一套用于哈伯德肉鸡品种鉴定的SNP位点引物组合及其应用的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术一套用于哈伯德肉鸡品种鉴定的snp位点引物组合及其应用技术领域1.本发明涉及家禽品种鉴定方法，具体地，涉及一套用于哈伯德肉鸡品种鉴定的snp位点引物组合及其应用。背景技术：2.哈伯德肉鸡是法国哈伯德育种公司培育的肉鸡品种，是世界著名的白羽肉鸡品种，19世纪中期由法国引进，因而得名。其主要特征是宽胸，产肉率高，体质健壮，早期生长速度适中，繁殖性能较好，含有隐性白羽基因。将其作为配套母本与国内地方优质鸡杂交，不仅可以明显提高后代生长速度和饲料转化率，并且外貌、体型及肉质与所杂交的地方优质鸡种相似，显著降低育种成本，对我国优质鸡配套利用产生了巨大的推动作用。由于引种成本过高，很多公司出售的哈伯德肉鸡品种不纯，在地方鸡种杂交配套中发挥不了很好的作用，产生较大的经济损失。因此，急需科学的哈伯德肉鸡的品种鉴定方法。技术实现要素：3.针对上述哈伯德肉鸡的品种鉴定缺乏科学有效的手段的问题，本发明提供了一套用于哈伯德肉鸡品种鉴定的snp位点引物组合及其应用，可通过检测提供的哈伯德肉鸡7个snp位点的基因型来联合准确判断待测个体是否属于哈伯德肉鸡，为哈伯德肉鸡的引种提供科学基础。4.为了实现上述目的，本发明一方面提供一套用于哈伯德肉鸡品种鉴定的snp位点引物组合，所述引物组合扩增选自如下hbd1位点到hbd7位点中的任意3到7种：各snp位点引物的核苷酸序列如下：本发明还提供了一种上述snp位点引物组合在哈伯德肉鸡品种鉴定中的应用。5.具体地，鉴定方法包括以下步骤：(1)提取待测鸡基因组总dna；(2)根据所选snp组合，利用对应的引物对分别进行pcr扩增；(3)将pcr扩增产物测序后、判断基因型；(4)根据基因型结果，判断个体是否属于哈伯德肉鸡品种。6.步骤（4）的具体判断方法为：如果所选snp组合对应的基因型有一个不符合哈伯德肉鸡对应的基因型，则判定该个体不属于哈伯德肉鸡；如果所选至少3个snp位点组合对应的基因型全部符合哈伯德肉鸡对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于哈伯德肉鸡的概率。7.优选地，所述步骤(1)中待测鸡的基因组dna由该鸡种的个体翅静脉采血得到。8.步骤（2）中，hbd1~hbd7的pcr产物长度分别为232 bp、178 bp、173 bp、250 bp、250 bp、172 bp、205bp。9.优选地，所述哈伯德肉鸡中7个snp位点hbd1～hbd7的基因型依次为gg、gg、gg、tt、aa、gg、gt。10.通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：采用本发明的snp位点引物进行哈伯德肉鸡的品种鉴定时，任意1个snp位点基因型判定为哈伯德肉鸡的概率最低为71.42％，最高为90.55％；任意2个snp位点联合基因型判定为哈伯德肉鸡的概率达到93.43％以上；任意3个snp位点联合基因型判定为哈伯德肉鸡的概率达到99.23％以上；任意4个snp位点联合基因型判定为哈伯德肉鸡的概率达到99.89％以上；任意5个snp位点联合基因型判定为哈伯德肉鸡的概率达到99.97％以上；任意6个snp位点联合基因型判定为哈伯德肉鸡的概率达到99.99％以上；全部7个snp位点联合基因型判定为哈伯德肉鸡的概率达到100％。任意一个snp位点基因型排除哈伯德肉鸡的概率即达到100％。11.因此，只要有一个snp位点基因型不符合哈伯德肉鸡相应的基因型，即可完全排除该个体属于哈伯德肉鸡；任选3个snp位点组合，符合哈伯德肉鸡基因型的判定概率即可达到99％以上。这种方法操作简便，准确性高，为哈伯德肉鸡的引种提供科学的基础。具体实施方式12.本发明提供了一套用于哈伯德肉鸡品种鉴定的snp位点引物组合及其应用，所述引物组合扩增选自hbd1位点到hbd7位点中的任意3到7种。13.7个snp位点的筛选方法为：利用京芯一号芯片（55k，北京康普森生物技术有限公司）对不同鸡品种（哈伯德肉鸡、来航鸡、高脚鸡、矮脚鸡、竹香鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、兴文乌骨鸡、乌蒙凤鸡等国内外代表性鸡品种合计12个品种）的55000个snp位点进行筛选确定，根据每个品种跟其他品种对比，取差异最大的位点的集合，群体间遗传分化指数（fst）前1%，最小等位基因频率（maf）》0.4，缺失率（miss rate）《0.2 进行筛选，确定68个snp位点，为了进一步筛选出哈伯德肉鸡核心位点信息，优先选择哈伯德肉鸡参考基因组位点等位基因频率为0或1，然后确定其他11个品种的每个位点的不同等位基因频率均值，再通过该均值与哈伯德肉鸡每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的snp位点，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点，最终确定用于哈伯德肉鸡品种鉴定的7个snp位点。7个snp位点信息见下表。14.根据7个snp位点的物理位置，基于红色原鸡参考基因组序列(galgal5)，利用ucsc网站https://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hggateway?hgsid=791993043_mvnmfj6qpmrqsauoxqixq3gpteuu，获得7个snp位点dna序列，然后利用primer5.0设计引物。各snp引物序列、pcr产物长度和退火温度见下表：用上述snp引物组合进行哈伯德肉鸡品种鉴定具体方法包括如下步骤：(1)提取待测鸡基因组总dna；(2)根据所选snp组合，利用对应的引物对分别进行pcr扩增；(3)将pcr扩增产物测序后、判断基因型；(4)根据基因型结果，判断个体是否属于哈伯德肉鸡品种。15.在本发明鉴定方法中，优选从待测鸡的翅静脉采血获得全血提取基因组dna，本发明对基因组dna的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规提取方法即可，在本发明实施例中，优选酚-氯仿法提取基因组dna。16.本发明中，应用时采用hbd1～hbd7中的一个位点或者几个位点进行哈伯德肉鸡品种的鉴定，并采用对应的上下游引物进行pcr扩增。pcr扩增采用本领域常规pcr扩增方法即可。17.本发明中，哈伯德肉鸡中7个snp位点hbd1～hbd7的基因型依次为gg、gg、gg、tt、aa、gg、gt。18.通过对待测鸡pcr扩增产物测序后、判断基因型，与所选snp组合对应的基因型进行比对，如果有一个不符合哈伯德肉鸡对应的基因型，则判定该个体不属于哈伯德肉鸡；如果所选snp组合对应的基因型全部符合哈伯德肉鸡对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于哈伯德肉鸡的概率。计算公式如下：其中，pi表示snp组合中第i个snp中其他品种对应基因型的频率。19.所述snp位点在哈伯德肉鸡及其他品种中的基因型频率如下表：例如，选择hbd2、hbd4、hbd6合计3个snp位点，如果联合基因型为ggttgg，则该个体属于哈伯德肉鸡的概率为p＝1/(1+0.22×0.14×0.18)＝0.9946。20.其中，其他品种的基因型频率是指选择来航鸡、矮脚鸡、高脚级、竹香鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、兴文乌骨鸡、乌蒙凤鸡等国内外11个代表性品种，不同品种合并计算得到的每个位点的基因型频率均值。21.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。22.实施例1随机选择江苏省重点实验室家禽种质资源遗传材料库保存的哈伯德肉鸡25只、来航鸡25只、矮脚鸡25只、高脚鸡25只、黔东南小香鸡25只、竹香鸡25只、金湖乌凤鸡25只，翅静脉采血，酚-氯仿法提取基因组dna，选择hbd1、hbd3、hbd5合计3个snp位点的引物进行pcr扩增。23.pcr总反应体系50μl：dna模板2μl，dntp（2 mmol/l）4μl，mg2+（3 mmol·l-1）0.6μl，1×pcr反应缓冲液5μl，上、下游引物（10 μmol·l-1）各1μl，taq聚合酶（1u·μl-1）2.5μl，补超纯水至50μl。24.pcr反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5 min。pcr扩增目的片段用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。25.pcr产物送生物公司进行测序，同时序列进行多态性检测和基因型判定。根据测序结果，3个位点联合基因型为ggggaa的25个个体判定为哈伯德肉鸡的概率为p＝1/(1+0.09×0.11×0.16)＝0.9984，99.84%可以将25个个体全部鉴定为哈伯德肉鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合ggggaa基因型，因此判定为非哈伯德肉鸡。26.实施例2其他条件同实施例1，区别在于，采用hbd2、hbd3、hbd4、hbd5、hbd6对应的5个snp位点的引物进行pcr扩增。根据测序结果，5个位点联合基因型为ggggttaagg的25个个体判定为哈伯德肉鸡的概率为p＝1/(1+0.12×0.11×0.17×0.16×0.09)＝1.0000，100%可以将25个个体全部鉴定为哈伯德肉鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合ggggttaagg基因型，因此判定为非哈伯德肉鸡。27.实施例3其他条件同实施例1，区别在于，采用hbd1~hbd7对应的7个snp位点的引物进行pcr扩增。根据测序结果，7个位点联合基因型为ggggggttaagggt的25个个体判定为哈伯德肉鸡的概率为p＝1/(1+0.09×0.12×0.11×0.17×0.16×0.09×0.40)＝1.0000，100%可以将25个个体全部鉴定为哈伯德肉鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合ggggggttaagggt基因型，因此判定为非哈伯德肉鸡。28.以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。29.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。30.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。









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