一种低温促生育苗复合菌剂及其制备方法和应用与流程 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及一种低温促生育苗复合菌剂及其制备方法和应用，属于烟草育苗技术领域。背景技术：2.贵州省作为烟草种植产区，温度适合烟草生长。但在育苗期间，贵州大部前期温度偏低，生长缓慢，从出苗到“小十字”长达30天左右，是整个育苗过程生长最慢的一个阶段。低温环境下烟叶生长缓慢，甚至出现冻伤，影响烟草产量与品质。因移栽期时间控制，对烟苗素质和壮苗培育都有较大影响。因此，在育苗阶段，如何提高烟草苗期生长速度、克服早期寒流影响，对贵州烟草生产具有重要意义。3.专利文献(cn111944716b)公开了一种烟草育苗专用复合微生物菌剂及其制备方法和应用，微生物菌剂包括：凝结芽孢杆菌、特基拉芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌，其中凝结芽孢杆菌可以高产iaa促进烟草生长,特基拉芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌可以有效抑制烟草常见的青枯病和黑胫病发生，b06可促进特基拉芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌的抗菌能力，三种微生物配合使用既可以促进烟草生长、提高烟草产量，又可以防病抗病、提升烟叶品质。然而，该方案主要针对常温下的烟草育苗，并不适用于低温下的烟苗促生；此外，该方案每株菌剂用量约为5ml，成本较高，不便于规模化使用。4.专利文献(cn113897326a)公开了一种低温型烟草根系促生微生物功能菌剂，其通过从根系发达的烟草根际土壤进行微生物筛选、扩大培养和复配，获得了一种低温型烟草根系促生微生物功能菌剂，以实现有效提高大田生育早期低温寡照时烟草根系微环境土壤温度，促进烟草根系发育，增加烟草产量与质量，提高土壤中肥料的有效利用率，改善土壤质量。然而，该方案中菌种仅适合在10-14℃生存，无法适应更低的温度；此外，该方案中菌剂采用的是液体菌剂蘸根，这种方法既不利于长期保存运输，又不利于发挥作用，此外施用量也较多，不便于推广应用。技术实现要素：5.基于上述，本发明的目的是提供一种低温促生育苗复合菌剂及其制备方法和应用，能够适应最低5℃左右低温环境的育苗促生抗病，以克服现有技术的不足。6.本发明的技术方案是：7.第一方面，本发明提供一种低温促生育苗复合菌剂，所述复合菌剂由嗜烟碱节杆菌、壁芽孢杆菌、硒单胞菌和解淀粉芽孢杆菌组成，其中，所述嗜烟碱节杆菌为arthrobacter nicotinovorans 112，保藏编号为cgmcc no.16516，所述壁芽孢杆菌为bacillus muralis 114，保藏编号为cgmcc no.16517，所述硒单胞菌为pseudomonas seleniipraecipitans td1，保藏编号为cgmcc no.16518，所述解淀粉芽孢杆菌为bacillus amyloliquefaciens ba-s，保藏编号为cgmcc no.8262，均在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中中心保藏。8.优选的，所述复合菌剂中嗜烟碱节杆菌、壁芽孢杆菌、硒单胞菌和解淀粉芽孢杆菌的有效菌含量比例为(1-9):(1-9):(1-9):(1-9)。9.第二方面，本发明提供一种所述的低温促生育苗复合菌剂的制备方法，首先分别培养四株菌并获得菌体，然后将菌体、保水剂、砻糠混合制备菌剂吸附剂，最后将四种菌剂吸附剂混合均匀即可。10.优选的，将纯化后的四株菌分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以170rpm、30℃振荡培养24h，然后以5％接种率接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以170rpm、30℃振荡培养48h；发酵液6000×g转速下离心10min，收集菌体后用同体积灭菌后的去离子水进行重悬，即得菌体。11.优选的，所述菌剂、保水剂、砻糠以70：1：40体积比均匀混合。12.优选的，所述四种菌剂吸附剂以1：1：1：1体积比均匀混合。13.第三方面，本发明提供一种所述的低温促生育苗复合菌剂在制备成烟草育苗基质添加剂中的应用。14.优选的，所述育苗基质包括珍珠岩、蛭石、发酵谷壳、炭化谷壳、草炭、椰糠和蚓粪，以一定接种量将复合菌剂与育苗基质中的蛭石混合均匀，然后再与其余物质混合，每次以1/10的物质用量逐步混合，工序中共混合10次。15.优选的，所述珍珠岩、蛭石、发酵谷壳、炭化谷壳、草炭、椰糠和蚓粪按30：5：10：10：33：8：4的重量比混合，所述复合菌剂的接种量为所述育苗基质重量的2‰。16.本发明的有益效果是：17.1、本发明通过低温筛选验证得到三株低温促生菌和一株低温青枯病拮抗菌，将其进行复配，能够得到在5-10℃低温环境下使用的育苗促生抗病，不仅能够显著提高烟苗的地下部分干物质积累，以及烟叶pod、ppo、蔗糖酶和淀粉酶的含量，而且能够在苗期根系形成一层“保护鞘”，明显减少病原菌侵染风险。18.2、本发明通过将复合菌剂与育苗基质进行特殊的混合处理，使得菌剂在基质中的分布均匀，能够在保证应用效果的前提下，极大地减小复合菌剂的施用量，施用量仅为0.0125ml/株烟草，按照基质计算为2×106cfu/基质，应用成本得到极大降低，特别适合在烟草育苗时推广应用。19.3、本发明复合菌剂首先由菌体、保水剂、砻糠混合制备菌剂吸附剂，再由四种菌剂吸附剂混合得到，与液体菌剂相比，既能达到延长菌株活性的目的，又可以充分、均匀分散菌剂，便于运输、使用。附图说明20.图1低温促生育苗基质对烟苗及根的促生作用；21.图2gfp标记拮抗菌在根际的定殖，图中左侧为常规基质，右侧为低温促生育苗基质；22.图3平板涂布法筛选低温菌及其菌落形态；23.图4低温条件下菌株的筛选与纯化；24.图5低温促生菌条件下根系扫描；25.图6低温条件下菌株分泌ctk含量；26.图7低温条件下菌株分泌ga含量；27.图8低温条件下菌株分泌iaa含量；28.图9拮抗菌对青枯病和黑胫病的防控作用；29.图10温度对低温促生菌生长的影响；30.图11拮抗菌在保水剂中延长存活。具体实施方式31.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。32.嗜烟碱节杆菌为arthrobacter nicotinovorans 112，保藏编号为cgmcc no.16516；壁芽孢杆菌为bacillus muralis 114，保藏编号为cgmcc no.16517；硒单胞菌为pseudomonas seleniipraecipitans td1，保藏编号为cgmcc no.16518；解淀粉芽孢杆菌为bacillus amyloliquefaciens ba-s，保藏编号为cgmcc no.8262。33.牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，氯化钠5.0g，蛋白胨10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，ph 7.0-7.2，121℃灭菌20min，用于细菌的培养。34.将纯化后的四株菌分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以170rpm、30℃振荡培养24h，然后以5％接种率接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，以170rpm、30℃振荡培养48h；发酵液6000×g转速下离心10min，收集菌体后用同体积灭菌后的去离子水进行重悬；以菌体：保水剂：砻糠＝70：1：40(体积比)均匀混合制备菌剂吸附剂，四种菌剂吸附剂以1：1：1：1体积比混合均匀后备用。本实施例中，所述的保水剂是丙稀盐酸-丙烯酰胺类保水剂(bj2101)，购自北京汉力淼新技术有限公司。35.将上述得到的复合菌剂与育苗基质混合搅拌，如表1，其中育苗基质由珍珠岩、蛭石、发酵谷壳、炭化谷壳、草炭、椰糠、蚓粪按30：5：10：10：33：8：4的重量比配置而成。具体混合方法如下：以2‰接种量(质量比)将复合菌剂与育苗基质中的蛭石混合均匀，然后再与其余物质混合，每次以1/10的物质用量逐步混合，工序中共混合10次，以保证菌剂在基质中的分布均匀，保障使用效果。36.表1低温促生育苗基质配方[0037][0038]漂浮育苗试验于2021年在贵州贵阳开阳育苗工场开展，采用随机区组试验设计，以上述复合菌剂与育苗基质的混合作为处理组，以不加复合菌剂作为对照组。按照菌剂2‰接种量(质量比)，每株烟苗混合菌剂的接种为0.0125ml,接种量为2×106cfu/基质。育苗期主要从1月中下旬开始至4月中旬。通过统计气温、不同生育期烟苗干重、不同处理移栽前烟苗农艺性状、不同处理移栽前根系扫描和根系活力、不同处理移栽前烟苗酶活性等指标，对方法效果进行评价。[0039]1、气温。经统计，试验地2021年育苗时1月中下旬的平均温度为5.0℃，2月平均温度为9.3℃，3月平均温度为12.0℃，4月平均温度为11.6℃。常规育苗基质和低温促生育苗基质的出苗时间都为15天，出苗率在98％-100％，出苗率无差异。[0040]2、不同生育期烟苗干重。从表2中可以看出，在前期温度较低情况下(小十字与大十字期)，低温促生育苗基质对于地上部和根部都有显著的促生作用，但是到后期温度逐渐上升后，低温促生育苗基质对地上部的生长促进作用不再明显，与对照间的地上部干重无显著差异，低温促生育苗基质对烟苗及根的促生作用如图1所示。[0041]表2不同生育期烟苗干重[0042][0043]3、不同处理移栽前烟苗农艺性状。从表3中看出，地上部的生长表现与对照无显著差异，但是地下部干物质积累可以提高8.85％，显著高于对照烟苗根系。[0044]表3不同处理移栽前烟苗农艺性状[0045][0046]4、不同处理移栽前根系扫描和根系活力。从表4中可看出，低温促生育苗基质对于烟苗根系活力提升明显，显著高于对照烟苗根系。[0047]表4移栽前根系扫描和根系活力[0048][0049]5、不同处理移栽前烟苗酶活性。从表5中可看出，低温促生育苗基质对于烟叶pod、ppo、蔗糖酶和淀粉酶提高显著，表明烟株抗逆能力增强、糖类转化能力增强，烟叶品质与生物量增加。[0050]表5不同处理移栽前烟苗酶活性[0051]酶活(u/g)podcatppo蔗糖酶淀粉酶ck969.33b104.48a42.27b44.65b31.99b低温促生育苗基质6978,00a104.48a52.80a90.16a68.03a[0052]此外，采用gfp标记拮抗菌ba-s在根际的定殖，以判定对病原菌的侵染防治。方法如下：分别吸取茄科劳尔氏菌感受态细胞60μl和1μlp101-p4322质粒(约50ng)，开展质粒的电转化和转化子的筛选。加入预冷的电转杯底部。电击条件为2.5kv/mm，电击1次，电击时间为4.5ms。电击后立即加入1ml恢复液(lb培养基含0.5mol/l海藻糖、0.5mol/l山梨醇、0.38mol/l甘露醇)，于37℃、100r/min孵育3h后，涂布于含有20μg/ml四环素的lb平板上，过夜37℃倒置培养观察转化子。待平板上长出菌落后，将平板直接放于荧光体视显微镜(olympus mvx10)上，挑选在激发光波长为488nm时发绿色荧光的菌落，即为gfp标记上的目标菌株，编号为gfp-ba-s。烟苗经过漂浮育苗培养至50天，轻轻拔出后用水冲洗掉基质，先进行表面消毒，表面消毒方法同上。然后用灭菌去离子水洗净根系。将根系放于gfp-ba-s发酵液中30min后取出，放于光照培养箱中培养72h，以根系放于灭菌水中30min为对照。在载玻片上分别放置根冠区及生长点、分裂区、伸长区及成熟区部位的根组织，在荧光显微镜下观察gfp-ba-s在根际的定殖，结果如图2所示。可见，使用低温促生育苗基质后，拮抗菌可在苗期根系形成一层“保护鞘”，明显减少病原菌侵染风险。[0053]下面对本发明的研究方法进行详细介绍：[0054]一、低温促生育苗菌剂筛选与鉴定[0055]1、低温促生菌的初筛[0056]根际土壤样品采集自贵州省不同烟区(安龙、普安、福泉、开阳、威宁)中烟草长势优良的健康烟株的根际土壤样品，共计8个土壤鲜样，采集后的土壤于4℃冰箱保存，供分离使用。选择的烟区属于贵州省低寒地区，常年温度较低，土壤中孕育了种类多样的低温微生物。[0057]将取自低寒地区的土壤样品分别称取1g烟草根际土壤，放入盛有9ml无菌蒸馏水的三角瓶中，置于摇床28℃，180r/min振荡30min，静置1min后吸取0.5ml上清液于4.5ml无菌水充分混匀至10-2浓度，依次稀释至10-3-10-6浓度的土壤溶液待用；吸取100μl不同稀释液的土壤悬液涂布于lb培养基(胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，琼脂1.5-2g，蒸馏水100ml，ph为7.0，121℃灭菌20min)中，每个浓度分别设置三个重复，10-15℃培养48-72h，挑取不同形态的单菌落，经多次划线进行纯化。根据不同菌落在培养基中的生长情况，选择在低温条件下生长良好的菌株作为初次筛选的基本菌株。[0058]在15℃温度条件下，采用涂布分离法获得150株菌落形态各异的低温生长菌株，如图3所示。经连续5次纯化，低温条件下生长性状测试，获得稳定生长纯菌株66株，作为初步筛选的目标菌株的出发菌株。菌株生长状况如图4。[0059]2、低温促生菌的复筛[0060]对初筛到的菌株开展促生物质检测，评价其对云烟87根系生长促进作用，以确定低温促生菌的促生能力。采用elisa定量试剂盒法测定生长素(iaa)、细胞分裂素(ctk)、赤霉素(ga)含量。[0061]低温下促进烟草根系生长能力筛选方法：用灭菌后的牙签挑取路线一中分离纯化后的菌种，放置液体培养基中，摇床28℃，180r/min振荡培养至对数期，将云烟87裸种进行消毒(75％乙醇浸泡1min，3％次氯酸钠浸泡3min，无菌水冲洗5-6次)用无菌滤纸吸干水分后后沾取菌悬液，放置在含有两张无菌滤纸的一次性培养皿中，每皿放置12粒，滤纸上加入2ml无菌蒸馏水润湿。每个处理设置三个重复，并设置三个含有2ml无菌蒸馏水的空白对照。将平板放置于人工气候箱中10℃，70％湿度，进行培养，每7d加入1ml无菌水，一个月后进行根系扫描，并对扫描数据中根系长度，根系表面积，根系体积进行显著性分析。将根系生长状况良好的处理中的菌株进行斜面保存备用。[0062]将低温条件分离纯化的菌株，于20℃进行分泌植物生长激素能力的测定，结果表明66株菌株产生植物生长激素的能力(含量)相差较大，其中菌株td1分泌赤霉素含量最高，为432.01pg/ml；菌株112分泌细胞分裂素含量最高，其次为菌株114，分泌量分别为50.74μg/l，46.95μg/l。66株菌株分泌植物生长激素能力(含量)具体如表6。[0063]表6低温菌株分泌植物激素情况[0064][0065]供试的66株菌，有33株分泌细胞分裂素、赤霉素以及生长素，对以上菌株进行烟草种子试验进一步筛选。[0066]在低温培养条件下，平板中蘸取菌液的烟草种子根系情况与对照相比，根系长度较长，且根系数量较多，说明菌株的添加对云烟87根系具有促进作用。将平板内的根系在根系扫描仪上进行扫描，如图5所示，34，98，107，112，114，td1，lx4，lx7，vc110与对照相比，根系长度具有显著性差异，根系体积和根系表面积与对照相比无显著性差异，但均高于对照处理，且这几株菌分泌植物激素含量相对较高。具体如表7。[0067]表7烟草根系生长差异[0068][0069]因此，初步筛选出九株菌株作为目标菌株进行效果验证，即34，98，107，112，114，td1，lx4，lx7，vc110，作为初步筛选的低温促生菌株供后期进行效果验证。[0070]菌株低温条件下分泌植物激的情况，各菌株分泌细胞分裂素情况如图6所示，筛选出的目标菌株不仅在常温条件下能够分泌植物激素，且在15℃低温条件下依然能够分泌植物激素。[0071]菌株低温条件下分泌赤霉素的情况，通过低温震荡培养后进行含量测定，结果如图7所示，可知在低温条件下，各菌株分泌细胞分裂素的含量在20-30μg/l，菌株112，114和td1分泌细胞分裂素含量之间无显著性差异。低温条件下，各个菌株分泌赤霉素含量除lx7外，其余菌株赤霉素分泌含量之间无显著性差异，基本维持在200-300pg/ml之间。[0072]生长素作为一种最早发现的一种植物激素，对植物细胞的分裂生长具有一定的促进作用。菌株在低温条件下分泌生长素含量通过测定，由图8可知，低温条件下，菌株均分泌生长素，且分泌含量基本维持在0.05-0.1mg/ml，其中菌株107分泌生长素含量最高，大约为0.25mg/ml。[0073]3、分子鉴定[0074]将所筛选到的低温促生菌菌株进行分子鉴定。对上述效果最好的低温促生菌112、114和td1的16s rdna序列同源性进行分析，16s rdna序列与rdp数据库中的16s rdna序列进行同源性比较。经鉴定，112为arthrobacter nicotinovorans(嗜烟碱节杆菌)，114为bacillus muralis(壁芽孢杆菌)，td1为pseudomonas seleniipraecipitans(硒单胞菌)。[0075]二、低温青枯病拮抗菌筛选与鉴定[0076]采集贵州省典型烟区青枯病和黑胫病发病严重烟田中发病烟株和健康烟草根系及根际土壤，采用lb培养基分离、筛选青枯菌拮抗菌。筛选到的能够同时拮抗青枯菌和黑胫病菌的高效拮抗菌ba-s，经16s rdna鉴定后为bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)。如图9，经盆栽试验验证，ba-s菌剂对烤烟青枯病和黑胫病的防控率分别达到62.3％和85.1％。[0077]三、温度对低温促生菌和拮抗菌生长及生长激素的影响[0078]将上述四个菌株112、114、td1和ba-s接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，于28℃温度下培养36-48h，调节od600为0.5后作为种子液。设定4℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃，采用牛肉膏蛋白胨改良液体培养基，以5％接种菌种种子液，在控温摇床中培养48h，通过测定其od600来比较不同温度下四个菌种的生长速度。采用elisa定量试剂盒法测定不同温度下低温促生菌产生生长素(iaa)、细胞分裂素(ctk)、赤霉素(ga)的含量。[0079]温度对低温促生菌生长的影响如图10所示，从图中可以看出，四株低温促生菌在4℃至50℃中都可以生长，最适温度都为30℃。当温度低至4℃，四株菌仍能正常生长，其中114在低温下生长力最强。当温度为50℃时，除td1生长能力较弱外，另外三株菌也有一定的生长。[0080]不同温度下菌株分泌植物激素情况如表8所示，从表中可以看出，四株低温促生菌在不同温度下分泌植物激素的含量与其生长温度具有一定的相关性。其中，菌株ba-s与114激素分泌受温度影响的敏感度不大，而td1由于是单胞菌，受温度的影响变化较明显。[0081]表8低温菌株分泌植物激素情况[0082][0083]四、菌种复配与保藏[0084]将四株菌株112、114、td1和ba-s进行拮抗交叉试验，四株菌株彼此间无拮抗作用。纯化后的4株分别采用斜面传代法和甘油管法保存于4℃和-20℃。经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中中心保藏，其中112保藏编号为：cgmcc no.16516，td1保藏编号为：cgmcc no.16518，114保藏编号为：cgmcc no.16517，ba-s保藏编号为：cgmcc no.8262。[0085]五、保水剂延长烟草青枯病菌拮抗菌存活[0086]将所筛选的烟草青枯病菌拮抗菌ba-s接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，170r/min，30℃摇床培养36h后，菌液浓度达到109cfu/ml，按1:70的吸水倍率接种于丙稀盐酸-丙烯酰胺类保水剂(bj2101，粒径为m号)中，以接种于相同量的培养基中设为对照，于30℃下培养于微生物培养箱中，每隔5天测定保水剂中拮抗菌的数量，绘制数量动态监测图(图11)。从图中可以看出，烟草青枯病菌拮抗菌的数量在保水剂中0-10天内呈先下降后升高的趋势，65天内数量级上未发生变化。而拮抗菌在液体培养基中呈一直下降趋势，接种10天后保水剂中ba-s拮抗菌数量显著高于液体培养基，从而表明，保水剂对烟草青枯病菌拮抗菌具有延长定殖的作用。[0087]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。









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