使用稳定化合物进行保存。鉴于样本的收集性质，优选使用保存剂来保持样本收集后的尿液中的cfdna的原始比例和完整性。5.ucfdna作为一种无创液体活检形式具有巨大的潜力。dna可以存在于尿液的细胞部分和无细胞部分，并且用于收集和处理dna的程序将极大地影响生物标志物分析的结果(lk larsen、ge lind、p guldberg、c dahl(2019)《在尿液中对泌尿系统癌症的基于dna甲基化的检测：生物标志物的概述以及对生物标志物设计、dna来源和检测技术的考虑(dna-methylation-based detection of urological cancer in urine:overview of biomarkers and considerations on biomarker design,source of dna,and detection technologies)》.《国际分子科学杂志(int j mol sci)》20,2657)。由于尿液中的细胞和dna在储存时容易降解(tht cheng、p jiang、jcw tam、x sun、w-s lee、scy yu、jtc teoh、pkf chiu、c-f ng、k-m chow、c-c szeto、kca chan、rwk chiu、ymd lo(2017)《全基因组亚硫酸氢盐测序揭示了尿cfdna的来源和时间依赖性片段化(whole-genome bisulfite sequencing reveals the origin and time-dependent fragmentation of urinary cfdna)》.《临床生物化学(clin biochem)》50(9):496-501.doi:10.1016/j.clinbiochem.2017.02.017)，当尿液样本没有被立即处理时，适当的储存很重要。人类尿液是核酸水解酶(核酸酶)发挥功能的合适环境。具体而言，dna酶i是尿液中的主要dna水解酶，并且其在尿液中的活性比其在血清中的活性高100倍以上(oe bryzgunova、pp laktionov(2015)《尿液中的细胞外核酸：来源、结构、诊断潜力(extracellular nucleic acids in urine:sources,structure,diagnostic potential)》.《自然学报(acta naturae)》第7(3)卷:48-54.doi:10.32607/20758251-2015-7-3-48-54)。ucfdna在体温下的半衰期为约2.6至5.1小时(tht cheng等人(2017)同上)。目前，没有一个登记的癌症体外诊断(ivd)是纯粹基于ucfdna的(wj locke、d guanzon、c ma、yj liew、kr duesing、kyc fung、jp ross(2019)《dna甲基化癌症生物标志物：应用至临床(dna methylation cancer biomarkers:translation to the clinic)》.《遗传学前沿(front genet)》10:1150.doi:10.3389/fgene.2019.01150)。一个主要原因是因为保存ucfdna的工作流程尚未标准化。因此，为了有效且高效地使用任何生物化学和分子遗传测试，样本收集过程、样本运输、样本处理和样本储存/稳定性都应优化和标准化。6.在健康个体中，cfdna来源于有核细胞的凋亡(m stroun、j lyautey、c lederrey、a olson-sand、p anker(2001)《关于循环dna凋亡和活性dna释放的可能来源和机制(about the possible origin and mechanism of circulating dna apoptosis and active dna release)》.《临床化学学报(clin chim acta)》313(1-2):139-142)。在恶性肿瘤中，总cfdna的肿瘤源性部分被称为循环肿瘤dna(ctdna)，可能通过凋亡、坏死和活性分泌的组合而来源于肿瘤细胞(m stroun等人(2001)同上；s jahr、h hentze、s englisch、d hardt、fo fackelmayer、rd hesch、r knippers(2001)《癌症患者的血浆中的dna片段：其凋亡和坏死细胞来源的定量和证据(dna fragments in the blood plasma of cancer patients:quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells)》.《癌症研究(cancer res)》61(4):1659-1665；oe bryzgunova等人(2015)同上)。ctdna含有肿瘤特异性突变、拷贝数的变化和dna甲基化状态的改变(g santoni、mb morelli、c amantini、n battelli(2018)《膀胱癌中的尿标志物的最新消息(urinary markers in bladder cancer:an update)》.《肿瘤学前沿(front oncol)》8:362.doi:10.3389/fonc.2018.00362)。ctdna水平通常随着肿瘤体积而增加，可以用于预测对靶向免疫疗法的反应，监测肿瘤异质性，并揭示不断扩大的耐药肿瘤克隆(rj diefenbach、jh lee、rf kefford、h rizos(2018)《用于纯化循环游离dna的商品化试剂盒的评价(evaluation of commercial kits for purification of circulating free dna)》.《癌症遗传学(cancer genetics)》228-229:21-27.doi:10.1016/j.cancergen.2018.08.005)。7.癌症诊断学已经开始摆脱对用于癌症检测、诊断和治疗监测的直接肿瘤组织活检的单一依赖。下一代测序和基因组生物信息学分析带来了从组织学诊断的微观水平到癌症诊断的分子基因组水平的新范式转变。新型无创癌症诊断平台，例如来自体液(即血液、血浆、尿液等)的液体活检，可用于获取ctdna或用于测定ctdna的循环肿瘤细胞、蛋白质组学物质、代谢组学物质和外泌体(x wu、l zhu和pc ma.《超越组织的下一代新型无创癌症分子诊断平台(next-generation novel non-invasive cancer molecular diagnostics platforms beyond tissues)》.《美国临床肿瘤学会教育书籍(am soc clin oncol educ book)》.2018年5月23日；(38):964-977.doi:10.1200/edbk_199767)以及其它分析物的信息。8.分子生物标志物被广泛研究，并且可能有助于癌症患者治疗反应的早期检测、监测和预测(l cerchietti和a melnick(2017)《基于dna甲基化的生物标志物(dna methylation-based biomarkers)》.《临床肿瘤学杂志(j clin oncol)》35(7):793-795)。这些生物标志物代表了与癌症发展和进展相关联的遗传和表观遗传事件。dna超甲基化是表观遗传过程的一个实例。检测如尿液和血液等体液中的超甲基化dna作为肿瘤学生物标志物是令人感兴趣的。癌症护理的一个重要发展是“液体活检”，它涉及对从原发性或转移性肿瘤脱落到体液中的肿瘤细胞的遗传物质的分析。液体活检通常涉及源于如血液、尿液、唾液和脑脊液等生物流体的cfdna、rna(mirna、lncrna和mrna)、蛋白质、肽、外泌体或细胞的提取和分析(ad meo、j bartlett、y cheng、md pasic、gm yousef(2017)《液体活检：泌尿系统恶性肿瘤向精确医学迈进的一步(liquid biopsy:a step forward towards precision medicine in urologic malignancies)》.《癌症分子学(mol cancer)》16:80.doi:10.1186/s12943-017-0644-5)。在各种液体活检样本中，尿液和唾液容易获得，不需要专家进行样本收集，并且能够通过连续采样实现疾病的实时监测。9.mandel和metais于1948年首次观察到血浆中的无细胞循环dna(p mandel、pmetais(1948)《人类血浆中的核酸(les acides nucleiques du plasma sanguine chez l'homme)》.《巴黎科学院报告(c r acad sci paris)》:241-243)。在癌症患者的血清和血浆中表现出游离dna水平增加(sa leon、b shapiro、dm sklaroff、mj yaros(1977)《癌症患者的血清中的游离dna及治疗效果(free dna in the serum of cancer patients and the effect of therapy)》.《癌症研究(cancer res)》37:646-650；s jahr等人(2001)同上)。来自jahr等人(2001，同上)的数据与凋亡和坏死细胞是癌症患者的血浆dna的主要来源的可能性一致。在从癌症患者的血浆中提取的遗传物质中发现了肿瘤dna的特性。这些特征包含链稳定性降低以及特定癌基因、肿瘤抑制基因和微卫星改变的存在(p anker、h mulcahy、xq chen、m stroun(1999)《癌症患者的血液(血浆/血清)中的循环肿瘤dna的检测(detection of circulating tumour dna in the blood(plasma/serum)of cancer patients)》.《癌症与转移评论(cancer and metastasis reviews)》18:65-73.doi.https://doi.org/10.1023/a:1006260319913)。在许多不同癌症中获得的结果表明，类似于尿液dna，血浆dna可能是开发癌症诊断、预后和随访测试的合适靶标。10.肾脏疾病的新生物标志物的研究目前是一个紧迫的问题，因为肾脏疾病影响着高达1/10的美国人口(j coresh、e selvin、la stevens、j manzi、jw kusek、p eggers、f van lente、as levey(2007)《美国慢性肾病的患病率(prevalence of chronic kidney disease in the united states)》.《美国医学会杂志(jama)》298(17):2038-2047)。用于细胞间通讯的尿细胞外囊泡(uev)代表了生物标志物发现的理想平台(kc miranda、dt bond、m mckee、j skog、tg paunescu、n da silva、d brown、lm russo(2010)《尿外泌体/微囊泡内的核酸是肾脏疾病的潜在生物标志物(nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease)》.《国际肾脏病学(kidney int)》78(2):191-199.doi:10.1038/ki.2010.106)。uev是载有rna和蛋白质的小(20至1,000nm)球形结构，其由健康和异常细胞沿着整个泌尿生殖道不断释放(a gamez-valero、si lozano-ramos、i bancu、r lauzurica-valdemoros、fe borras(2015)《尿细胞外囊泡作为肾病生物标志物的来源(urinary extracellular vesicles as source of biomarkers in kidney diseases)》.《免疫学前沿(front immunol)》6.doi:http://dx.doi.org/10.3389/fimmu.2015.00006)。术语uev是指质膜源性(例如，微囊泡、外泌体样囊泡、核外颗粒体和逆转录病毒样颗粒)和核内体源性囊泡或外泌体。uev似乎反映了其来源细胞的生理状况(gamez-valero等人(2015),同上；d tataruch-weinert、l musante、o kretz、h holthofer(2016)《用于rna提取的尿细胞外囊泡：无原核生物污染的方案的优化(urinary extracellular vesicles for rna extraction:optimization of a protocol devoid of prokaryote contamination)》.《细胞外囊泡杂志(j extracellular vesicles)》5:30281–http://dx.doi.org/10.3402/jev.v5.30281)。此外，所分泌的囊泡通过其被称为“外泌体穿梭rna”的mirna、mrna和trna介导细胞间通讯的特定方面(h valadi、k ekstrom、a bossios、m sjostrand、jj lee、lo lotvall(2007)《外泌体介导的mrna和微小rna转移是细胞间遗传交换的一种新机制(exosome-mediated transfer of mrnas and micrornas is a novel mechanism of genetic exchange between cells)》.《自然细胞生物学(nature cell biology)》9:654-659)。取决于尿液收集方法、uev富集和rna提取方法，在所报告的rna图谱中观察到显著的可变性(d tataruch-weinert等人(2016),同上)。11.最近的研究表明，ev可能是及时诊断和监测泌尿生殖系统恶性肿瘤的关键。尿液外泌体是ev的一个亚类，是含有蛋白质、mrna和微小rna(mirna)的小囊泡，并且由肾单位和泌尿生殖道所有部分的细胞释放。前列腺细胞产生的外泌体与前列腺分泌物一起通过前列腺射精管，直接排入尿道并进入尿液中，其在尿液中可以很容易地被检测到(oe bryzgunova、mm zaripov、te skvortsova、ea lekchnov、ae grigor'eva、ia zaporozhchenko、es morozkin、ei ryabchikova、yb yurchenko、ve voitsitskiy、pp laktionov(2016)《健康个体和前列腺癌患者的尿液中的细胞外囊泡的比较研究(comparative study of extracellular vesicles from the urine of healthy individuals and prostate cancer patients)》.《公共科学图书馆·综合(plos one)》11(6):e0157566.doi:10.1371/journal.pone.0157566)。nilsson等人(j nilsson、j skog、a nordstrand、v baranov、l mincheva-nilsson、xo breakefield、a widmark(2009)《前列腺癌源性尿液外泌体：前列腺癌生物标志物的新方法(prostate cancer-derived urine exosomes:a novel approach to biomarkers for prostate cancer)》.《英国癌症杂志(br j cancer)》100:1603-1607.doi:10.1038/sj.bjc.6605058)能够在从前列腺癌患者的尿液中分离的外泌体中检测两种已知的前列腺癌mrna生物标志物pca3和tmprss2-erg，这表明了ev用于前列腺癌诊断的潜力。这项研究和其它研究支持了从尿液中分离的外泌体中的rna作为前列腺癌的诊断标志物的用途，并提供了一种替代的、敏感的且独特的新型癌症生物标志物筛选。12.对于泌尿系统癌症，在许多情况下，尿液是优选的液体活检来源，因为它含有脱落的肿瘤细胞和无细胞肿瘤dna，并且可以容易地、无创地且重复地获得(lk larsen、ge lind、p guldberg、c dahl(2019)《在尿液中对泌尿系统癌症的基于dna甲基化的检测：生物标志物的概述以及对生物标志物设计、dna来源和检测技术的考虑(dna-methylation-based detection of urological cancer in urine:overview of biomarkers and considerations on biomarker design,source of dna,and detection technologies)》.《国际分子科学杂志(int j mol sci)》20,2657)。与血液相比，尿液被认为是早期检测或监测泌尿生殖道癌症复发的更敏感的替代方案(sy lin、ja linehan、tg wilson、dsb hoon(2017)《前列腺癌、膀胱癌和肾癌的尿无细胞核酸生物标志物的新兴应用(emerging utility of urinary cell-free nucleic acid biomarkers for prostate,bladder,and renal cancers)》.《欧洲泌尿学焦点(eur urol focus)》3(2-3):265-272.doi:10.1016/j.euf.2017.03.009)。此外，不需要有资格的人员来获得样本，样本允许在家中收集。然而，尿超甲基化dna在临床实践中的应用受到保存尿核酸的挑战的限制。因此，尿液需要以确保核酸保存的方式储存和运输，以允许下游分析(j bosschieter、s bach、iv bijnsdorp、li segerink、wf rurup、ap van splunter、i bahce、pw novianti、g kazemier、rja van moorselaar、rdm steenbergen、ja nieuwenhuijzen(2018)《dna甲基化分析前的尿液收集和储存方案(a protocol for urine collection and storage prior to dna methylation analysis)》.《公共科学图书馆·综合(plos one)》13(8):e0200906)。13.需要用于在环境温度下保存如尿液等体液的稳定组合物。14.提供此背景信息是为了揭示申请人认为可能与本发明相关的信息。绝非旨在承认，或不应理解为前述信息中的任何信息构成针对本发明的现有技术。技术实现要素：15.尽管存在多种用于如体液等生物样本中的核酸稳定的商业产品，但这些产品主要用于稳定dna或rna，而不是同时稳定两者。还没有报道过有效稳定如尿液等体液中的细胞和无细胞核酸的组合物。提供一种收集装置和位于其中的组合物将是有益的，所述收集装置和组合物防止完整细菌和人类细胞的裂解，从而阻止不需要的核酸释放到生物样本中，否则这将污染体内尿信号。所述组合物将另外防止膜囊泡的释放。这是至关重要的，因为无细胞rna被包裹在膜囊泡中，包含微囊泡和细胞外囊泡(包含但不限于外泌体)。优选地，所述组合物将在室温下保持如尿液等体液中的无细胞和细胞核酸(dna和rna)的稳定性和完整性至少7天，从而防止基于化学和酶的降解。本技术公开了这种组合物。16.一方面，提供了一种用于在环境温度下保存体液的水性稳定组合物，所述组合物包括：选自单糖、二糖或其组合的糖；缓冲剂；c1-c6烷醇；硼酸、硼酸盐或其组合；和螯合剂；其中所述组合物具有4.5至5.2的ph。17.另一方面，提供了一种用于保存体液的方法，所述方法包括：a)获得所述体液的样本；b)使所述体液与水性稳定组合物接触以形成混合物；所述组合物包括：选自单糖、二糖或其组合的糖；缓冲剂；c1-c6烷醇；硼酸、硼酸盐或其组合；和螯合剂；其中所述组合物具有4.5至5.2的ph；c)混合(b)的所述混合物以形成均匀混合物；和d)在环境温度下储存所述均匀混合物。18.又一方面，提供了一种水性组合物，所述组合物包括：选自单糖、二糖或其组合的糖；缓冲剂；c1-c6烷醇；硼酸、硼酸盐或其组合；螯合剂；和体液。附图说明19.为了更好地理解本发明，包含得到最终产品的发展进程，将参考结合附图使用的以下描述，其中：20.图1是示出了来自女性和男性供体的尿无细胞dna(ucfdna)的图表，其示出了尿液样本中的ucfdna的量具有样本和性别依赖性。21.图2a是示出了由于细菌生长，未经稳定的晨尿首段(fmfv)尿液样本的浊度增加的图表(如图2b进一步证明)。22.图2b是示出了δct[ct(t7)-ct(t0)]的图表，所述δct[ct(t7)-ct(t0)]通过细菌16s和β-珠蛋白qpcr测定确定，所述测定用于在rt(室温)下7天后的在未经稳定的尿液样本中的细菌和人类无细胞dna(cfdna)含量的定量。[0023]图2c和2d示出了安捷伦(agilent)4200tapestation分析的结果，其示出了在室温下7天后人类无细胞dna含量的大幅下降。[0024]图3a、3b和3c是以δct[ct(t7)-ct(t0)]和δct[ct(t0 chem)-ct(t0 na)]分别示出(i)稳定性和(ii)中性的图表，所述稳定性和中性通过β-珠蛋白qpcr测定确定，所述测定用于在各种条件下(包含与本技术的水性稳定组合物混合)在第0天以及在rt下储存7天后的尿液样本中的人类cfdna含量的定量。ct(t0)和ct(t7)分别表示第0天和第7天的qpcr循环阈值。ct(t0 chem)和ct(t0 na)分别表示第0天的含化学物质的尿液标本和未经保存处理的标本(na)的qpcr循环阈值。[0025]图4a和4b是示出了δct[ct(t)-ct(t0 na)]的图表，所述δct[ct(t)-ct(t0 na)]通过β-珠蛋白qpcr测定确定，所述测定用于在各种条件下(包含与本技术的水性稳定组合物混合)在室温下储存7天后的尿液样本中的人类cfdna含量的定量。ct(t)表示第7天的qpcr循环阈值。ct(t0 na)表示第0天的未经保存处理的标本(na)的qpcr循环阈值。[0026]图5a分别以δct[ct(t7)-ct(t0)]和δct[ct(t0 chem)-ct(t0 na)]示出了(i)稳定性和(ii)中性，所述稳定性和中性通过β-珠蛋白qpcr测定确定，所述测定用于在各种条件下(包含与本技术的水性稳定组合物混合)在第0天以及在rt下储存7天后的尿液样本中的人类cfdna含量的定量。ct(t0)和ct(t7)分别表示第0天和第7天的qpcr循环阈值。ct(t0chem)和ct(t0 na)分别表示第0天的含化学物质的尿液标本和未经保存处理的标本(na)的qpcr循环阈值。图5b示出了这些未经保存处理的和含有化学物质f(chem f)的尿液样本的代表性tapestation图谱分析，其示出了cfdna在未经保存处理的样本中降解，并且在本技术的水性稳定组合物中稳定。图5c、5d和5e是分别以δct[ct(t)-ct(t0)]和δct[ct(t0 chem)-ct(t0 na)]示出(i)稳定性和(ii)中性的图表，所述稳定性和中性通过β-珠蛋白qpcr测定确定，所述测定用于在各种条件下(包含与本技术的水性稳定组合物混合)在第0天以及在rt下储存7或14天后的尿液样本中的人类cfdna含量的定量。ct(t0)和ct(t)分别表示第0天和第7天或第14天的qpcr循环阈值。ct(t0 chem)和ct(t0 na)分别表示第0天的含化学物质的尿液标本和未经保存处理的标本(na)的qpcr循环阈值。[0027]图6(i)a和b是示出了δct[ct(t)-ct(t0na)]的图表，所述δct[ct(t)-ct(t0na)]通过β-珠蛋白qpcr测定确定，所述测定用于在各种条件下(包含与本技术的水性稳定组合物混合)在第0天以及在rt下储存7天后的添加前列腺癌细胞(s)的尿液样本中的人类cfdna含量的定量。ct(t)表示第0天或第7天的qpcr循环阈值。ct(t0 na)表示第0天的未经保存处理的加标标本(na)的qpcr循环阈值。图6(i)c示出了未经保存处理的和含有化学物质f(chem f)的尿液样本的代表性tapestation图谱分析。图6(ii)a是示出了δct[ct(t)-ct(t0na)]的图表，所述δct[ct(t)-ct(t0na)]通过β-珠蛋白qpcr测定确定，所述测定用于在各种条件下(包含与本技术的水性稳定组合物混合)在第0天以及在rt下储存7天后的添加前列腺癌细胞(s)的尿液样本中的人类cfdna含量的定量。ct(t)表示第0天或第7天的qpcr循环阈值。ct(t0 na)表示第0天的未经保存处理的加标标本(na)的qpcr循环阈值。图6(ii)b是示出了使用ddpcr测定确定的这些样本中的一些样本的每单位体积的β-珠蛋白基因的拷贝数的图表。总的来说，图6(i)和(ii)表明，本技术的水性稳定组合物在室温下以浓度依赖方式保持前列腺癌细胞的完整性至少7天。[0028]图7是示出了δct[ct(t)-ct(t0 na)]的图表，所述δct[ct(t)-ct(t0 na)]通过β-珠蛋白qpcr测定确定，所述测定用于在各种条件下(包含与本技术的水性稳定组合物以及购自施特雷克(streck)的市售组合物混合)在第0天以及在rt下储存7天后的添加有核白血细胞(s)的尿液样本中的人类cfdna含量的定量。ct(t)表示第0天或第7天的qpcr循环阈值。ct(t0 na)表示第0天的未经保存处理的加标标本(na)的qpcr循环阈值。[0029]图8a示出了hpaii和mspi限制性核酸内切酶消化图谱，其使用cpg甲基转移酶证实了体外质粒dna甲基化。图8b和8c示出了甲基化质粒的pcr扩增的tapestation结果，表明本组合物中的dna甲基化在rt下保持7天。[0030]图9a和9b是示出了δct[ct(t7)-ct(t0)]的图表，所述δct[ct(t7)-ct(t0)]通过氨苄青霉素抗性基因(ampr)和细菌16s qpcr测定确定，所述测定用于在室温下储存7天后的添加纯化hpv16质粒dna的未经保存处理的和含有化学物质f(chem f)的尿液样本中的hpv质粒dna和细菌dna含量的相应定量。ct(t7)表示第7天的qpcr循环阈值。ct(t0)表示第0天的qpcr循环阈值。[0031]图10a分别以δct[ct(t7)-ct(t0)]和δct[ct(t0 chem)-ct(t0 na)]示出了(i)稳定性和(ii)中性，所述稳定性和中性通过β-肌动蛋白rt-qpcr测定确定，所述测定用于在各种条件下(包含与本技术的水性稳定组合物混合)在第0天以及在rt下储存7天后的尿液样本中的人类ev rna含量的定量。ct(t0)和ct(t7)分别表示第0天和第7天的qpcr循环阈值。ct(t0 chem)和ct(t0 na)分别表示第0天的含化学物质的尿液标本和未经保存处理的标本(na)的qpcr循环阈值。图10b示出了第0天和第7天的来自未经保存处理的和含有化学物质f(chem f)的尿液标本的细胞外囊泡(ev)rna的代表性电泳图迹线。图10c和10d分别以δct[ct(t7)-ct(t0)]和δct[ct(t0 chem)-ct(t0 na)]示出了(i)稳定性和(ii)中性，所述稳定性和中性通过β-肌动蛋白rt-qpcr测定确定，所述测定用于在各种条件下(包含与本技术的水性稳定组合物混合)在第0天以及在rt下储存7天后的尿液样本中的人类ev rna含量的定量。ct(t0)和ct(t7)分别表示第0天和第7天的qpcr循环阈值。ct(t0 chem)和ct(t0 na)分别表示第0天的含化学物质的尿液标本和未经保存处理的标本(na)的qpcr循环阈值。[0032]图11是分别以δct[ct(t7)-ct(t0)]和δct[ct(t0 chem)-ct(t0 na)]示出了(i)稳定性和(ii)中性的图表，所述稳定性和中性通过β-肌动蛋白rt-qpcr测定确定，所述测定用于在各种条件下(包含与本技术的水性稳定组合物混合)在第0天以及在rt下储存7天后的尿液样本中的人类无细胞rna含量的定量。ct(t0)和ct(t7)分别表示第0天和第7天的qpcr循环阈值。ct(t0 chem)和ct(t0 na)分别表示第0天的含化学物质的尿液标本和未经保存处理的标本(na)的qpcr循环阈值。[0033]图12a和12b是分别以δct[ct(t7)-ct(t0)]和δct[ct(t0 chem)-ct(t0 na)]示出了(i)稳定性和(ii)中性的图表，所述稳定性和中性通过β-肌动蛋白rt-qpcr测定确定，所述测定用于在各种条件下(包含与本技术的水性稳定组合物混合)在第0天以及在rt下储存7天后的尿液样本中的细胞rna含量的定量。ct(t0)和ct(t7)分别表示第0天和第7天的qpcr循环阈值。ct(t0 chem)和ct(t0 na)分别表示第0天的含化学物质的尿液标本和未经保存处理的标本(na)的qpcr循环阈值。[0034]图13a示出了在与本技术的水性稳定组合物混合的未经保存处理的(na)和含有化学物质f(chem f)的尿液标本中的第0天和第7天提取的细胞dna的tapestation图谱。图13b示出了pcr扩增的gapdh产物的tapestation图谱。图13c示出了通过细菌16s qpcr测定确定的细菌dna含量％。[0035]图14示出了在与本技术的水性稳定组合物混合的未经保存处理的(te)和含有化学物质f的唾液标本中的第0天和第7天提取的cfdna的tapestation图谱。te代表1x tris-edta缓冲液。具体实施方式[0036]定义[0037]除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。[0038]如本说明书和权利要求书中所使用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述”包含多个提及物。[0039]如本文使用，术语“包括”将被理解为意指下面的列表是非穷举的，并且可以包含或不包含任何其它合适的项目，例如一个或多个另外的适当特征、组分、成分和/或元素。[0040]如本文使用，例如“基本上”、“约”和“大约”的程度术语意指被修饰术语的不显著改变最终结果的合理偏差量。这些程度术语应被解释为包含被修饰术语的至少±10％的偏差，如果这种偏差不会否定它所修饰的词的含义。[0041]如本文使用，术语“体液”将被理解为意指来自人类或动物的天然存在的流体，包含但不限于尿液、唾液、痰、血清、血浆、血液、咽、鼻/鼻咽和窦分泌物、粘液、胃液、胰液、骨髓穿刺液、脑脊液、粪便、精液、哺乳或月经产物、宫颈分泌物、阴道液、眼泪或淋巴液。在一个实施例中，体液选自尿液或唾液。在另一个实施例中，体液是尿液。[0042]如本文使用，术语“环境温度”是指体液(例如，尿液样本)和本文所述的水性稳定组合物的混合物从收集时起、在运输过程中(可能涉及相对极端的温度，但通常时间较短(例如，《5天))以及在分析前的长期储存过程中可能遇到的温度的范围。在一个实施例中，环境温度为约-20℃至约50℃。在另一个实施例中，环境温度为室温(rt)，其范围为约15℃至约25℃。[0043]如本文使用，术语“单糖”将被理解为意指不能通过水解分解成更简单的糖的糖，被分类为醛糖或酮糖，并且每个分子含有一个或多个羟基。在一个实施例中，单糖选自果糖、葡萄糖、甘露糖或半乳糖。在另一个实施例中，单糖是果糖、葡萄糖或其组合。[0044]如本文使用，术语“二糖”将被理解为意指其中两个单糖单元通过糖苷键连接的化合物。在一个实施例中，二糖选自蔗糖、海藻糖和乳糖。在另一个实施例中，二糖是蔗糖。[0045]已经发现，根据本技术的包括二糖的组合物可能更难制备，因为这种溶液可能具有非常高的粘度，这可能会由于混合困难而导致不适当的组分混合和/或向标本(即体液)中的加入。总的来说，由于样本的可加工性，对于本技术的组合物和方法，单糖比二糖更优选。[0046]如本文使用，术语“螯合剂(chelator/chelating agent)”将被理解为意指将与某些金属离子(例如，ca2+和mg2+)形成可溶的、稳定的络合物的化学物质，其螯合了这些离子，使得它们不能正常地与其它组分反应，例如脱氧核糖核酸酶(dna酶)或核酸内切酶(例如，i型、ii型和iii型限制性核酸内切酶)和核酸外切酶(例如，3'至5'核酸外切酶)、在各种体液样本中大量存在的酶。在本组合物中，螯合剂参与抑制生物样本中的dna酶和微生物生长。螯合剂可以是例如乙二醇四乙酸(egta)、(2-羟乙基)乙二胺三乙酸(hedta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、次氮基三乙酸(nta)、乙二胺三乙酸(edta)、1,2-环己二胺四乙酸(cdta)、n,n-双(羧甲基)甘氨酸、三乙烯四胺(teta)、四氮杂环十二烷四乙酸(dota)、去铁胺(desferioximine)、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸铁铵和柠檬酸锂。这些螯合剂可以单独使用或两种或多种组合使用。[0047]如本文使用，术语“c1-c6烷醇”将被理解为意指直链或支链的，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、正丁醇、戊醇、己醇或其任何组合。在本组合物的一个实施例中，优选的醇是乙醇。[0048]在一个实施例中，提供了一种用于在环境温度下保存体液的水性稳定组合物，所述组合物包括：选自单糖、二糖或其组合的糖；缓冲剂；c1-c6烷醇；硼酸、硼酸盐或其组合；和螯合剂；其中所述组合物具有4.5至5.2的ph。[0049]在一个实施例中，所述水性组合物包括硼酸；硼酸盐，诸如例如硼酸二氢盐、硼酸氢盐、二硼酸盐、三硼酸盐、四硼酸盐、偏硼酸盐、羟基硼酸盐、硼酸盐；或其组合。在另一个实施例中，所述水性组合物包括硼酸、硼酸钠或其组合。在又一个实施例中，所述水性组合物包括硼酸。在一个实施例中，所述硼酸、所述硼酸盐或所述其组合以约0.5％至约5％(wt/vol)；或约1％至约3％(wt/vol)；或约2％至约2.5％(wt/vol)、或约2.2％(wt/vol)的量存在于所述水性稳定组合物中。[0050]在一个实施例中，所述糖是单糖，诸如例如果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或其组合。在另一个实施例中，所述单糖是果糖、葡萄糖或其组合。在另一个实施例中，所述糖是二糖，诸如例如海藻糖、乳糖或蔗糖或其组合。在另一个实施例中，所述二糖是蔗糖。在一个实施例中，所述糖以约5％至约45％(wt/vol)、约5％至约40％(wt/vol)、或约10％至约30％(wt/vol)、或约18％至约22％(wt/vol)、或约20％(wt/vol)的量存在于所述水性稳定组合物中。[0051]通常，可以使用一种或多种合适的缓冲剂将本水性稳定组合物的ph保持在期望范围内。根据一个实施例，所述组合物包括一种、两种或更多种缓冲剂(非限制性实例是乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液，例如乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、柠檬酸钠和柠檬酸铵)，其在25℃下的对数酸离解常数pka值为3至6.5，以将ph保持在4.5至5.2的优选范围内。在一个实施例中，所述缓冲剂是乙酸钠。[0052]酸离解常数ka是溶液中的酸强度的定量度量。ka值越大，溶液中分子的离解越多，因此酸越强。由于ka值跨越了许多数量级，所以在实践中更常用酸离解常数的对数量度pka。pka值越大，在任何给定ph值下的离解程度越小，即酸越弱。在活生物体中，酸碱稳态和酶动力学取决于细胞内和体内的多种酸和碱的pka值。在化学中，pka值的知识对于制备缓冲溶液来说是必要的，也是定量理解酸或碱与金属离子之间形成络合物的相互作用的先决条件。本领域技术人员将理解，给定化合物/缓冲液只有当其浓度足够时，并且当溶液的ph接近其pka(在约一个ph单位内)时，才能缓冲溶液的ph。在一个实施例中，本组合物的ph在4.5至5.2的范围内。在一个优选实施例中，所述组合物的ph为约5.0。例如，所述水性稳定组合物中的缓冲剂的量可以为约150mm至约1.75m、或约150mm至约1.5m、或约500mm至约1.2m、或约0.7m至约0.8m、或约0.75m。[0053]在一个实施例中，所述水性稳定组合物中的所述c1-c6烷醇选自甲醇或乙醇。在另一个实施例中，所述c1-c6烷醇是乙醇。在又一个实施例中，所述c1-c6烷醇以约5％至约50％(vol/vol)、或约10％至约30％(vol/vol)、或约20％至约25％(vol/vol)、或约23％(vol/vol)的量存在于所述水性稳定组合物中。[0054]乙醇导致蛋白质脱水或水活性降低，随后是蛋白质之间的静电吸引、聚集和不溶。尽管不希望受理论束缚，但本发明人相信，在所使用的百分比下，乙醇在本组合物中没有或几乎没有固定性；相反，它对整体稳定性很重要，并且增强了本组合物中可能包含的其它化学化合物的功能。此外，对于易燃液体的装运/运输，理想的是将如乙醇等有机溶剂在溶液中保持为低于24体积％，以免违反危险货物运输(tdg)条例(联合国(un)编号1170)；否则，含》24％的溶液将被归类为3类(易燃液体)，强制需要特殊包装，并且运输复杂性和成本也会增加。因此，包括约23％(vol/vol)或更低浓度的水性稳定组合物是特别有利的。[0055]在另一个实施例中，所述水性稳定组合物中的所述螯合剂选自例如乙二胺三乙酸(edta)、1,2-环己二胺四乙酸(cdta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、四氮杂环十二烷四乙酸(dota)、四氮杂环十四烷四乙酸(teta)、去铁胺或其螯合剂类似物。在另一个实施例中，所述螯合剂是cdta。在另一个实施例中，所述螯合剂以约10mm至约120mm、或约10mm至约100mm、或约30mm至约70mm、或约40mm至约60mm、或约50mm的量存在于所述水性稳定组合物中。[0056]在所述水性稳定组合物的一个实施例中，所述组合物包括包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：所述糖(例如，果糖、葡萄糖、蔗糖或其组合；优选果糖、葡萄糖或其组合)，其量为约5％至约45％(wt/vol)、约5％至约40％(wt/vol)、或约10％至约30％(wt/vol)、或约18％至约22％(wt/vol)、或约20％(wt/vol)；所述缓冲剂(诸如例如乙酸钠)，其量为约150mm至约1.75m、或约150mm至约1.5m、或约500mm至约1.2m、或约0.7m至约0.8m、或约0.75m；所述c1-c6烷醇(例如，甲醇、乙醇或其组合；优选乙醇)，其量为约5％至约50％(vol/vol)、或约10％至约30％(vol/vol)、或约20％至约25％(vol/vol)、或约23％(vol/vol)；所述硼酸、所述硼酸盐或所述其组合(优选硼酸)，其量为约0.5％至约5％(wt/vol)；或约1％至约3％(wt/vol)；或约2％至约2.5％(wt/vol)、或约2.2％(wt/vol)；和所述螯合剂(例如，cdta)，其量为约10mm至约120mm、或约10mm至约100mm、或约30mm至约70mm、或约40mm至约60mm、或约50mm。[0057]在一个实施例中，所述水性稳定组合物稳定所述体液中含有的细胞(例如，癌细胞或有核血细胞)、细胞外囊泡、核酸(例如，细胞dna和rna，例如无细胞dna(cfdna)、无细胞rna(cfrna)和细胞外囊泡rna(ev rna))和/或微生物(例如，细菌或病毒)。[0058]在另一个实施例中，提供了一种用于保存体液的方法，所述方法包括：a)获得所述体液的样本；b)使所述体液与如上定义的所述水性稳定组合物接触以形成混合物；c)混合(b)的所述混合物以形成均匀混合物；和d)在环境温度下储存所述均匀混合物。在一个实施例中，保存所述体液包括稳定所述体液中含有的细胞(例如，癌细胞或有核血细胞)、细胞外囊泡、核酸(例如，dna和rna，例如无细胞dna(cfdna)、无细胞rna(cfrna)和细胞外囊泡rna(ev rna))和/或微生物(例如，细菌或病毒)。在另一个实施例中，所述体液中含有的所述细胞、核酸、细胞外囊泡和/或微生物在环境温度下稳定至少7天。在另一个实施例中，所述体液中含有的所述细胞、核酸、细胞外囊泡和/或微生物在环境温度下稳定至少14天。在另一个实施例中，所述体液是尿液或唾液。在另一个实施例中，所述体液是尿液。[0059]在又一个实施例中，提供了一种水性组合物，所述组合物包括：选自单糖、二糖或其组合的糖；缓冲剂；c1-c6烷醇；硼酸、硼酸盐或其组合；螯合剂；和体液。在一个实施例中，所述体液是尿液。在另一个实施例中，所述体液是尿液，并且包括所述体液的所述水性组合物的ph在5和5.5之间。在另一个实施例中，所述糖的存在量为约1.5％至约15％(wt/vol)、或约2％至约10％(wt/vol)、或约5％至约7％(wt/vol)、或约6％(wt/vol)；所述缓冲剂的存在量为约50mm至约500mm、或约200mm至约400mm、或约220mm至约240mm、或约230mm、或约225mm；所述c1-c6烷醇的存在量为约2％至约40％(vol/vol)、或约3％至约20％(vol/vol)、或约5％至约10％(vol/vol)、或约6.5％(vol/vol)、或约6.9％(vol/vol)；所述硼酸、所述硼酸盐或所述其组合的存在量为约0.1％至约2％(wt/vol)；或约0.2％至约1.5％(wt/vol)；或约0.5％至约1.0％(wt/vol)、或约0.7％(wt/vol)、或约0.6％(wt/vol)；并且所述螯合剂的存在量为约2.5mm至约50mm、或约5mm至约25mm、或约10mm至约20mm、或约16mm、或约15mm。[0060]在一个实施例中，所述体液是尿液，并且使用用于捕获预定体积的预定部分尿液(例如，首段)的装置来收集所述尿液样本，所述装置例如在题为“液体采样器、成套部件和组装方法(liquid sampler,kit of parts,and method for assembly)”的wo2014037152中描述的装置。在一个实施例中，可以使用colli-首段尿液收集装置(诺沃桑尼斯(novosanis))。水性稳定组合物可以在收集时存在于装置中，或者尿液可以在收集后立即与水性稳定组合物接触。含有尿液样本和水性稳定组合物的储器可以用合适的盖子密封，并且合并的样本和稳定组合物可以轻轻混合，例如通过将管倒置。尿液样本也可以收集在标准尿液标本容器中(例如，vwr；目录号10804-050)，然后与稳定组合物混合。可替代地，所收集的尿液可以置于冰袋上运输到实验室，可以在实验室中将其与本稳定组合物混合。[0061]在另一个实施例中，所述体液是唾液，并且使用装置来收集所述唾液样本，所述装置诸如例如在题为“用于可释放地储存物质的容器系统(container system for releasably storing a substance)”的wo2007/068094、题为“样本接收装置(sample receiving device)”的wo2010/020043和题为“封闭物、容纳设备及其使用方法(closure,containing apparatus,and method of using same)”的wo2010/130055中描述的装置。[0062]在另一个实施例中，所述体液是粪便，并且使用装置来收集所述粪便样本，所述装置例如在题为“用于从生物样本中收集、运输和储存生物分子的装置(device for collecting,transporting and storing biomolecules from a biological sample)”的wo2015172250中描述的装置。[0063]在另一个实施例中，所述体液样本可以收集在标准的市售实验室或运输管(例如，10ml圆底管(92x15.3mm)，目录号60.610；莎斯特(sarstedt)或更大的管，取决于样本类型和大小)中。含有体液样本和水性稳定组合物的管可以用合适的盖子密封，并且合并的样本和稳定组合物可以轻轻混合，例如通过将试倒置。[0064]体液应优选在收集时立即与稳定组合物混合。否则，在与组合物混合之前，样本应置于冰袋上储存和/或运输或冷藏。[0065]如技术人员将了解，本文所述的水性稳定组合物(“化学物质”)可以以各种比例与所述体液样本组合。例如，当所述体液是尿液时，希望避免过度稀释样本，从而减少所收集的分析物；因此，化学物质与尿液的比例可以在例如0.25:1至0.75:1的范围内，例如0.25:1、0.30:1、0.35:1、0.40:1、0.45:1、0.50:1、0.55:1、0.60:1、0.65:1、0.70:1或0.75:1。在一个实施例中，化学物质与尿液的比例为0.40:1至0.45:1。[0066]对于如粪便等其它体液，为了确保充分混合，可以使用更高的化学物质与样本的比例。[0067]在一个实施例中，在使所述体液与所述水性稳定组合物接触并混合以形成均匀混合物的步骤之后，所述均匀混合物包括：所述糖(例如，果糖、葡萄糖、蔗糖或其组合；优选果糖、葡萄糖或其组合)，其量为约1.5％至约15％(wt/vol)、或约2％至约10％(wt/vol)、或约5％至约7％(wt/vol)、或约6％(wt/vol)；所述缓冲剂(诸如例如乙酸钠)，其量为约50mm至约500mm、或约200mm至约400mm、或约220mm至约240mm、或约230mm、或约225mm；所述c1-c6烷醇(例如，甲醇、乙醇或其组合；优选乙醇)，其量为约2％至约40％(vol/vol)、或约3％至约20％(vol/vol)、或约5％至约10％(vol/vol)、或约6.5％(vol/vol)、或约6.9％(vol/vol)；所述硼酸、所述硼酸盐或所述其组合(优选硼酸)，其量为约0.1％至约2.2％(wt/vol)；或约0.2％至约1.5％(wt/vol)；或约0.5％至约1.0％(wt/vol)、或约0.7％(wt/vol)或约0.6％(wt/vol)；和所述螯合剂(优选cdta)，其量为约2.5mm至约50mm、或约5mm至约25mm、或约10mm至约20mm、或约16mm、或约15mm。[0068]如上所述，在一个实施例中，所述水性稳定组合物稳定所述体液中含有的细胞(例如，癌细胞或有核血细胞)、细胞外囊泡、核酸(例如，dna和rna，例如无细胞dna(cfdna)、无细胞rna(cfrna)和细胞外囊泡rna(ev rna))和/或微生物(例如，细菌或病毒)。在一个实施例中，所述水性稳定组合物在环境温度下稳定所述体液的这些组分至少7天。在另一个实施例中，所述水性稳定组合物在环境温度下稳定所述体液的这些组分至少14天。这种稳定可以通过本领域技术人员已知的方法来评定，例如经由监测无细胞核酸的降解(在材料和方法部分以及下面的实例中进一步描述)。[0069]δct对应于给定基因的量或表达的相对变化。δct对应于ct(t)-ct(t0)，其中ct(t)代表第7天或第14天的循环阈值，而ct(t0)表示第0天的循环阈值。反应的循环阈值(ct)值被定义为当pcr产物的荧光可以在背景信号之上被检测到时的循环数。在本研究中，当以ct(t7或t14)-ct(t0)计算时，本δct表示在室温下储存指定时间后的未经保存处理的和经保存处理的样本中的不同分析物的稳定性的变化。当以ct(t0 chem)-ct(t0 na)计算时，δct表示中性(在收集时(即第0天)的在尿液样本中加入给定化学物质的情况下的分析物相对于未经保存处理的尿液样本的基础浓度的变化)。不变的δct值或接近0的δct值表明稳定性，因为这意味着分析物的浓度未随着时间的推移而显著变化(因此表明组合物中的分析物在测试条件下的稳定性)。例如，在本无细胞dna研究中，在rt下保存7天的未经保存处理的样本中，δct值的范围为+2至+14。δct值的这种显著增加(中值：》+5)表明未经保存处理的样本中的无细胞dna的降解。另一方面，在室温下在本水性稳定组合物中储存后的无细胞dna检测的δct中值几乎为零，表明无细胞dna稳定性和含量的保持，也间接表示了细胞稳定性和完整性。对于无细胞rna，未经保存处理的样本中的δct中值+2.5表明无细胞rna降解，而相对较低的δct中值1.3表明与未经保存处理的样本相比，经保存处理的样本中的无细胞rna含量的稳定性更好。对于细胞rna稳定性，未经保存处理的样本中的δct中值+7.0表明细胞rna的显著降解。另一方面，经保存处理的样本中的小于2的δct中值表明细胞rna稳定性。类似地，对于ev rna，未经保存处理的样本中的大于+3的δct中值表明ev rna的不稳定性和检测受损，而经保存处理的样本中的δct中值0.5表明优异的ev rna稳定性和检测。这仅仅是评定体液中的细胞、细胞外囊泡、核酸和/或微生物的稳定的一种示例性方法，并且评定这种稳定的其它方法是技术人员已知的和/或在材料和方法部分和下面描述的实例中进一步详细概述。[0070]如以下实例7中所进一步详细描述，含有福尔马林/甲醛基固定剂的保存剂/组合物可以用于固定生物样本或标本中的细胞，并防止细胞核酸泄漏到细胞外空间中。这种组合物可以含有甲醛，或者可替代地含有能够释放醛的化合物，例如甲醛释放剂/甲醛供体/甲醛释放保存剂，所述甲醛释放保存剂是缓慢释放甲醛的化学化合物。值得注意的是，当与从冷冻组织中分离的dna相比时，福尔马林固定的组织表现出高频率的不可再现的序列改变(srinivasan m、sedmak d、jewell s(2002)《固定剂和组织处理对核酸的含量和完整性的影响(effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids)》.《美国病理学杂志(am j pathol)》161(6):1961-1971)。甲醛是最常用的固定剂的主要成分，其会导致dna-蛋白质和rna-蛋白质交联的产生。此外，在没有缓冲固定剂溶液的情况下，核酸将会断裂。以上两种情形都给基于pcr的分析带来了挑战(gilbert mtp、haselkorn t、bunce m、sanchez jj、lucas sb、jewell ld、van marck e、worobey m(2007)《从固定的石蜡包埋组织中分离核酸—什么时候哪种方法有用？(the isolation of nucleic acids from fixed,paraffin-embedded tissues–which methods are useful when？)》《公共科学图书馆·综合(plos one)》2(6):e537.doi:10.1371/journal.pone.0000537；wong sq、li j、tan ay-c、vedururu r、pang j-mb、do h、ellul j、doig k、bell a、macarthur ga、fox sb、thomas dm、fellowes a、parisot jp、dobrovic a(2014)《通过大规模平行测序检测热点区域突变的福尔马林固定肿瘤前瞻性系列中的序列伪影(sequence artifacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing)》.《bmc医学基因组学(bmc medical genomics)》7:23.doi:10.1186/1755-8794-7-23)。具体而言，这种对dna的化学损伤降低了taq dna聚合酶保真度和pcr扩增效率(sikorsky ja、primerano da、fenger tw、denvir j(2007)《dna损伤降低了taq dna聚合酶保真度和pcr扩增效率(dna damage reduces taq dna polymerase fidelity and pcr amplification efficiency)》.《生物化学和生物物理研究通讯(biochem biophys res commun)》355(2):431-437)。因此，福尔马林/甲醛基固定剂对于分子分析并不理想。因此，本文公开的用于在环境温度下保存体液的水性稳定组合物和方法的优点在于，本技术的组合物和方法不需要使用甲醛或能够释放醛的化合物/组分，例如甲醛释放剂、甲醛供体或甲醛释放保存剂。[0071]实例[0072]材料和方法[0073]无细胞核酸提取：[0074]根据制造商的方案，使用qiaamp循环核酸提取试剂盒(凯杰(qiagen)；目录号55114)进行无细胞核酸提取。在室温(rt)下，将晨尿首段(fmfv)人类尿液、随机午尿首段(fv)尿液样本和唾液样本以3000g至3800g离心10至20分钟，并将澄清的上清液(2至4ml)用于无细胞核酸提取。根据制造商的说明，使用hs d5000胶条(安捷伦，目录号5067-5592)和试剂(安捷伦，目录号5067-5593)在4200安捷伦tapestation平台上评定所提取的无细胞核酸图谱。[0075]尿细胞外囊泡(ev)rna提取：[0076]使用exorneasy maxi试剂盒(凯杰，目录号77164)或超滤进行尿液ev rna提取。通过在rt下以3000×g离心10分钟对尿液样本进行预澄清，随后使用0.80μm注射器过滤器(minisart目录号16592，或-aa，目录号slaa033sb)进行过滤，然后根据制造商的说明，进行ev分离和》200个核苷酸(nt)长的rna的提取(补充信息：使用exorneasy血清/血浆midi/maxi试剂盒从尿液中纯化外泌体rna，包含mirna)。使用带有ultracel-100再生纤维素膜的amicon ultra-15离心单元(密理博-西格玛(millipore-sigma)；目录号ufc910024)，如下进行使用超滤的ev和ev rna分离：[0077]1.在室温(rt)下以4000g离心5分钟，用1x pbs ph 7.4(赛默飞世尔科技(thermo fisher scientific)；目录号10010023)洗涤空ultracel-100 15ml柱。[0078]2.通过在rt下以4000g离心10分钟，使用ultracel-100柱浓缩经预澄清和过滤的尿液样本，并丢弃所得滤液。[0079]3.通过在rt下以4000g离心5分钟，用1x pbs ph 7.4(赛默飞世尔科技；目录号10010023)洗涤含保留的浓缩尿液的ultracel-100 15ml柱过滤器。[0080]3.将700μl qiazol裂解试剂(凯杰，目录号79306)直接加入到经洗涤的ultracel-100过滤器中，用于裂解所捕获的ev以进行ev rna提取。将过滤柱转移到新的50ml falcon管；涡旋10秒，在rt下孵育5分钟，随后在rt下以4000g离心5分钟。[0081]4.收集所得滤液和过滤器上保留的回忆性(reminiscent)裂解物，以进行ev rna分离。加入100μl氯仿并剧烈涡旋。在rt下静置2至5分钟。[0082]5.在4℃下以12,000x g离心15分钟。将～400μl水相转移到新管。[0083]6.加入400μl(等体积)70％乙醇，并适当混合，然后将混合物转移到凯杰rneasy minelute柱。在rt下以8,000x g离心30秒。丢弃滤液。[0084]7.向柱加入700μl缓冲液rwt(凯杰)。在rt下以8,000x g离心30秒。丢弃滤液。[0085]8.向柱加入500μl缓冲液rpe(凯杰)。在rt下以8,000x g离心30秒。丢弃滤液。[0086]9.向柱加入500μl缓冲液rpe(凯杰)。在rt下以8,000x g离心2分钟。丢弃滤液，并将空柱转移到新的2ml收集管(凯杰)。在盖子打开的情况下，将柱以最大速度离心5分钟，以干燥膜。[0087]10.向经干燥的离心柱的中心加入20μl无rna酶的水。让柱在rt下静置1分钟，随后在rt下以最大速度离心1分钟。[0088]11.将所收集的rna样本在-80℃下储存，直到进行定量和下游处理。[0089]12.根据制造商的说明，使用安捷伦rna 6000pico试剂盒(目录号5067-1513)在安捷伦2100生物分析仪上对所提取的ev rna样本进行定量，和/或使用quant-it ribogreen rna测定试剂盒(赛默飞世尔科技，目录号r11490)进行ribogreen定量分析，用于下游cdna制备。[0090]16s qpcr测定：[0091]使用2x itaq universal sybr mastermix(伯乐(bio-rad)；目录号1725121)对从尿液样本中提取的核酸进行qpcr测定，以进行细菌dna含量的定量。细菌16s rrna的引物和qpcr条件如下：bacrrna173-正向引物5'attaccgcggctgctgg 3'(seq id no:1)，bacrrna173-反向引物5'cctacgggaggcagcag 3'(seq id no:2)(dc emery、dk shoemark、te blatstone、cm waterfall、ja coghill、ta cerajewska、m davies、nx west、sj allen(2017)《16s rrna下一代测序分析显示了阿尔茨海默病死后大脑中的细菌(16s rrna next generation sequencing analysis shows bacteria in alzheimer's post-mortem brain)》.《衰老神经科学的前沿(frontiers in aging neuroscience)》9:195.doi:10.3389/friagi.2017.00195)。扩增混合物(20μl)含有：10μl 2x itaq universal sybr mastermix、10μm正向和反向引物各1μl、6μl无核酸酶的水(购自英杰(invitrogen)的nfw，目录号10977023)和2μl所提取的尿无细胞核酸。在每次qpcr运行中，使用连续稀释(1、1:10、1:100和1:1000)的大肠杆菌gdna标准品和非模板对照(2μl无rna酶/dna酶的水)。在伯乐c1000触摸热循环仪(#1851196)上进行pcr反应，并且条件如下：95℃：5分钟，[95℃：20秒，56℃：30秒]×45个循环。通过以0.5℃的增量将样本从65℃加热到95℃并在每次增量时读板5秒钟来获得熔解曲线。使用代表[ct(t7)-ct(t0)]的“δct”进行细菌无细胞dna或细胞dna定量分析。“ct(t7)”和“ct(t0)”分别代表第7天和第0天的qpcr循环阈值。[0092]人类β-珠蛋白qpcr测定：[0093]使用2x itaq universal sybr mastermix(伯乐；目录号1725121)对从尿液样本中提取的核酸进行qpcr测定，以进行人类无细胞dna含量的定量。人类β-珠蛋白qpcr测定的引物和pcr条件在文献中有所描述(m jung、s klotzek、m lewandowski、m fleischhacker、k jung(2003)《血液样本储存过程中的血清和血浆中的dna的浓度变化(changes in concentration of dna in serum and plasma during storage of blood samples)》.《临床化学(clinical chem)》49(6):1028-1029)并且如下：正向引物：5′acacaactgtgttcactagc 3′(seq id no:3)，反向引物：5′caacttcatccacgttcacc 3′(seq id no:4)。扩增混合物(20μl)含有：10μl 2x itaq universal sybr mastermix、10μm正向和反向引物各1μl、6μl无核酸酶的水(英杰，目录号10977023)和2μl所提取的尿无细胞核酸。在每次qpcr运行中，使用连续稀释(1、1:10、1:100和1:1000)的人类gdna标准品和非模板对照(2μl无rna酶/dna酶的水)。在伯乐c1000触摸热循环仪(#1851196)上进行pcr反应，并且条件如下：95℃：5分钟，[(95℃：20秒，56℃：30秒)×45个循环]。通过以0.5℃的增量将样本从65℃加热到95℃并在每次增量时读板5秒钟来获得熔解曲线。对于稳定性评定：使用代表[ct(t)-ct(t0)]的“δct”进行人类无细胞dna定量分析。“ct(t)”代表第7天或第14天的qpcr循环阈值，而“ct(t0)”代表未经保存处理的和含有化学物质的尿液样本的第0天的qpcr循环阈值。相对于未经保存处理的第0天(na)样本的无细胞dna定量通过以[ct(t)-ct(t0 na)]进行δct计算来进行定量，其中ct(t0 na)代表第0天的未经保存处理的样本的qpcr循环阈值。此外，为了评定中性(即在收集时的在尿液样本中加入给定化学物质的情况下的无细胞dna的基础浓度的变化)，以[ct(t0 chem)-ct(t0 na)]进行δct计算，其中ct(t0 chem)代表含化学物质/稳定溶液的第0天尿液样本的qpcr循环阈值。[0094]体外dna甲基化测定：[0095]本测定如文献(c ernst、po mcgowan、v deleva、mj meaney、m szyf、g turecki(2008)《ph对dna甲基化状态的影响：体外和死后大脑研究(the effects of ph on dna methylation state:in vitro and post-mortem brain studies)》.《神经科学方法杂志(j neurosci methods)》174(1):123-125)中所述来进行。pgl3-碱性质粒(普洛麦格(promega)；目录号e1751)含有25个ccgg位点。根据制造商的方案，用cpg甲基转移酶(纽英伦生物技术(new england biolabs)；目录号m0226s)处理1μg质粒，所述甲基转移酶是一种甲基化cpg二核苷酸中的所有胞嘧啶核苷酸的酶。为了证实甲基化状态，用hpaii和mspi对甲基化质粒(pgl3-ch3)进行限制性核酸内切酶消化。这两种酶都识别了相同的位点(ccgg)。尽管hpaii在内部c甲基化时被阻止切割dna，但mspi对内部c的甲基化状态也不敏感。使用齐莫研究(zymo research)的dna clean&concentrator-5试剂盒(目录号d4013)对体外甲基化pgl3质粒进行柱纯化。将等量的纯化质粒添加到1x te缓冲液ph 8.0(阳性对照)中或添加到含有本发明的组合物的男性合并和女性合并fmfv尿液样本中，并将反应管在rt下保持7天。孵育后，使用凯杰epitec亚硫酸氢盐试剂盒(目录号59104)对dna样本进行亚硫酸氢盐转化。亚硫酸氢盐处理将造成未甲基化质粒(胞嘧啶到尿嘧啶的转化)和甲基化质粒(甲基化胞嘧啶将对转化保持免疫)之间的序列差异(y li和to tollefsbol(2011)《dna甲基化检测：亚硫酸氢盐基因组测序分析(dna methylation detection:bisulfite genomic sequencing analysis)》.《分子生物学方法(methods mol biol)》791:11-21.doi:10.1007/978-1-61779-316-5_2)。使用甲基化质粒特异性引物的pcr实验将产生278bp的扩增子。如ernst等人(2008)同上中所述使用引物(正向引物：5'-aagatgtttttttgtgattggt-3'(seq id no:5)；反向引物：5'-ttcctatttttactcacccaaa-3'(seq id no:6))。[0096]hpv质粒添加测定：[0097]在lb培养基中培养大肠杆菌dh5α菌株hpv16质粒(人类乳头瘤病毒；16型克隆)(atcc目录号45113)，以使用zymopure ii质粒maxi prep样本试剂盒(齐莫研究，目录号d4202和d4203)提取hpv16质粒。在有和没有本发明的保存剂化学物质的情况下，将所提取/纯化的质粒以一定的浓度(1至10ng/ml)添加到女性合并和男性合并晨尿首段尿液样本中。对添加质粒的尿液样本的每份200μl等分试样进行处理，以使用qiaamp dna迷你试剂盒在qiacube connect上进行总dna提取。针对hpv16质粒主链上发现的氨苄青霉素抗性基因(ampr)使用qpcr测定来对每个反应管中以及不同天(t0和t7)的质粒dna的量进行定量。ampr qpcr引物和条件如下：正向引物(fp)：5′agccataccaaacgacgag 3′(seq id no:7)；反向引物(rp)：5′agcaataaaccagccagcc 3′(seq id no:8)。扩增混合物(20μl)含有10μl 2x itaq universal sybr mastermix、10μm正向和反向引物各1μl、6μl无核酸酶的水(英杰，目录号10977023)和2μl所提取的尿核酸。在每次qpcr运行中，使用连续稀释(1、1:10、1:100、1:1000)的hpv16质粒标准品和非模板对照(2μl无rna酶/dna酶的水)。在伯乐c1000触摸热循环仪(#1851196)上进行pcr反应，并且条件如下：95℃：5分钟，[(95℃：20秒，55℃：30秒)×45个循环]。通过以0.5℃的增量将样本从65℃加热到95℃并在每次增量时读板5秒钟来获得熔解曲线。使用代表[ct(t7)-ct(t0)]的“δct”进行hpv质粒dna定量分析。“ct(t7)”和“ct(t0)”分别代表第7天和第0天的qpcr循环阈值。[0098]尿无细胞和细胞rna提取：[0099]通过以下对来自尿液沉淀的总细胞rna进行提取：1)根据制造商的说明，使用凯杰rneasy plus迷你试剂盒(目录号74134)并在30μl无rna酶的水中洗脱，和/或2)使用trizol ls试剂(西格玛(sigma)，目录号t3934)，如下所述：[0100]在每个时间点，将样本以3800x g离心20分钟。在每个时间点，将沉淀重悬于750μl tri试剂ls(和250μl水)中。在-80℃下冷冻之前，允许样本静置5分钟。将样本在rt下解冻，并进行如下处理：[0101]1.加入200μl氯仿并剧烈涡旋。在rt下静置2至15分钟。[0102]2.在4℃下以12,000x g离心15分钟(水相的体积为tri试剂体积的约70％)。将500μl水相转移到新管。[0103]3.加入50μl 10x dna酶缓冲液和1μl无rna酶的dna酶(卢西根(lucigen)，目录号d9905k)。在37℃下孵育15分钟。[0104]4.加入500μl(等体积)酸性酚氯仿并剧烈涡旋。静置5分钟，随后在4℃下以12,000x g离心10分钟。将水相转移到新管中，并加入1μl 20μg/μl糖原和500μl异丙醇。在rt下静置10分钟。[0105]5.在4℃下以12,000x g离心8分钟。去除上清液并用1ml 75％乙醇洗涤沉淀。涡旋样本，然后以12,000x g离心5分钟。去除上清液，并风干沉淀5至10分钟。[0106]6.将沉淀重悬于30μl无rna酶的水中。[0107]使用凯杰循环核酸试剂盒(目录号55114)从上清液中提取总无细胞核酸，并在30至50μl试剂盒缓冲液ave中洗脱。使用pico6000 rna测定(目录号5067-1513)在2100安捷伦生物分析仪上进行rna图谱分析。使用基于taqman的rt-qpcr测定对购自赛默飞世尔科技的β-肌动蛋白(actb:hs00357333_g1)(目录号4331182)进行mrna靶标分析。对于无细胞rna定量研究，在cdna合成之前，使用dna酶i消化进行无细胞dna去除，随后按照qiaamp循环核酸试剂盒(凯杰；目录号55114)中描述的说明使用rneasy minelute纯化试剂盒(凯杰；目录号74204)进行纯化。[0108]细胞、无细胞和ev rna的rt-qpcr测定：[0109]根据制造商的方案，使用随机六聚体和m-mlv逆转录酶(赛默飞世尔科技；目录号28025-013)用等量(ng)的从每个样本中提取的rna制备cdna；根据制造商的方案，使用2μl纯cdna用taqman基因表达master mix ii和ung(赛默飞世尔科技；目录号4440038)进行β-肌动蛋白taqman测定，并且每个样本以一式两份或三份运行。最初，使用由血液rna制备的cdna的连续稀释来测试actb taqman测定的效率。在伯乐c1000触摸热循环仪(目录号1851196)中进行pcr反应，并且条件如下：50℃：2分钟，95℃：10分钟，[95℃：15秒，60℃：1分钟]×45个循环。rna稳定性定量被表示为代表[ct(t7)-ct(t0)]的“δct”。“ct(t7)”和“ct(t0)”分别代表第7天和第0天的qpcr循环阈值。此外，为了评定中性(在收集时的在尿液样本中加入给定化学物质的情况下的分析物的基础浓度的变化)，以[ct(t0 chem)-ct(t0 na)]进行δct计算，其中ct(t0 chem)代表含化学物质/稳定溶液的第0天尿液样本的qpcr循环阈值。[0110]针对靶β-珠蛋白基因的dna样本的微滴式数字pcr(ddpcr)分析：[0111]ddpcr的各个反应含有100nm的最终引物浓度以及最终体积为23μl的2x qx200 ddpcr evagreen supermix(伯乐；目录号1864034)。将20μl反应混合物转移到含65μl evagreen用微滴生成油(伯乐；目录号1864006)的dg8小柱(伯乐；目录号1864008)，用dg8垫圈(伯乐；目录号1863009)覆盖并用伯乐qx200微滴生成器转化成微滴。然后，将微滴转移到96孔板(伯乐；目录号12001925)并使用伯乐px1 pcr平板密封器(目录号1814000)在180℃下用可刺穿箔热封(伯乐；目录号1814040)热密封6秒。然后，将样本在伯乐c1000触摸热循环仪(目录号1851196)中循环，使用3步循环程序：95℃5分钟，随后95℃30秒x50个循环，退火温度设置为58℃下1分钟和72℃下30秒，随后各自(4℃5分钟、90℃5分钟)x1个循环，并保持在12℃。β-珠蛋白ddpcr测定中使用的引物与上述β-珠蛋白qpcr测定所使用相同(正向引物：5′acacaactgtgttcactagc 3′(seq id no:3)，反向引物：5′caacttcatccacgttcacc 3′(seq id no:4))。所有升温速率都设置为2摄氏度/秒。然后，将循环的平板转移并在qx200微滴阅读器(伯乐；目录号1864003)上读取；用quanta-soft软件(伯乐；目录号1864011)对数据进行分析。对于分析而言，丰度以浓度(每μl拷贝数)报告，并且对于给定样本，总接受微滴超过10,000个微滴。[0112]尿细胞dna提取和定量：[0113]根据制造商的说明，使用qiaamp dna迷你试剂盒(凯杰；目录号51306)来自尿液沉淀的总细胞dna进行提取，并在50μl洗脱缓冲液或无核酸酶的水(nfw)中洗脱。在每个时间点，将样本以3800x g离心20分钟。将尿液沉淀在-80℃下冷冻保存，直至提取。将沉淀在rt下解冻，并重悬于200μl 1x pbs中，随后进行总dna提取。使用quant-ittm picogreentm dsdna试剂(赛默飞世尔科技；目录号p7581)进行总细胞dna定量。根据说明，使用基因组dna胶条在安捷伦4200tapestation上评定总基因组dna图谱。使用gapdh pcr对～1kb的扩增子产物进行人类基因组dna的靶向扩增。gapdh qpcr测定的引物和pcr条件如下：正向引物：5'-gtc aac gga ttt ggt cgt att g-3'(seq id no:9)；反向引物：5'-ctc tct tcc tct tgt gct ctt g-3'(seq id no:10)。95℃，5分钟，[95℃，30秒；56℃，30秒；72℃，60秒]x25个循环；72℃，10分钟4℃，保持。每个反应设置如下：[0114][0115][0116]在下面的实例中，糖占组合物的百分比以wt/vol计，烷醇(例如，甲醇或乙醇)占组合物的百分比以vol/vol计，并且硼酸的百分比以wt/vol计。[0117]实例1—尿无细胞dna含量具有样本和性别依赖性[0118]从健康的女性和男性供体中收集大约20至30ml的晨尿首段(fmfv)尿液到尿液标本杯中；置于冰袋上运输和储存，直到下游处理。在尿液收集的3小时内，将标本的每份4.5ml等分试样在室温下以3,800g离心20分钟。使用qiaamp循环核酸试剂盒(凯杰；目录号55114；参见材料和方法)，从每份4.0ml的即刻所得上清液或-80℃下储存的冷冻上清液等分试样中提取无细胞核酸。随后，使用pico-green定量测定来测量尿无细胞dna(ucf-dna)浓度。女性供体的平均尿无细胞dna浓度为约15ng/ml，而男性为大约3ng/ml(参见图1)。文献中还报道了女性尿液中存在比男性尿液中更高的无细胞dna量(streleckiene g、reid hm、arnold n、bauerschlag d、forster m.《定量尿液中的无细胞dna：商业试剂盒之间的比较，性别和个体间差异的影响(quantifying cell free dna in urine:comparison between commercial kits,impact of gender and inter-individual variation)》.《生物技术(biotechniques)》.2018,64(5):225-230。[0119]实例2—人类无细胞dna在室温下储存的不稳定尿液中降解[0120]在不存在保存剂或稳定剂(na)的情况下，室温下储存的尿液会发生可见的和分子上的变化。在本实例中，从健康的女性供体收集20至30ml晨尿首段(fmfv)尿液，并在室温下储存7天。在此期间，这种代表性尿液样本变得越来越浑浊(图2a)，如通过细菌计数(od600nm)的增加所测量。这一观察结果得到了定量细菌16s qpcr测定(图2b，参见材料和方法)的进一步证实，所述测定示出了细菌16s dna的δct的急剧降低，表明由于细菌细胞的过度生长和裂解，细菌无细胞dna含量增加。相比之下，β-珠蛋白dna的δct急剧增加，表明人类无细胞dna含量显著减少(图2b至d)，如通过β-珠蛋白无细胞dna qpcr测定(图2b；参见材料和方法)和安捷伦4200tapestation分析(参见图2c至d中的箭头，参见材料和方法)所测量。两种方法比较了从第0天和第7天的尿液等分试样中提取的无细胞dna，清楚地示出了在室温下7天后的无细胞dna含量的大幅下降(图2b至d)。[0121]实例3—在用于无细胞dna的本尿液稳定组合物中可以使用不同的糖(单糖/二糖)[0122]五名健康的男性和女性供体提供了60至70ml晨尿首段(fmfv)尿液标本。将标本置于冰袋上运输到实验室，在实验室中，1)在不存在稳定组合物(未经保存处理)的情况下储存标本，每份20ml，并且2)将每份12ml的尿液标本与4ml储备溶液[表1(i)]和4ml 95％乙醇混合，所述储备溶液含有不同的糖，即葡萄糖(chem g)、蔗糖(chem s)和果糖(chem f)。在本实例中，与尿液混合后的稳定溶液的最终组合物在下面描述[参见表1(ii)]。两种类型的标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。[0123]在第0天和第7天，将未经保存处理的和含有不同化学物质的标本的每份4.5ml等分试样在室温下以3,800g离心20分钟。在离心后，从每个标本中回收4.0ml上清液，并使用qiaamp循环核酸试剂盒(凯杰，参见材料和方法)提取无细胞dna。来自每个标本的两微升纯化无细胞dna用作β-珠蛋白qpcr分析的模板(参见材料和方法)。图3a和3b示出了β-珠蛋白dna的δct的急剧增加，表明在未经保存处理的标本在室温下储存7天后，人类无细胞dna含量急剧降低。相比之下，在室温下7天后的含不同的糖的标本中的人类无细胞dna水平没有显著变化，如几乎为零的δct中值所示[图3a(i)和3b(i)]。此外，在收集时(第0天)的加入化学物质的尿液样本中的无细胞dna含量相对于未经保存处理的(na)样本没有显著变化[图3a(ii)和3b(ii)]。[0124]在另一个实验设置中，健康的男性和女性供体使用colli-装置(诺沃桑尼斯)提供了随机首段(fv)尿液标本。将标本置于冰袋上运输到实验室，在实验室中，将男性和女性尿液样本合并，以分别产生男性合并标本和女性合并标本。将每个合并标本的等分试样在以下条件下储存：1)在不存在稳定组合物(未经保存处理)的情况下，和2)以尿液/化学物质比1:0.43与含有不同的糖的化学物质[表2(i)]混合，所述不同的糖即葡萄糖(化学物质g)和果糖(化学物质f)。在本实例中，与尿液混合后的稳定溶液的最终组合物在下面描述[参见表2(ii)]。所有标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。[0125]在第0天和第7天，将未经保存处理的和含有不同化学物质的标本的每份2.5ml等分试样在室温下以3,000g离心10分钟，随后使用0.8μm注射器过滤器(minisart目录号16592，或-aa，目录号slaa033sb)进行过滤。使用qiaamp循环核酸试剂盒(凯杰，参见材料和方法)，将2.0ml预澄清上清液用于无细胞dna(cfdna)提取。图3c(i)示出了β-珠蛋白dna的δct(中值：+5.8)的急剧增加，表明在未经保存处理的标本在室温下储存7天后，人类无细胞dna含量急剧降低。相比之下，β-珠蛋白dna水平的δct没有显著变化，表明在室温下7天后的含有化学物质f(chem f)和化学物质g(chem g)的标本中的人类无细胞dna含量没有变化[图3c(i)]。此外，在收集时(第0天)的加入化学物质的尿液样本中的无细胞dna含量相对于未经保存处理的(na)样本没有显著变化[图3c(ii)]。[0126]含二糖蔗糖的本组合物难以制备，因为溶液的粘度非常高，导致不适当的组分混合。由于混合困难，高粘度可能会进一步导致稳定溶液向标本中的不适当加入。因此，为了避免在稳定溶液的制备和测试中出现这些基本难题，决定将重点放在有效的含有单糖的组合物上，同时仍然保持了无细胞dna含量的足够稳定(图3b和3c)。总的来说，由于样本的可加工性，对于本发明，单糖比二糖更优选。[0127]表1(i)：与尿液混合前的不同储备溶液的组合物。[0128]组合物化学物质g(葡萄糖)化学物质s(蔗糖)化学物质f(果糖)乙酸钠1750mm1750mm1750mm硼酸5％5％5％cdta119mm119mm119mm糖45％45％45％ph4.7至5.04.7至5.04.7至5.0[0129]表1(ii)：与尿液混合后的稳定溶液的最终组合物。[0130]组合物化学物质g(葡萄糖)化学物质s(蔗糖)化学物质f(果糖)乙酸钠350mm350mm350mm硼酸1％1％1％cdta23.8mm23.8mm23.8mm糖9％9％9％乙醇19％19％19％[0131]表2(i)：与尿液混合前的不同储备溶液的组合物。[0132]组合物化学物质g(葡萄糖)化学物质f(果糖)乙酸钠750mm750mm硼酸2.2％2.2％cdta50mm50mm糖20％20％乙醇23％23％ph5.0至5.25.0至5.2[0133]表2(ii)：与尿液混合后的稳定溶液的最终组合物。[0134]组合物化学物质g(葡萄糖)化学物质f(果糖)乙酸钠225mm225mm硼酸0.7％0.7％cdta15mm15mm糖6％6％乙醇6.9％6.9％[0135]实例4：糖、醇、缓冲液和较低ph的存在调节了本组合物的稳定效果。[0136]六名健康的女性供体提供了30ml晨尿首段尿(fmfv)标本，并且将她们的尿液样本合并在一起以产生两个不同的合并尿液标本；1)在不存在稳定组合物(na)的情况下储存合并标本，每份15ml，并且2)将每份11ml的合并尿液标本与3ml储备溶液混合(含本组合物的不同迭代；以下表3)和1ml 95％乙醇/甲醇，如表4中所述。与合并尿液混合后的最终组合物在以下表5中描述。所有标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。为了进行比较，将25ml合并尿液与5ml施特雷克的尿液固定剂(参考组合物)混合，所述固定剂在商业上被称为“无细胞dna尿液保存剂”(目录号230216)，并在室温下储存至少7天。这种参考组合物包括甲醛释放剂咪唑烷基脲以及k3edta和甘氨酸。[0137]在第0天和第7天，将未经保存处理的和含有化学物质的合并标本的每份4.5ml等分试样在室温下以3,800g离心20分钟。在离心后，从每个标本中回收4.0ml上清液，并在-80℃下储存。为了评定在有和没有稳定组合物的情况下的无细胞dna的稳定性，使用qiaamp循环核酸试剂盒(凯杰，参见材料和方法)对来自未经保存处理的和含有不同化学成分的第0天和第7天的尿液样本的冷冻上清液进行无细胞dna提取。来自每个标本的两微升纯化无细胞dna用作β-珠蛋白qpcr分析的模板(参见材料和方法)。[0138]图4(a和b)示出了β-珠蛋白dna的δct的急剧增加，表明在未经保存处理的标本在室温下储存7天后，人类无细胞dna含量急剧降低(na t7；图4a和4b)。将合并尿液标本中的一个用于研究不同醇(乙醇和甲醇)对本组合物的稳定效率的影响。图4a表明，本组合物中的乙醇也可以用甲醇代替；然而，与乙醇相比，甲醇在所使用的浓度下是有毒的，并且对于家庭收集来说不太理想。此外，据发现，在室温下7天后，含本组合物(chem f，ph 4.7至5.0)的尿液标本中的人类无细胞dna与被称为“无细胞dna尿液保存剂”的施特雷克的尿液固定剂相似(图4b)，表明本组合物与这种参考组合物一样有效，如本组合物和参考组合物的相似δct值所示。乙醇、缓冲盐(例如，乙酸钠)、糖、乙醇及糖和乙醇及盐的去除以及ph升高(≥5.5)使化学物质f组合物在保存无细胞dna含量方面的有效性降低，如δct值的降低所指示。这种δct的降低表明，与含乙醇的化学物质f的完全组合物(ph 4.7至5.0)相比，在不同的化学物质迭代中，尿液样本中的无细胞dna含量的增加在室温下保持7天(图4b)。最后，数据表明本组合物的理想ph范围是4.7至5.0(+/-0.2)。[0139]表3：与尿液混合前的储备溶液的组合物。[0140][0141][0142]表4：尿液样本中的不同迭代的加入。[0143] 尿液(ml)储备溶液(ml)95％乙醇/甲醇(ml)chem f(ph 4.7至8.5)1131chem f，不含果糖1131chem f，不含缓冲液1131chem f，不含乙醇123-chem f，不含果糖及乙醇123-chem f，不含缓冲液及乙醇123-chem f，含甲醇1131[0144]表5：与尿液混合后的最终组合物。[0145]组合物chem fchem f，不含果糖chem f，不含缓冲液乙酸钠350mm350mm-硼酸1％1％1％cdta23.8mm23.8mm23.8mm果糖9％-9％[0146]实例5：用于在室温下保存尿液中的核酸的稳定组合物。[0147]总共十一名健康的供体(男性和女性)提供了40至60ml晨尿首段(fmfv)尿液标本。将标本置于冰袋上运输到实验室，在实验室中，i)在不存在稳定组合物(未经保存处理)的情况下储存标本，每份20ml，并且2)将每份12ml的尿液标本与稳定溶液[4ml储备溶液；表6(i)和4ml 95％乙醇]混合。在本实例中，与尿液混合后的稳定溶液的最终组合物在下面描述[参见表6(ii)]。两种类型的标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。在第0天和第7天，将未经保存处理的和含稳定溶液的标本的每份4.5ml等分试样在室温下以3,800g离心20分钟。在离心后，从每个标本中回收4.0ml上清液，并使用qiaamp循环核酸试剂盒(凯杰，参见材料和方法)提取无细胞dna。来自每个标本的两微升纯化cfdna用作β-珠蛋白qpcr分析的模板(参见材料和方法)。图5a示出了β-珠蛋白dna的δct的急剧增加，表明在未经保存处理的标本在室温下储存7天后，人类无细胞dna含量急剧降低(图5a)。相比之下，β-珠蛋白dna水平的δct没有显著变化，表明在室温下7天后的含有chem f的标本中的人类无细胞dna水平没有变化[图5a(i)]。此外，在收集时(第0天)的加入化学物质的尿液样本中的无细胞dna含量相对于未经保存处理的(na)样本没有显著变化[图5a(ii)]。使用hsd5000胶条(安捷伦科技)的代表性tapestation图谱分析(图5b)表明，在未经保存处理的第0天的等分试样、化学物质f(chem f)第0天和第7天的等分试样中存在无细胞核酸；无细胞核酸在未经保存处理的第7天的等分试样中降解。[0148]在另一个实验设置中，合并来自男性和女性健康供体的尿液样本以产生男性和女性合并尿液标本。将每个样本的等分试样在以下条件下储存：1)在不存在稳定组合物(未经保存处理)的条件下，2)以1:0.43的比例与储备溶液[表7(i)]混合，和3)与诺根(norgen)尿液收集和保存管(目录号18111)混合。在本实例中，与尿液混合后的稳定溶液“化学物质f(chem f)”的最终组合物在下面描述[参见表7(ii)]。所有标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。在第0天和第7天，将未经保存处理的和含有稳定溶液的尿液标本的每份2.5ml等分试样在室温下以3,000g离心10分钟，随后使用0.8μm注射器过滤器(minisart目录号16592，或-aa，目录号slaa033sb)。在离心后，从每个标本中回收2.0ml上清液，并使用qiaamp循环核酸试剂盒(凯杰，参见材料和方法)提取无细胞dna(cfdna)。图5c(i)示出了β-珠蛋白dna的δct的急剧增加，表明在未经保存处理的标本在室温下储存7天后，人类无细胞dna含量急剧降低[图5c(i)]。相比之下，β-珠蛋白dna水平的δct没有显著变化，表明在室温下7天后的含有化学物质f(chem f)的标本中的人类无细胞dna水平没有变化[图5c(i)]。另一方面，含有诺根尿液保存剂的样本表现出β-珠蛋白dna的δct的显著增加，表明在标本在室温下储存7天后，人类无细胞dna含量急剧降低[图5c(i)]。此外，在收集时(第0天)的加入化学物质的尿液样本中的无细胞dna含量相对于未经保存处理的(na)样本没有显著变化[图5c(ii)]。[0149]在另一个实验设置中，将使用colli-装置(诺沃桑尼斯)收集的来自健康男性和女性供体的首段尿液样本合并以分别产生男性和女性合并尿液标本。将每个标本的等分试样在以下条件下储存：1)在不存在稳定组合物(未经保存处理)的条件下，2)以1:0.43的比例与储备溶液(表7i)混合，和3)与诺根尿液收集和保存管(诺根生物科技；目录号18111)混合。在本实例中，与尿液混合后的稳定溶液的最终组合物在下面描述(参见表7ii)。所有标本在室温(23±3℃)下储存至少14天。在第0天和第14天，将未经保存处理的和含有稳定溶液的尿液标本的每份2.5ml等分试样在室温下以3,000g离心10分钟，随后使用0.8μm注射器过滤器(minisart目录号16592，或-aa，目录号slaa033sb)。在离心后，从每个标本中回收2.0ml上清液，并使用qiaamp循环核酸试剂盒(凯杰，参见材料和方法)提取无细胞dna(cfdna)。图5d(i)和5e(i)示出了β-珠蛋白dna的δct的急剧增加，表明在未经保存处理的标本在室温下储存14天后，人类无细胞dna含量急剧降低。相比之下，β-珠蛋白dna水平的δct没有显著变化，表明在室温下14天后的含有chem f的标本中的人类无细胞dna水平没有变化[图5d(i)、5e(i)]。另一方面，含有诺根尿液保存剂的样本表现出β-珠蛋白的δct的降低[图5d(i)]或β-珠蛋白dna的δct的增加[图5e(i)]，表明在室温下储存14天时，女性和男性尿液标本中的人类无细胞dna含量分别增加或降低。此外，与加入时(第0天)的chem f样本相比，含有诺根尿液保存剂的女性尿液样本的中性表现出了变化[图5d(ii)]。[0150]表6(i)：与尿液混合前的储备溶液的组合物。[0151]组合物储备溶液乙酸钠1750mm硼酸5％cdta119mm果糖45％ph4.7至5.0[0152]表6(ii)：与尿液混合后的稳定溶液的最终组合物。[0153]组合物稳定溶液(chem f)乙酸钠350mm硼酸1％cdta23.8mm果糖9％乙醇19％[0154]表7(i)：与尿液混合前的储备溶液的组合物。[0155]组合物储备溶液乙酸钠750mm硼酸2.2％cdta50mm果糖20％乙醇23％ph5.0至5.2[0156]表7(ii)：与尿液混合后的稳定溶液的最终组合物。[0157][0158][0159]实例6：稳定组合物在室温下保持前列腺癌细胞的完整性7天。[0160]来自男性供体的尿液可能含有脱落的前列腺上皮细胞，这是上皮细胞在正常周转期间从前列腺脱落的结果。此外，还可以通过进行前列腺按摩对前列腺进行物理操纵来增加这种向尿液中的分泌，特别是在前列腺癌患者中。因此，为了测试含有稳定溶液的尿液样本中的细胞的稳定性和完整性，前列腺癌细胞被用作感兴趣的细胞类型之一。[0161]在存在稳定组合物化学物质f的情况下，使用无细胞dna含量随时间的变化来测量细胞完整性。在一个实验设置[实例6(i)]中，将来自3名健康男性和3名女性供体的晨尿首段尿液(fmfv)标本合并以产生一个女性合并(fp)和一个男性合并(mp)尿液标本。除了男性尿液之外，还将女性尿液样本包含在这项研究中，以测试癌细胞在更浓缩、含高生物量的尿液基质中的稳定性。将合并标本在室温下以3,000g离心10至20分钟，随后用0.2微米过滤器过滤所得上清液。将这些预澄清无细胞尿液标本等分，然后添加前列腺癌细胞(lncap克隆fgc；atcc crl-1740tm)。[0162]为了测试化学物质f对所添加的前列腺癌细胞的稳定性的浓度依赖性影响，加入不同量(ml)的储备溶液(参见表8)和固定量的95％乙醇，以获得在与含有所添加的前列腺癌细胞的预澄清尿液混合后的化学物质f中的各种组分的不同最终浓度(参见表9)。如表10中所述，将储备溶液和乙醇与含有所添加的前列腺癌细胞的预澄清尿液混合。[0163]在另一个实验设置[实例(6ii)]中，将来自三名健康女性的晨尿首段尿液(fmfv)标本合并以产生一个女性合并(fp)尿液标本。将合并标本在室温下以3,000g离心10至20分钟，随后用0.2微米过滤器过滤所得上清液。将这些预澄清无细胞尿液标本等分，然后添加前列腺癌细胞(lncap克隆fgc；atcc crl-1740tm)。在本实验设置中，95％乙醇的量(ml)也随着储备溶液的量(ml)(表8)的变化而变化，以获得在与含有所添加的前列腺癌细胞的预澄清尿液混合后的化学物质f中的组分的不同最终浓度，如表11中所指定。如表12中所述，将储备溶液和乙醇量与含有所添加的前列腺癌细胞的预澄清尿液混合。[0164]在两个实验设置中，将标本与组合物一起孵育30至60分钟(第0天)，或在使用qiaamp循环核酸试剂盒(凯杰，参见材料和方法)进行无细胞dna提取之前7天执行此操作。使用β-珠蛋白qpcr测定对所提取的人类无细胞dna进行定量(图6(i)(a和b)和图6(ii)a；参见材料和方法)，并相对于第0天的未经保存处理的尿液(na)归一化。[0165]图6(i)表明，在存在含相对恒定量的乙醇的化学物质f的情况下，所添加的人类前列腺细胞没有以浓度依赖方式将基因组dna泄漏到上清液中。与0.5x和0.8x化学物质f的无显著变化相比，不加入化学物质f(na)导致δct显著增加，从而证明男性和女性合并标本中的无细胞dna含量降低[图6(i)a和b]。另一方面，0.25x浓度表现出mp尿液样本中的δct降低(意味着由于细胞稳定性受损导致基因组dna泄漏而引起cfdna含量增加)或fp尿液样本中的δct增加(意味着由于化学稳定性受损导致更多cfdna降解而引起cfdna含量降低)。这种差异可能取决于尿液基质。由于女性尿液样本中存在高生物量，0.25x稀释浓度的组分无法抑制尿液dna酶对无细胞dna的降解，因此降解速率快于保存速率，从而导致总cfdna含量损失。另一方面，由于男性尿液基质含有低生物量，0.25x浓度的化学物质组分仍可以抑制尿液dna酶对无细胞dna的降解，因此保存速率快于降解速率，从而导致无细胞dna含量的总体增加。总的来说，在fp和mp尿液样本中，化学物质f对无细胞dna图谱和细胞稳定性有浓度依赖性影响。fp标本的代表性tapestation图谱分析(图6(i)c)也示出了相较于0.8x和0.5x稀释的化学物质f(图6(i)c)的第0天(图6(i)c中的黑色迹线)和第7天(图6(i)c中的灰色迹线)之间的在不存在化学物质f(na)和0.25x化学物质f的情况下的无细胞核酸图谱的显著差异。[0166]图6(ii)a还表明，在存在含不同量的乙醇的化学物质f的情况下，所添加的前列腺癌细胞没有以浓度依赖方式将基因组dna泄漏到上清液中，其中1x最有效，而0.25x最无效。0.25x化学物质f导致δct的初始下降，意味着第0天cfdna含量增加，随后δct增加，表明第7天无细胞dna含量减少(图6(ii)a)。β-珠蛋白qpcr测定结果(图6(ii)a)得到β-珠蛋白微滴式数字pcr测定(图6(ii)b)的进一步证实，所述β-珠蛋白微滴式数字pcr测定还揭示，1x化学物质f溶液保持了每单位体积β-珠蛋白基因的拷贝数，而0.25x化学物质f导致在第0天的初始增加，随后在室温下在加标尿液标本中7天后每单位体积β-珠蛋白基因的拷贝数显著减少(图6(ii)b)。总的来说，数据表明，本发明的组合物在室温下以浓度依赖方式保持前列腺癌细胞的完整性至少7天。[0167]表8：储备溶液的组合物[0168][0169][0170]表9：与添加前列腺癌细胞的预澄清尿液混合后的0.8x、0.5x和0.25x化学物质f的最终组合物。[0171]组合物0.8x化学物质f0.5x化学物质f0.25x化学物质f乙酸钠280mm175mm87.5mm硼酸0.8％0.5％0.25％cdta19mm11.9mm5.95mm果糖7.2％4.5％2.25％乙醇13.2％13.7％14.1％[0172]表10：加入到添加前列腺癌细胞的预澄清尿液中的储备溶液和乙醇的量。fixed,paraffin-embedded tissues–which methods are useful when？)》《公共科学图书馆·综合(plos one)》2(6):e537.doi:10.1371/journal.pone.0000537；wong sq、li j、tan ay-c、vedururu r、pang j-mb、do h、ellul j、doig k、bell a、macarthur ga、fox sb、thomas dm、fellowes a、parisot jp、dobrovic a(2014)《通过大规模平行测序检测热点区域突变的福尔马林固定肿瘤前瞻性系列中的序列伪影(sequence artifacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing)》.《bmc医学基因组学(bmc medical genomics)》7:23.doi:10.1186/1755-8794-7-23)。具体而言，这种对dna的化学损伤降低了taq dna聚合酶保真度和pcr扩增效率(sikorsky ja、primerano da、fenger tw、denvir j(2007)《dna损伤降低了taq dna聚合酶保真度和pcr扩增效率(dna damage reduces taq dna polymerase fidelity and pcr amplification efficiency)》.《生物化学和生物物理研究通讯(biochem biophys res commun)》355(2):431-437)。因此，福尔马林/甲醛基固定剂对于分子分析并不理想。[0181]在本实例中，与施特雷克的无细胞dna尿液保存剂中的甲醛释放保存剂相比(如实例4中所述)，在存在本保存剂的情况下，评定添加到尿液样本中的分离白血细胞的细胞稳定性。在红血细胞的选择性裂解后，由1ml全血制备白血细胞。将经沉淀和洗涤的白血细胞添加到尿液样本中，并且使用cfdna含量来测量白血细胞的稳定性/完整性。将来自女性和男性供体的fmfv尿液样本合并在一起，以分别产生两个女性合并和两个男性合并尿液样本。通过以3,000g离心10至20分钟，随后用0.2微米过滤器过滤上清液，对样本进行“预澄清”。将预澄清尿液样本等分，并添加白血细胞，随后以如表13(参见下文)中提及的最终浓度加入本化学物质或施特雷克的无细胞dna尿液保存剂。表15(参见下文)中描述了加入到添加有核白血细胞的预澄清尿液样本中的储备溶液(表14)和乙醇的量。将样本在室温下孵育30至60分钟(第0天)，或在根据制造商的方案使用qiaamp循环核酸提取试剂盒进行cfdna提取之前7天执行此操作。使用β-珠蛋白qpcr测定对所提取的cfdna进行定量(参见材料和方法)。[0182]数据(参见图7)表明，在存在本发明的组合物化学物质f的情况下，在室温下7天后，所添加的白血细胞没有将基因组dna泄漏到上清液中，其中δct中值几乎为零，表明随着时间的推移保存了cfdna并保留了细胞稳定性和完整性。就在室温下稳定cfdna而言，本发明的组合物在功能上等同于施特雷克的甲醛释放化学物质，而没有交联dna的风险。[0183]表13：与添加有核白血细胞的尿液混合后的本组合物的最终浓度。[0184]组合物稳定溶液(chem f)乙酸钠350mm硼酸1％cdta23.8mm果糖9％乙醇11.875％[0185]表14：储备溶液的组合物[0186]组合物储备溶液乙酸钠1750mm硼酸5％cdta119mm果糖45％ph4.7至5.0[0187]表15：加入到添加有核白血细胞的预澄清尿液中的储备溶液和乙醇的量。[0188][0189]实例8：本组合物在室温下在女性和男性合并尿液样本中保持dna甲基化状态7天。[0190]dna甲基化是将甲基加入到dna分子上的过程，是细胞用来控制基因表达的几种表观遗传机制之一。它在如基因表达、胚胎发育、细胞增殖、分化和染色体稳定性等许多生物学过程中起着关键作用。异常的dna甲基化通常与dna稳态的丧失和基因组不稳定性相关联，导致如癌症等疾病的发展(y li、to tollefsbol(2011)《dna甲基化检测：亚硫酸氢盐基因组测序分析(dna methylation detection:bisulfite genomic sequencing analysis)》.《分子生物学方法(methods mol biol)》791:11-21)。[0191]在涉及dna甲基化作为表观遗传生物标志物的研究中，理想的尿液保存剂溶液必须保持dna的甲基化状态。因此，为了检查化学物质f对dna甲基化状态的影响，使用含有25个ccgg位点的pgl3-碱性质粒进行了体外dna甲基化测定。所述测定涉及如材料和方法部分中描述的以下步骤。1)质粒的体外甲基化，随后使用限制性核酸内切酶消化确认甲基化(图8a)。2)对照1x te缓冲液或化学物质f(1x)中孵育的甲基化质粒的亚硫酸氢盐处理(参见以下表16)，随后使用如材料和方法部分中描述的引物进行甲基化质粒的纯化和pcr扩增。加入到尿液样本中的储备溶液(表17)和95％乙醇的量在表18中描述。1x te缓冲液以及化学物质f溶液(图8b和8c)中孵育的甲基化质粒的～278个碱基对pcr产物的存在，表明用化学物质f处理的女性合并(fp)和男性合并(mp)尿液样本中的dna的甲基化状态在室温下保持了7天。[0192]表16：与尿液混合后的组合物的最终浓度。[0193]组合物化学物质f乙酸钠350mm硼酸1％cdta23.8mm果糖9％乙醇19％[0194]表17：储备溶液：[0195][0196][0197]表18：[0198]与尿液混合后的最终浓度储备溶液(μl)95％乙醇(μl)添加甲基化质粒的尿液(μl)1x chem f101030[0199]实例9：在室温下储存7天后，本发明的组合物在晨尿首段尿液样本中保留了人类乳头瘤病毒(hpv)。[0200]宫颈癌由某些类型的生殖器hpv的性获得性感染引起，根据其与宫颈癌的相关性将hpv分为高风险和低风险(n、bosch fx、de sanjose s、herrero r、castellsaque x、shah kv、snijders pj、meijer cj(2003)《与宫颈癌相关联的人类乳头瘤病毒类型的流行病学分类(epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer)》.《新英格兰医学杂志(n engl j med)》348(6):518-527.doi:10.1056/nejmoa021641)。hpv16、18、31、33、35、45、52、58、39、51、56和59被归类为高风险hpv基因型(bouvard v、baan r、straif k、grosse y、secretan b、el ghissassi f、benbrahim-tallaa l、guha n、freeman c、galichet l、cogliano v(2009)《人类致癌物评论b辑：生物试剂(a review of human carcinogens-part b:biological agents)》.《柳叶刀·肿瘤学(the lancet oncology)》10:321-322)，根据who，其中两种hpv类型(16和18)是宫颈癌和癌前宫颈病变的主要原因(70％)。[0201]基于有关hpv检测的文献，尿液的无创性为宫颈标本中的hpv检测提供了一种简单可行的替代方案(vorsters、p van damme、g clifford(2014)《hpv的尿检：使用首段尿的根本原因(urine testing for hpv:rationale for using first void)》.《英国医学杂志(bmj)》349:g6252；bernal,s.等人,《用尿液和宫颈样本检测人类乳头瘤病毒(hpv)与cobas 4800hpv测试的比较(comparison of urine and cervical samples for detecting human papillomavirus(hpv)with the cobas 4800hpv test)》,《临床病毒学杂志(journal of clinical virology)》61(2014)548-552；enerly,e.等人,《尿液样本中的人类乳头瘤病毒的患病率的监测：综述(monitoring human papillomavirus prevalence in urine samples:a review)》,《临床流行病学(clinical epidemiology)》2013:5 67–79)。在本研究中，评估了本组合物对添加外源hpv环状dna(hpv 16)的尿液的稳定性的影响。与内源性病毒颗粒的混合群体相比，本系统提出了最具挑战性的情形(未受保护的环状dna漂浮在尿液空间/基质中)，所述内源性病毒颗粒的混合群体既以受保护的状态(宫颈细胞内和/或被宿主蛋白覆盖的颗粒)，也以未受保护的状态存在于hpv16感染患者的尿液样本中。[0202]健康的男性和女性供体提供晨尿首段(fmfv)尿液标本，这些标本置于冰袋上运输到实验室，并合并在一起以产生两个男性合并和两个女性合并尿液样本。在有和没有本发明的组合物化学物质f(ph 4.7至5.0)的情况下，将纯化hpv16质粒dna(参见材料和方法)以1至10ng/ml的浓度添加到大约1ml合并fmfv尿液样本中，并在室温下储存至多7天。与尿液样本组合后的稳定组合物“化学物质f(chem f)”中的各种组分的最终浓度在表19(下文)中描述。在第0天和第7天，对添加hpv16质粒的尿液样本的每份200μl等分试样进行处理，以根noerholm、s belzer、j skog、mw kattan、a partin、g andriole、g brown、jt wei、im thompson、p cvarroll(2016)《一种在初始活检时预测高级别前列腺癌的新型尿外泌体基因表达测定(a novel urine exosome gene expression assay to predict high-grade prostate cancer at initial biopsy)》.《美国医学会杂志肿瘤学(jama oncol)》2(7):882-889.doi:10.1001/jamaoncol.2016.0097)。在样本收集和运输到实验室时的微生物增殖的可能性以及宿主细胞和细胞外囊泡(ev)的不稳定性质推动了对家庭采样的尿液样本的稳定的需求，因为对于大规模募集而言，多站点收集和诊所收集的负担越来越高，并导致收集和处理之间的时间存在可变性。因此，针对家庭取样的尿液稳定的发展为待用于液体活检分析的各种尿液源性生物标志物(例如，前列腺癌中的尿ev rna)开辟了新的应用。[0209]在一个实验设置中，在标准尿液收集杯中从健康的男性和女性供体收集晨尿首段尿液样本。将标本置于冰袋上运输到实验室，在实验室中，将样本合并在一起，以形成合并尿液标本(mp，男性合并；fp，女性合并)。i)在不存在稳定组合物(未经保存处理)的情况下储存30ml合并尿液，并且2)将24ml合并尿液标本与稳定组合物[4ml储备溶液(表20)和2ml 95％乙醇]混合并储存。储备溶液的组合物在表20中描述。两种类型的标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。与尿液混合后的稳定溶液“化学物质f(chem f)”的最终组合物在表21中描述。在第0天和第7天，将未经保存处理的和含有chem f的标本的每份10ml等分试样在室温下以3,000g离心10分钟，随后进行0.8μm过滤。用exorneasy maxi试剂盒(凯杰，参见材料和方法)使用离心和过滤后的从每个标本中回收的预澄清上清液进行ev rna提取。使用2100安捷伦生物分析仪和/或ribogreen定量测量所提取的rna样本的浓度。使用m-mlv逆转录试剂盒制备cdna，并使用β-肌动蛋白(actb)taqman测定进行qpcr(参见材料和方法)。对于cdna合成而言，针对给定尿液样本，使用等量(ng)的未经保存处理和稳定条件的总提取rna。[0210]在另一个实验设置中，男性和女性健康供体使用colli-首段尿液收集装置(诺沃桑尼斯)提供了随机(午尿)首段尿液样本。将标本置于冰袋上运输到实验室，在实验室中，将样本合并在一起，以形成合并尿液标本(mp，男性合并；fp，女性合并)。i)在不存在稳定组合物(未经保存处理)的情况下储存40ml合并尿液，并且2)将28ml合并尿液标本与12ml化学物质f(chem f)稳定组合物混合并储存。稳定溶液的组合物在表22i中描述。两种类型的标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。与尿液混合后的稳定溶液“chem f”的最终组合物在表22ii中描述。在第0天和第7天，将未经保存处理的和含有chem f的标本的每份17ml等分试样在室温下以3,000g离心10分钟，随后进行0.8μm过滤。在离心和过滤后，从每个标本中回收16ml预澄清上清液，并使用exorneasy maxi试剂盒(凯杰，参见材料和方法)提取ev rna。使用2100安捷伦生物分析仪和/或ribogreen定量测量所提取的rna样本的浓度(参见材料和方法)。所提取的ev rna的图谱也在2100安捷伦生物分析仪上测定。对于cdna合成而言，针对给定尿液样本，使用等量(ng)的未经保存处理和稳定条件的总提取rna。使用m-mlv逆转录试剂盒制备cdna，并使用β-肌动蛋白taqman测定进行qpcr(参见材料和方法)。β-肌动蛋白已被认为是使用qpcr测定进行外泌体mrna定量的管家基因(h jiang、z li、x li、j xia(2015)《肿瘤细胞源性外泌体在多器官肿瘤发生中对信使rna进行的细胞间转移(intercellular transfer of messenger rnas in multiorgan tumorigenesis by tumor cell-derived exosomes)》.《分子医学报告(mol med rep)》11:4657-4663.doi:10.3892/mmr.2015.3312；kc miranda、dt bond、m mckee、j skog、tg paunescu、n da silva、d brown、lm russo(2010)《尿外泌体/微囊泡内的核酸是肾脏疾病的潜在生物标志物(nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease)》.《国际肾脏病学(kidney int)》78(2):191-199.doi:10.1038/ki.2010.106；s haque、sr vaiselbuh(2018)《外泌体分子诊断学：通过两步聚合酶链反应将外泌体直接转化为cdna用于基因扩增(exosomes molecular diagnostics:direct conversion of exosomes into the cdna for gene amplification by two-step polymerase chain reaction)》.《生物方法杂志(j biol methods)》5(3):e96.doi:10.14440/jbm.2018.249；l dong、w lin、p qi、m xu、z wu、s ni、d haung、w-w weng、c tan、w sheng、x zhou、x du(2016)《血清细胞外囊泡中的循环长rna：它们的表征及其作为结直肠癌诊断生物标志物的潜在应用(circulating long rnas in serum extracellular vesicles:their characterization and potential application as biomarkers for diagnosis of colorectal cancer)》.《癌症流行病学、生物标志物和预防(cancer epidemiol biomarkers prev)》25(7):1158-1166.doi:10.1158/1055-9965.epi-16-0006)。[0211]来自两个实验设置的总共7个样本(3个女性合并和4个男性合并尿液样本)的总体数据被合并并呈现在图10a中。图10a示出了在rt下储存7天后的未经保存处理的和含有稳定溶液的尿液标本中的β-肌动蛋白(actb)rna含量的代表[ct(t7)-ct(t0)]的δct。β-肌动蛋白(actb)rna的δct的增加(δct中值≥+2；图10a)表明了在室温下储存7天的未经保存处理的标本中的ev rna含量的损失。然而，含有chem f的尿液标本中的β-肌动蛋白rna的δct变化不明显(δct中值几乎为0；图10a)，表明在室温下7天后的ev rna含量的稳定。此外，在收集时(第0天)的加入化学物质的尿液样本中的ev rna含量相对于未经保存处理的(na)样本没有显著变化[图10a(ii)]。图10b示出了第0天和第7天的来自未经保存处理的和含有chem f的尿液标本的ev rna的代表性电泳图迹线。电泳图迹线清楚地表明了第7天的未经保存处理的尿液标本中的ev rna图谱的显著变化，这不同于含有chem f的第0天和第7天的标本，后者表现出与未经保存处理的第0天的标本相似的ev rna图谱。[0212]在另一个实验设置中，男性和女性健康供体使用colli-首段尿液收集装置(诺沃桑尼斯)提供了随机(午尿)首段尿液样本。将标本置于冰袋上运输到实验室，在实验室中，将样本合并在一起，以形成合并尿液标本(mp，男性合并；fp，女性合并)。将合并尿液的等分试样在以下条件下储存：1)在不存在稳定组合物(未经保存处理)的情况下，2)以尿液/化学物质比1:0.43与含有不同的糖的储备溶液[表22(i)]混合并储存。所有标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。与尿液混合后的稳定溶液的最终组合物在表22(iv)中描述。在第0天和第7天，将未经保存处理的、含有chem f和含有施特雷克保存剂的尿液标本的每份8.5ml等分试样在室温下以3,000g离心10分钟，随后进行0.8μm过滤(minisart目录号16592，或目录号16592，或-aa，目录号slaa033sb)。在离心和过滤后，从每个样本中回收8ml预澄清上清液，并使用超滤提取ev rna(参见材料和方法中的ev rna提取)。使用ribogreen定量测量所提取的rna样本的浓度(参见材料和方法)。对于cdna合成而言，针对给定尿液样本，使用等量(ng)的未经保存处理和稳定条件的总提取rna。使用m-mlv逆转录试剂盒制备cdna，并使用β-肌动蛋白taqman测定进行qpcr(参见材料和方法)。[0213]图10c(i)示出了在rt下储存7天后的未经保存处理的和含有稳定溶液的尿液标本中的β-肌动蛋白(actb)rna含量的代表[ct(t7)-ct(t0)]的δctδct。β-肌动蛋白(actb)rna的δct的增加[δct中值》+3.5，图10c(i)]表明了室温下储存7天的未经保存处理的标本中的ev rna含量的损失。含有chem f和chem g的标本表现出β-肌动蛋白rna的δct中值分别为1.5和1.1，表明在室温下7天后的ev rna含量的有效稳定[图10c(i)]。此外，在收集时(第0天)的加入化学物质的尿液样本中的ev rna含量相对于未经保存处理的(na)样本没有显著变化[图10c(ii)]。[0214]在另一个实验设置中，男性和女性健康供体使用colli-首段尿液收集装置(诺沃桑尼斯)提供了随机(午尿)首段尿液样本。将标本置于冰袋上运输到实验室，在实验室中，将样本合并在一起，以形成合并尿液标本(mp，男性合并；fp，女性合并)。将合并尿液的等分试样在以下条件下储存：1)在不存在稳定组合物(na，未经保存处理)的情况下，2)以尿液/化学物质比1:0.43与化学物质f稳定组合物混合，和3)与5ml施特雷克的尿液保存剂(目录号230216)混合并储存。稳定溶液的组合物在表23(i)中描述。两种类型的标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。与尿液混合后的稳定溶液的最终组合物在表23(ii)中描述。在第0天和第7天，将未经保存处理的、含有chem f和含有施特雷克保存剂的尿液标本的每份11ml等分试样在室温下以3,000g离心10分钟，随后进行0.8μm过滤。在离心和过滤后，从每个标本中回收10ml预澄清上清液，并使用exorneasy maxi试剂盒(凯杰，参见材料和方法)提取ev rna。使用ribogreen定量测量所提取的rna样本的浓度(参见材料和方法)。对于cdna合成而言，针对给定尿液样本，使用等量(ng)的未经保存处理和稳定条件的总提取rna。使用m-mlv逆转录试剂盒制备cdna，并使用β-肌动蛋白taqman测定进行qpcr(参见材料和方法)。[0215]图10d(i)示出了在rt下储存7天后的未经保存处理的和含有稳定溶液的尿液标本中的β-肌动蛋白(actb)rna含量的代表[ct(t7)-ct(t0)]的δct。β-肌动蛋白(actb)rna的δct的增加[δct中值≥+3.5，图10c(i)]表明了室温下储存7天的未经保存处理的标本中的ev rna含量的损失。含有chem f的标本表现出β-肌动蛋白rna的δct中值为+1.1，表明在室温下7天后的ev rna含量的有效稳定。另一方面，尽管在7天稳定性时间点(t7)表现出β-肌动蛋白rna的δct中值为+1.8，但含有施特雷克保存剂的尿液标本在第0天时间点表现出ev rna的显著损失(δct中值为+3.3)，表明ev rna稳定性和含量的总体损失[图10d(ii)]。[0216]表20：与尿液混合前的本发明组合物。[0217]组合物储备溶液乙酸钠1750mm硼酸5％cdta119mm果糖45％ph4.7至5.0[0218]表21：与尿液混合后的本发明的最终组合物。[0219]组合物稳定溶液(chem f)乙酸钠233.3mm硼酸0.67％cdta15.9mm果糖6.0％乙醇6.3％[0220]表22(i)：与尿液混合前的本发明的组合物。[0221]组合物储备溶液乙酸钠771.2mm硼酸2.2％cdta52.4mm果糖19.8％乙醇22.4％ph5.0[0222]表22(ii)：与尿液混合后的本发明的最终组合物。[0223]组合物稳定溶液(chem f)乙酸钠231.4mm硼酸0.67％cdta15.7mm果糖5.9％乙醇6.7％[0224]表22(iii)：与尿液混合前的本发明的组合物。[0225][0226]表22(iv)：与尿液混合后的本发明的最终组合物。[0227]组合物稳定溶液(chem f)稳定溶液(chem g)乙酸钠225mm225mm硼酸0.7％0.7％cdta15mm15mm糖6％6％乙醇6.9％6.9％[0228]表23(i)：与尿液混合前的本发明的组合物。[0229]组合物储备溶液乙酸钠750mm硼酸2.2％cdta50mm果糖20％乙醇23％ph5.0至5.2[0230]表23(ii)：与尿液混合后的本发明的最终组合物。[0231]组合物稳定溶液(chem f)乙酸钠225mm硼酸0.7％cdta15mm果糖6％乙醇6.9％[0232]实例11：用于在室温下保存尿液中的无细胞rna(cfrna)的稳定组合物。[0233]男性和女性健康供体使用colli-首段尿液收集装置(诺沃桑尼斯)提供了随机(午尿)首段尿液样本。将标本置于冰袋上运输到实验室，在实验室中，将样本合并在一起，以形成合并尿液标本(mp，男性合并；fp，女性合并)。将合并尿液的等分试样在以下条件下储存：在1)不存在稳定组合物(未经保存处理)的情况下，2)以尿液/化学物质比1:0.43与化学物质f稳定组合物混合并储存。稳定溶液的组合物在表24中描述。两种类型的标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。与尿液混合后的稳定溶液的最终组合物在表25中描述。在第0天和第7天，将未经保存处理的和含有chem f的尿液标本的每份2.5ml等分试样在室温下以3,000g离心10分钟，随后进行0.8μm过滤。在离心和过滤后，从每个标本中回收2ml预澄清上清液，并使用qiaamp循环核酸提取试剂盒(凯杰，参见材料和方法)提取无细胞核酸。对所提取的核酸进行dna酶消化以去除dna污染，以进行总无细胞rna的有效纯化。使用ribogreen定量测量所提取的rna样本的浓度(参见材料和方法)。对于cdna合成而言，针对给定尿液样本，使用等量(ng)的未经保存处理和稳定条件的总提取rna。使用m-mlv逆转录试剂盒制备cdna，并使用β-肌动蛋白taqman测定进行qpcr(参见材料和方法)。[0234]图11(i)示出了在rt下储存7天后的未经保存处理的和含有chem f的尿液标本中的β-肌动蛋白(actb)rna含量的代表[ct(t7)-ct(t0)]的δct。δct中值的增加(+2.5)表明了在未经保存处理的标本在室温下储存7天后，无细胞rna含量减少；然而，相比之下，在室温下7天后的含有化学物质f的标本中的β-肌动蛋白无细胞rna水平的变化较小，如δct中值1.3所示[图11(i)]。此外，在收集时(第0天)的加入化学物质的尿液样本中的无细胞rna含量相对于未经保存处理的(na)样本没有显著变化[图11(ii)]。[0235]表24：储备溶液的组合物[0236]组合物储备溶液乙酸钠750mm硼酸2.2％cdta50mm果糖20％乙醇23％ph4.7至5.0[0237]表25：与尿液混合后的本组合物的最终浓度。[0238]组合物稳定溶液(chem f)乙酸钠225mm硼酸0.7％cdta15mm果糖6％乙醇6.9％[0239]实例12：用于在室温下保存尿液中的尿细胞rna的稳定组合物。[0240]本实例包含两项独立的研究。在第一项研究中，使用colli-首段尿液收集装置(诺沃桑尼斯)收集来自8名男性和8名女性供体的午尿首段尿液样本，并将其合并以形成总共4个合并尿液标本(2个男性(mp)和2个女性(fp))。i)在不存在稳定组合物(未经保存处理)的情况下储存标本，每份40ml，并且ii)将每份28ml的尿液标本与12ml储备溶液混合(表26)。两种类型的标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。与尿液混合后的最终组合物在以下表27中描述。[0241]在第二项研究中，4名健康供体提供了30ml晨尿首段(fmfv)尿液标本，并将他们的尿液样本合并在一起以产生两个合并尿液标本。i)在不存在稳定组合物(未经保存处理，na)的情况下储存标本，每份30ml，并且ii)将每份24ml的尿液标本与4ml储备溶液(表28)和2ml 95％乙醇混合。两种类型的标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。与尿液混合后的稳定溶液“chem f”的最终组合物在以下表29中描述。为了进行比较，将25ml尿液与5ml施特雷克的尿液固定剂(参考组合物)混合，所述固定剂在商业上被称为“无细胞dna尿液保存剂”(目录号230216)，并在室温下储存至少7天。所述参考组合物包括甲醛释放剂咪唑烷基脲以及k3edta和甘氨酸。[0242]在第0天和第7天，将未经保存处理的、含有chem f和含有施特雷克的保存剂的尿液标本的每份15至16ml等分试样在室温下以3,800g离心20分钟。在离心后，从每个标本中回收总细胞沉淀，并根据制造商的方案使用如材料和方法中描述的trizol ls试剂(研究i)或凯杰rneasy plus迷你试剂盒(研究ii)提取尿细胞rna。使用基于β-肌动蛋白(actb)taqman的rt-qpcr实验对所提取的细胞rna进行靶向mrna分析，如所述进行(参见材料和方法)。[0243]来自第一实验设置的总共4个样本(2个女性合并和2个男性合并尿液样本)的总体数据被合并并呈现在图12a中。图12a(i)示出了在rt下储存7天后的未经保存处理的和含有chem f的尿液标本中的β-肌动蛋白(actb)rna含量的代表[ct(t7)-ct(t0)]的δct。细胞β-肌动蛋白(actb)rna含量的δct急剧增加，表明了在室温下储存7天的未经保存处理的标本中的细胞rna含量的显著损失。然而，与未经保存处理的标本相比，含有chem f的标本中的细胞β-肌动蛋白rna的δct显著更低(图12a(i))，这表明了在室温下7天后的含有稳定溶液的尿液标本中的细胞rna稳定性。此外，在收集时(第0天)的加入化学物质的尿液样本中的细胞rna含量相对于未经保存处理的(na)样本没有重大变化[图12a(ii)]。[0244]图12b(i)进一步示出了细胞β-肌动蛋白(actb)rna含量的δct的急剧增加，表明了在室温下储存7天的未经保存处理的以及含有施特雷克的尿液保存剂的标本中的细胞rna含量的显著损失。然而，与未经保存处理的和含有斯特瑞克的保存剂的标本相比，含有chem f的标本中的细胞β-肌动蛋白的δct显著更低[图12b(i)]。此外，当与含有chem f的标本相比时，含有施特雷克的保存剂的标本表现出在收集时(第0天)的加入化学物质的尿液样本中的细胞rna含量相对于未经保存处理的(na)样本的更多变化[图12b(ii)]。总的来说，本数据表明了在室温下7天后的含有本稳定组合物的标本中的细胞rna稳定性。[0245]表26：与尿液混合前的本发明的组合物。[0246]组合物储备溶液乙酸钠771.2mm硼酸2.2％cdta52.4mm果糖19.8％乙醇22.4％ph5.0[0247]表27：与尿液混合后的本发明的最终组合物。[0248]组合物稳定溶液(chem f)乙酸钠231.4mm硼酸0.67％cdta15.7mm果糖5.9％乙醇6.7％[0249]表28：与尿液混合前的本发明的组合物。[0250]组合物储备溶液乙酸钠1750mm硼酸5％cdta119mm果糖45％ph4.7至5.0[0251]表29：与尿液混合后的本发明的最终组合物。[0252][0253][0254]实例13：用于在室温下保存尿液中尿细胞dna的稳定组合物。[0255]在本研究中，使用colli-首段尿液收集装置(诺沃桑尼斯)收集了来自6名男性和6名女性健康供体的午尿首段尿液样本，并将其合并以形成总共4个合并尿液标本[2个男性合并(mp)和2个女性合并(fp)]。i)在不存在稳定组合物(未经保存处理)的情况下储存标本，每份30ml，并且ii)将每份21ml的尿液标本与9ml储备溶液(表30)混合。两种类型的标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。与尿液混合后的最终组合物在以下表31中描述。[0256]在第0天和第7天，将未经保存处理的和含有chem f的标本的每份15ml等分试样在室温下以3000g离心10分钟。在离心后，从每个标本中回收总细胞沉淀，并根据制造商的方案使用qiaamp dna迷你试剂盒(凯杰)提取尿细胞dna。使用基因组dna胶条在安捷伦4200tapestation上评定所提取的细胞dna的图谱。使用所提取的dna来扩增～1kb的pcr产物(gapdh基因)，以如所述测量dna稳定性(参见材料和方法)。[0257]图13a示出了未经保存处理的(na)和含有化学物质f的尿液标本中的第0天和第7天提取的细胞dna的tapestation图谱。在fp样本中，在室温下储存7天的未经保存处理的标本中的高分子量基因组dna有一致的显著损失。在mp未经保存处理的样本中，由于细菌生长，一个合并样本表现出高分子量基因组dna的增加，而第二合并样本表现出在室温下7天后的高分子量基因组dna的显著减少。然而，在室温下7天后，在含有chem f的fp和mp尿液标本中，高分子量基因组dna的图谱得以保留(图13a)；从而表明细胞dna稳定性。接下来，对扩增子大小为～1kb的gapdh基因进行靶向扩增，以确定在第0天和第7天时间点的未经保存处理的和含有chem f的尿液标本中的高分子量dna条带的稳定性。[0258]图13b示出了gapdh pcr扩增的结果。～1kb的产物的存在有力地表明了在室温下储存7天后的含有chem f的fp和mp的尿液标本中的人类细胞dna稳定性。gapdh pcr扩增在未经保存处理的标本中失败，表明缺乏人类细胞dna稳定性。如材料和方法中所述，对从fp和mp标本中提取的dna进行细菌16s qpcr。细菌16s qpcr表明在rt下保存7天的fp和mp未经保存处理的尿液样本中的细菌dna含量的百分比急剧增加；这不同于含有化学物质f(chem f)的标本，后者表现出第7天的细菌dna含量相对于第0天没有显著变化(图13c)。总的来说，数据表明在室温下储存7天后的含有稳定溶液的尿液标本中保存了人类细胞dna并防止了细菌生长。另一方面，在室温下储存7天后，未经保存处理的标本表现出人类细胞dna的完全损失和细菌dna的急剧增加。[0259]表30：与尿液混合前的本发明的组合物。[0260]组合物储备溶液乙酸钠771.2mm硼酸2.2％cdta52.4mm果糖19.8％乙醇22.4％ph5.0[0261]表31：与尿液混合后的本发明的最终组合物。[0262]组合物稳定溶液(chem f)乙酸钠231.4mm硼酸0.67％cdta15.7mm果糖5.9％乙醇6.7％[0263]实例14：用于保存在室温下储存的唾液样本中的无细胞核酸图谱的稳定组合物。[0264]像尿液一样，唾液采样简单、安全、廉价，是家庭收集的理想选择。唾液由各种分子(例如，酶、激素、抗体、粘蛋白、生长因子、核酸、外泌体和抗微生物成分)构成，这些分子从滋养唾液腺的脉管系统中过滤、加工和分泌。这些中的许多通过跨细胞或细胞间途径穿过细胞之间的空间从血液进入唾液。因此，血液中发现的大多数化合物也存在于唾液中。因此，唾液表现出监测健康和疾病的高度潜力(y-h lee和dt wong(2009)《唾液：一种用于疾病的早期检测的新兴生物流体(saliva:an emerging biofluid for early detection of diseases)》.《美国牙科杂志(am j dent)》22(4):241-248；k-a hyun、h gwak、j lee、b kwak、h-i jung(2018)《用于癌症检测的唾液外泌体和无细胞dna(salivary exosome and cell-free dna for cancer detection)》.《微型机械(micromachines)》9:340)。[0265]在本研究中，从6名健康个体收集原始唾液样本，并混合在一起以形成合并唾液样本。i)将7ml合并唾液样本与3ml 1x te缓冲液(赛默飞世尔科技；目录号am9858)(未经保存处理)混合，并且ii)将7ml合并唾液与3ml储备溶液(参见表32)混合。将te缓冲液加入到未经保存处理的标本中，以克服唾液的粘液性质，从而有效分离细胞外和细胞区室。两种类型的标本在室温(23±3℃)下储存至少7天。与唾液混合后的最终组合物在以下表33中描述。[0266]在第0天和第7天，将未经保存处理的和含有化学物质f(chem f)的标本的每份4.5ml等分试样在室温下以3,800g离心20分钟。在离心后，从每个标本中回收4.0ml上清液，并使用qiaamp循环核酸试剂盒(凯杰，参见材料和方法)提取无细胞核酸。使用hs d5000胶条(安捷伦；目录号5067-5592)在安捷伦4200tapestation上评定所提取的无细胞核酸的图谱。图14示出了未经保存处理的(na)和经保存处理的含有chem f的唾液标本中的第0天和第7天提取的无细胞dna的tapestation图谱。tapestation数据(图14)清楚地表明了在室温下7天后的含稳定溶液的唾液样本中的无细胞dna图谱的保存，而与第0天的图谱相比，在室温下7天后的未经保存处理的样本中的无细胞dna图谱有显著变化。[0267]表32：与唾液混合前的本发明的组合物。[0268]组合物储备溶液乙酸钠771.2mm硼酸2.2％cdta52.4mm果糖19.8％乙醇22.4％ph5.0[0269]表33：与唾液混合后的本发明的最终组合物。[0270]组合物稳定溶液(chem f)乙酸钠231.4mm硼酸0.67％cdta15.7mm果糖5.9％乙醇6.7％[0271]本说明书中提及的所有公开案、专利和专利申请案指示本发明所属领域的技术人员的技术水平且通过引用并入本文，其程度如同指示每一个别公开案、专利或专利申请案专门且个别地通过引用并入。[0272]已如此描述了本发明，将显而易见的是，本发明可以多种方式变化。此类变化不应视为脱离本发明的精神和范围，且本领域的技术人员将清楚的是，所有此类修改旨在包含在随附权利要求的范围内。权利要求的范围不应限于为描述而设置的优选实施例，而应被给予与描述整体一致的最广泛的解释。









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