一种异常威克汉姆酵母菌在制备青刺果提取物中的应用的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种异常威克汉姆酵母菌在制备青刺果提取物中的应用。背景技术：2.青刺果是一种蔷薇科扁核木属的灌木，其果实、枝叶在云贵地区有较长食用历史。近年来随着青刺果油和青刺果提取物在食品和化妆品领域的广泛应用，人们也开始通过发酵的方式对青刺果的发酵液进行开发利用。3.目前，青刺果的发酵主要是利用酿酒酵母或乳酸菌复合酶解技术制备青刺果发酵液，而青刺果发酵液的功效主要为美白、抗衰老、清除dpph自由基等。如以酿酒酵母菌和乳酸菌为发酵菌种于30-40℃进行混合发酵，离心收集上清液，具有较好的自由基清除能力以及酪氨酸酶抑制能力，可用于美白抗衰老化妆品中。4.cn107308226a公开了一种青刺果提取物及其制备方法和应用，该制备方法将青刺果加水或乙醇提取，获得青刺果粗提液；青刺果粗提液浓缩，上样至大孔吸附树脂，洗脱，分别收集各洗脱部位后减压蒸馏除去溶剂，相应地得到青刺果不同溶剂的洗脱部位。该青刺果提取物采用的是为榨干油前的青刺果作为原料，经过水提或醇提方法提取获得青刺果非油类提取物；且该方法制备得到青刺果油粕发酵液虽然自由基清除活性和促进人成纤维细胞增殖的作用较好，但抗炎功效有待提高。5.cn109363984a公开了一种青刺果油粕发酵液及其制备方法和在化妆品中的应用。本发明包括如下步骤：步骤1、以青刺果油粕与水的混合物为发酵底物，加入酶进行酶解，以酿酒酵母菌为发酵菌种进行单独发酵，或以乳酸菌为发酵菌种进行单独发酵，或以酿酒酵母菌和乳酸菌为发酵菌种进行混合发酵，得到发酵产物；步骤2：取发酵产物，离心收集上清液，即为青刺果油粕发酵液。实验表明，本发明制备的青刺果发酵原浆具有较好的自由基清除能力以及酪氨酸酶抑制能力。该方法中采用了酿酒酵母菌或乳酸菌进行发酵得到青刺果油粕发酵液，但其在发酵前还需要加入酶进行酶解才能完成发酵；且该菌种制备得到青刺果油粕发酵液虽然自由基清除能力以及酪氨酸酶抑制能力较好，但抗炎功效有待提高。6.cn105919889a公开了一种青刺果发酵原浆化妆品及其制备方法与应用，包括如下步骤：以青刺果为底物，以酿酒酵母为菌种，进行发酵，其活性成分为所述青刺果发酵原浆；产品的功能为：抗氧化、清除dpph自由基、抗衰老。该酿酒酵母制备得到青刺果发酵原浆虽然抗氧化能力较好，但抗炎功效仍有待提高。7.上述公开的青刺果发酵产品选用的菌种均为应用较广的商业菌株，例如酿酒酵母或乳酸菌等，而功效关注于美白和抗衰老，却忽略了在民间使用青刺果时在镇定肌肤和舒缓方面的功效。8.因此，亟待提供一种异常威克汉姆酵母，应用于制备青刺果提取物，使其具有优异的抗炎修复的功效。技术实现要素：9.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种异常威克汉姆酵母菌在制备青刺果提取物中的应用。本发明利用从生长于香格里拉维西县的青刺果果实上分离到的共生酵母菌，对榨油后的青刺果油粕进行发酵，制备能够抑制tnf-α和il-6炎症因子、具有镇定舒缓功效的青刺果提取物。10.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：11.第一方面，本发明提供一种异常威克汉姆酵母菌在制备青刺果提取物中的应用，所述异常威克汉姆酵母菌为异常威克汉姆酵母菌wickerhamomyces anomalus wx3-1菌株，保藏编号为cctcc no：m 2022757，保藏时间为2022年05月30日。12.其保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学。13.本发明采用了分离自香格里拉维西县生长的青刺果果实上分离到的异常威克汉姆酵母wx3-1菌株进行发酵，异常威克汉姆酵母wx3-1菌株作为青刺果果实的共生菌能够更好的分解其营养。14.在本发明中，所述异常威克汉姆酵母菌wx3-1菌株的来源如下所示：15.（1）选取分离自生长于香格里拉维西县的青刺果果实的样本，使用液体培养基28~32℃（例如可以是28℃、29℃、30℃、31℃、32℃等）培养18~24 h（例如可以是18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h等）后，将增菌液涂布在固体培养基上，挑取出不同形态的菌落后在固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落使用液体培养基扩大培养，再使用甘油进行保藏；16.（2）针对保藏的3株单菌进行显微形态观察，筛选出具有酵母菌形态特征的一株进行鉴定。17.第二方面，本发明提供一种青刺果提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在含青刺果油粕的料液中接种所述的异常威克汉姆酵母菌wx3-1菌株后，进行发酵，制备得到所述青刺果提取物。18.在本发明中，采用了从香格里拉维西县分离到的菌株对青刺果榨取青刺果油后剩余的油粕进行发酵，有效地提高了对青刺果的利用率，制备得到的青刺果提取物中富含皂苷、多糖、黄酮等物质，使得其对炎症细胞分泌的tnf-α和il-6炎症因子的抑制效果得到了进一步地提升；此外，还增加了当地农户采摘青刺果带来的收益；开发利用本地植物和微生物资源，提升本地植物产业价值。19.优选地，所述发酵的温度为26~36℃，例如可以是26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃等，所述发酵的时间为48~96 h，例如可以是48 h、54 h、60 h、66 h、72 h、78 h、84 h、90 h、96 h等。20.优选地，所述发酵在摇床中进行，摇床的转速为100~200 rpm，例如可以是100 rpm、120 rpm、140 rpm、160 rpm、180 rpm、200 rpm等。21.优选地，所述发酵完成后还需依次进行灭菌、过滤、离心后收集上清液，得到所述青刺果提取物。22.优选地，所述灭菌的温度为110~125℃，例如可以是110℃、115℃、120℃、125℃等，所述灭菌的时间为15~30 min，例如可以是15 min、20 min、25 min、30 min等。23.优选地，所述过滤采用孔径为1~10 μm（例如可以是1 μm、2 μm、3 μm、4 μm、5 μm、6 μm、7 μm、8 μm、9 μm、10 μm等）的hpp滤膜。24.优选地，所述离心的转速为2000-8000 rpm（例如可以是2000 rpm、3000 rpm、4000 rpm、5000 rpm、6000 rpm、7000 rpm、8000 rpm等），离心的时间为10-30 min（例如可以是10 min、12 min、15 min、18 min、20 min、22 min、25 min、28 min、30 min等）。25.优选地，在接种前所述异常威克汉姆酵母菌需要进行活化，所述活化包括以下步骤：将异常威克汉姆酵母wx3-1菌株接种于活化培养基中，进行活化培养，得到活化的菌种液。26.优选地，所述活化培养基按质量浓度计包括：动物组织胃蛋白酶水解物4-6 g/l、胰酪胨4-6 g/l、葡萄糖18-22 g/l。27.在所述活化培养基中，动物组织胃蛋白酶水解物的浓度为4-6 g/l，例如可以是4 g/l、4.5 g/l、5 g/l、5.5 g/l、6 g/l等。28.在所述活化培养基中，胰酪胨的浓度为4-6 g/l，例如可以是4 g/l、4.5 g/l、5 g/l、5.5 g/l、6 g/l等。29.在所述活化培养基中，葡萄糖的浓度为18-22 g/l，例如可以是18 g/l、19 g/l、20 g/l、21 g/l、22 g/l等。30.优选地，所述活化培养的温度为26~36℃，例如可以是26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃等，所述活化培养的时间为18~24 h，例如可以是18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h等。31.优选地，所述活化培养的完成后菌液中酵母菌的含量在105 cfu/ml以上，例如可以是105 cfu/ml、2×105 cfu/ml、5×105 cfu/ml、8×105 cfu/ml、106 cfu/ml、5×106 cfu/ml、107 cfu/ml、5×107 cfu/ml等。32.优选地，所述含青刺果油粕的料液中，青刺果油粕的含量为0.5~10 wt%，例如可以是0.5 wt%、1 wt%、2 wt%、3 wt%、4 wt%、5 wt%、6 wt%、7 wt%、8 wt%、9 wt%、10 wt%等。33.优选地，所述含青刺果油粕的料液中，溶剂选自纯水、生理盐水或磷酸缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。34.优选地，所述含青刺果油粕的料液中，活化的菌种液的接种量为1-5 vol%，例如可以是1 vol%、2 vol%、3 vol%、4 vol%、5 vol%等。35.第三方面，本发明提供一种青刺果提取物，所述青刺果提取物由如上述青刺果提取物的制备方法制备得到。36.优选地，所述青刺果提取物的ph为6以下，例如可以是6、5.8、5.6、5.4、5.2、5、4.5、4等。37.优选地，所述青刺果提取物中异常威克汉姆酵母wx3-1的含量在105 cfu/ml以上，例如可以是105 cfu/ml、5×105 cfu/ml、106 cfu/ml、5×106 cfu/ml、107 cfu/ml等。38.第四方面，本发明提供一种第三方面所述的青刺果提取物在制备具有抗炎功效的化妆品中的应用。39.本发明利用从生长于香格里拉维西县的青刺果果实上分离到的共生酵母菌，对榨油后的青刺果油粕进行发酵，制备能够抑制tnf-α和il-6炎症因子、具有镇定舒缓功效的发酵液。40.第五方面，本发明提供一种化妆品，其特征在于，所述化妆品包括所述的青刺果提取物。41.优选地，所述青刺果提取物占所述化妆品总质量的0.001-20%，例如可以是0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%等。42.优选地，所述化妆品原料还包括溶剂和/或辅料。43.优选地，所述溶剂选自纯化水、生理盐水、磷酸缓冲液、甘油、丁二醇或丙二醇中的任意一种或至少两种的组合。44.优选地，所述辅料选自乳酸、苯氧乙醇、山梨酸钾或苯甲酸钠中的任意一种或至少两种的组合。45.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：46.（1）本发明利用从生长于香格里拉维西县的青刺果果实上分离到的共生酵母菌，对榨油后的青刺果油粕进行发酵，有效地提高了对青刺果的利用率，制备得到的青刺果提取物中富含皂苷、多糖、黄酮等物质；47.（2）本发明制备得到的青刺果提取物能够抑制tnf-α和il-6炎症因子，具有镇定舒缓的功效；48.（3）本发明制备得到的青刺果提取物在无菌条件下加入溶剂等辅料配制成化妆品原料，罐装后可储存12个月以上。附图说明49.图1为实施例1提供的青刺果提取物对tnf-α的抑制作用示意图。50.图2为实施例1提供的青刺果提取物对il-6的抑制作用示意图。具体实施方式51.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。52.下述实施例中采用的异常威克汉姆酵母菌命名为异常威克汉姆酵母（wickerhamomyces anomalus）wx3-1菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2022年05月30日，保藏编号为cctcc no：m 2022757，地址为：中国，武汉，武汉大学。53.实施例154.本实施例提供一种青刺果提取物的制备方法，所述青刺果提取物的制备方法包括以下步骤：55.（1）将异常威克汉姆酵母wx3-1菌株接种于活化培养基中，在30℃下活化培养20 h，得到酵母菌的含量在105cfu/ml以上活化后的菌种液；56.其中，所述活化培养基按质量浓度计包括：动物组织胃蛋白酶水解物5 g/l、胰酪胨5 g/l、葡萄糖20 g/l，溶剂为水；57.（2）在含5 wt%青刺果油粕的水溶液中接种2 vol%的活化后的菌种液，在30℃下发酵72 h，且所述发酵在摇床中进行，摇床的转速为150 rpm，得到发酵液，再在120℃下灭菌20 min，采用孔径为10 μm的hpp滤膜过滤，最后以3000 rpm的转速离心15 min，收集上清液，得到所述青刺果提取物。58.实施例259.本实施例提供一种青刺果提取物的制备方法，所述青刺果提取物的制备方法包括以下步骤：60.（1）将异常威克汉姆酵母wx3-1菌株接种于活化培养基中，在26℃下活化培养24 h，得到酵母菌的含量在105 cfu/ml以上活化后的菌种液；61.其中，所述活化培养基按质量浓度计包括：动物组织胃蛋白酶水解物4 g/l、胰酪胨6 g/l、葡萄糖18 g/l，溶剂为水；62.（2）在含5 wt%青刺果油粕的水溶液中接种3 vol%的活化后的菌种液，在26℃下发酵96 h，且所述发酵在摇床中进行，摇床的转速为200 rpm，得到发酵液，再在110℃下灭菌30 min，采用孔径为10 μm的hpp滤膜过滤，最后以3000 rpm的转速离心15 min，收集上清液，得到所述青刺果提取物。63.实施例364.本实施例提供一种青刺果提取物的制备方法，所述青刺果提取物的制备方法包括以下步骤：65.（1）将异常威克汉姆酵母wx3-1菌株接种于活化培养基中，在36℃下活化培养18 h，得到酵母菌的含量在105 cfu/ml以上活化后的菌种液；66.其中，所述活化培养基按质量浓度计包括：动物组织胃蛋白酶水解物6 g/l、胰酪胨4 g/l、葡萄糖22 g/l，溶剂为水；67.（2）在含5 wt%青刺果油粕的水溶液中接种4 vol%的活化后的菌种液，在36℃下发酵48 h，且所述发酵在摇床中进行，摇床的转速为100 rpm，得到发酵液，再在125℃下灭菌15 min，采用孔径为10 μm的hpp滤膜过滤，最后以3000 rpm的转速离心15 min，收集上清液，得到所述青刺果提取物。68.实施例469.本实施例提供一种青刺果提取物的制备方法，所述青刺果提取物的制备方法包括以下步骤：70.（1）将异常威克汉姆酵母wx3-1菌株接种于活化培养基中，在30℃下活化培养20 h，得到酵母菌的含量在105 cfu/ml以上活化后的菌种液；71.其中，所述活化培养基按质量浓度计包括：动物组织胃蛋白酶水解物5 g/l、胰酪胨5 g/l、葡萄糖20 g/l，溶剂为水；72.（2）在含5 wt%青刺果油粕的水溶液中接种2 vol%的活化后的菌种液，在40℃下发酵45 h，且所述发酵在摇床中进行，摇床的转速为150 rpm，得到发酵液，再在120℃下灭菌20 min，采用孔径为10 μm的hpp滤膜过滤，最后以3000 rpm的转速离心15 min，收集上清液，得到所述青刺果提取物。73.实施例574.本实施例提供一种青刺果提取物的制备方法，所述青刺果提取物的制备方法包括以下步骤：75.（1）将异常威克汉姆酵母wx3-1菌株接种于活化培养基中，在30℃下活化培养20 h，得到酵母菌的含量在 105 cfu/ml以上活化后的菌种液；76.其中，所述活化培养基按质量浓度计包括：动物组织胃蛋白酶水解物5 g/l、胰酪胨5 g/l、葡萄糖20 g/l，溶剂为水；77.（2）在含5 wt%青刺果油粕的水溶液中接种2 vol%的活化后的菌种液，在20℃下发酵100 h，且所述发酵在摇床中进行，摇床的转速为150 rpm，得到发酵液，再在120℃下灭菌20 min，采用孔径为10 μm的hpp滤膜过滤，最后以3000 rpm的转速离心15 min，收集上清液，得到所述青刺果提取物。78.对比例179.本对比例提供一种青刺果提取物的制备方法，所述青刺果提取物的制备方法包括以下步骤：80.（1）将酿酒酵母cicc1002（购于中国工业微生物菌种保藏中心）接种于活化培养基中，在36℃下活化培养48 h，得到酵母菌的含量在105 cfu/ml以上活化后的菌种液；81.其中，所述活化培养基按质量浓度计包括：动物组织胃蛋白酶水解物5 g/l、胰酪胨5 g/l、葡萄糖20 g/l，溶剂为水；82.（2）在含5 wt%青刺果油粕的水溶液中接种2 vol%的活化后的菌种液，在30℃下发酵72 h，且所述发酵在摇床中进行，摇床的转速为150 rpm，得到发酵液，再在120℃下灭菌20 min，采用孔径为10 μm的hpp滤膜过滤，最后以3000 rpm的转速离心15 min，收集上清液，得到所述青刺果提取物。83.对比例284.本对比例提供一种青刺果提取物的制备方法，所述青刺果提取物的制备方法包括以下步骤：85.（1）将植物乳杆菌cicc20272（购于中国工业微生物菌种保藏中心）接种于活化培养基中，在36℃下活化培养48 h，得到嗜酸乳杆菌的含量在 106 cfu/ml以上活化后的菌种液；86.其中，所述活化培养基为mrs液体培养基；87.（2）在含5 wt%青刺果油粕的水溶液中接种2 vol%的活化后的菌种液，在30℃下发酵72 h，且所述发酵在摇床中进行，摇床的转速为150 rpm，得到发酵液，再在120℃下灭菌20 min，采用孔径为10 μm的hpp滤膜过滤，最后以3000 rpm的转速离心15 min，收集上清液，得到所述青刺果提取物。88.测试例189.理化性能测试90.测试样品：实施例1-5和对比例1-2提供的青刺果提取物；91.测试方法：采用ph计（厂家：梅特勒，型号：fe28）测试各样品液的ph，每组样品分别测试3次，记录平均值；采用硫酸蒽酮法测试各样品液的多糖含量，每组样品分别测试3次，记录平均值；92.具体测试结果如表1所示：93.表1[0094][0095]由表1所示，本发明制备得到的青刺果提取物ph为6以下，总糖含量含量在3.1 mg/ml以上，其中异常威克汉姆酵母菌wx3-1的含量在105 cfu/ml以上，且发酵液散发青刺果和酵母菌混合香气。[0096]测试例2[0097]mtt法测定青刺果发酵提取物最大安全浓度[0098]测试样品：实施例1提供的青刺果提取物；[0099]测试方法：将细胞密度调整为1×105 cell/ml，按照每孔200 μl的体积接种细胞至96孔板中，放入培养箱孵育（37℃、5%co2）。24 h后取出96孔板，弃除旧培养基，调零孔和空白对照组每孔加200 μl基础培养基，实验组每孔加200 μl用基础培养基配制的样品，按照每组每个浓度3个复孔进行布板。然后放回培养箱培养（37℃，5% co2）；加药处理后24 h，取出96孔板，每孔加入mtt工作液（5mg/ml）20 μl，放回培养箱继续培养4 h，然后弃除孔内液体，每孔重新加入150 μl dmso，振摇10 min后于490 nm波长处测定吸光度（od值）；[0100]具体测试结果如表2所示：[0101]表2[0102][0103]由表2所示，青刺果发酵提取物浓度≤0.3125%时，细胞活力均值为88.98%，接近90%，因此选择0.3125%作为最大安全浓度进行抗炎活性测试。[0104]测试例3[0105]抗炎活性测试[0106]测试样品：实施例1-3提供的青刺果提取物；[0107]测试方法：[0108]（1）青刺果发酵提取物对lps致巨噬细胞raw264.7细胞分泌tnf-α的作用：选择细胞活力≥90%对应的样品浓度为最大作用浓度，作为实验组样品待测液；以地塞米松（100 μg/ml）为阳性对照进行实验。给药培养后取细胞上清液用elisa试剂盒测定细胞上清中tnf-α浓度；其中，空白对照组记为bc、lps刺激组记为nc、阳性对照组地塞米松记为pc；[0109]（2）青刺果发酵提取物对lps致巨噬细胞raw264.7细胞分泌il-6的作用：选择细胞活力≥90%对应的样品浓度为最大作用浓度，作为实验组样品待测液；以地塞米松（100 μg/ml）为阳性对照进行实验；给药培养后取细胞上清液用elisa试剂盒测定细胞上清中il-6浓度；其中，空白对照组记为bc、lps刺激组记为nc、阳性对照组地塞米松记为pc；[0110]具体测试结果如表3所示：[0111]表3[0112][0113]由表3所示，采用本发明所述异常威克汉姆酵母wx3-1菌制备得到的青刺果提取物可明显抑制tnf-α的分泌，使tnf-α的含量降至800 pg/ml以下，抑制率达到40%以上；可明显抑制il-6的分泌，使il-6的含量降至430 pg/ml以下，抑制率达到22 %以上。[0114]如图1所示，lps刺激（nc）后细胞tnf-α浓度显著升高（***p＜0.001），阳性对照地塞米松（100 μg/ml）可明显抑制tnf-α的分泌（###p＜0.001），说明本次刺激条件有效；实施例1提供的青刺果提取物0.3125%和0.156%浓度对lps致巨噬细胞raw264.7细胞分泌的tnf-α均有抑制作用（###p＜0.001），差异具有统计学意义。[0115]如图2所示，与空白对照组（bc）相比，lps刺激（nc）后il-6浓度显著升高（***p＜0.001），地塞米松（100μg/ml）可明显抑制il-6的分泌（###p＜0.001），说明本次刺激条件有效；实施例1提供的青刺果提取物0.3125%和0.156%对lps致巨噬细胞raw264.7细胞分泌的il-6均有抑制作用（###p＜0.001），差异均有统计学意义。[0116]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明所述异常威克汉姆酵母菌在制备青刺果提取物中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。









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