用于由烟酰胺核糖核苷氯化物生产二氢烟酰胺核糖核苷的方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术用于由烟酰胺核糖核苷氯化物生产二氢烟酰胺核糖核苷的方法背景技术：1.本公开整体涉及用于由烟酰胺核糖核苷氯化物生产二氢烟酰胺核糖核苷的方法以及相关的纯化和稳定方法。2.烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)及其还原形式1,4-二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)是通过电子转移实现能量代谢和线粒体功能的关键分子。此外，nad+是许多非氧化还原反应中的关键辅因子，其通过使腺苷二磷酸核糖(adp-核糖)酶催化两个必需蛋白质家族(去乙酰化酶(sirt)和聚(adp-核糖)聚合酶(parp))的功能。去乙酰化酶具有维持核、线粒体、细胞质或代谢稳态的若干关键作用。parp的最重要的作用是修复dna和维持染色质结构和功能。衰老和一些破坏性因素诸如急性损伤或慢性代谢或炎性病症可导致nad+的水平严重下降。3.nad+的下降导致能量产生的减少，这随后损害细胞功能、细胞稳态和免疫细胞功能。当细胞被普通环境因素损害时，这种现象变得更加重要，因为修复损害需要大量的nad+。如果损伤严重，受损细胞将没有足够的储存能量来提供稳态维持所需的nad+，因此损伤变得不可逆。脑、心脏、肝、肾和骨骼肌是具有较高数量的线粒体的器官，因此，这些重要器官对nad+消耗更敏感。因此，需要富含能量的nad+前体以使具有受损组织的细胞保持在正常的能量水平。烟酰胺核糖核苷(nr)、烟酸(尼克酸)和烟酰胺是可商购的天然化合物，其用作营养补充剂以增加nad+的浓度。4.与尼克酸和烟酰胺相比，nr是更有效的nad+前体，因为它在哺乳动物细胞中以较少的步骤代谢为nad+(方案1)。研究表明，服用nr作为补充剂对于刺激nad+代谢是有效的，并且可以将nad+水平提高60％。[0005][0006]方案1.nr在哺乳动物细胞内转化为nad+。[0007]尽管nr可增加细胞的nad+水平并改善细胞健康，但nr必须大量服用才能有效。最近，sauve等人已经合成了1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)，并证明该化合物在体外和体内条件下都是有效的nad+浓度增强剂。他们发现，在将nrh施用到哺乳动物细胞后，其在仅一小时内使nad+浓度比对照值增加了2.5倍至10倍。他们的发现证明使用nrh比nr或nmn更有效。此外，nrh显著提高培养的细胞中的nad+/nadh比率，而不诱导细胞凋亡标记物或细胞中乳酸水平的显著增加。最近，canto等人已发现，与nr途径相反，nrh使用不同的步骤和酶来合成nad+。这解释了为什么与哺乳动物细胞中的nr相比，nrh是更有效和更快的nad+前体。相同的研究人员也已经证明，在小鼠实验中，nrh作为nad+前体是口服生物可利用的，并且预防顺铂诱导的急性肾损伤。除了增加nad+水平之外，nrh还可以消耗一些基因毒素，诸如过氧化氢和甲磺酸甲酯。因此，用nrh处理的小鼠细胞对细胞死亡具有抵抗力。[0008]用于制备nrh的方法非常少。该化合物可以由二氢烟酰胺单核苷酸(nmnh)通过在存在碱性磷酸酶的情况下将5’‑磷酸酯水解来制备。nmnh的方法耗时且不是成本有效的，因为作为前体的nmnh必须由nadh酶促水解。用于合成nrh的另一种方法是在连二亚硫酸钠(na2s2o4)作为还原剂的存在下还原nr。在该方法中，烟酰胺核糖核苷三氟甲磺酸酯在连二亚硫酸钠和磷酸氢钾的水性溶液中被还原为nrh(方案2)。因为na2s2o4的水性溶液在环境条件下非常不稳定，所以该反应必须在低温和厌氧、碱性条件下进行。此外，应立即用使用c18树脂的hplc纯化粗产物，因为nrh在环境条件下对水解和氧化均敏感，如实施例的结果和讨论所示。[0009][0010]方案2.从烟酰胺核糖核苷三氟甲磺酸酯合成nrh。[0011]尽管这种方法适于合成少量的nrh，但是存在阻碍将此扩大到nrh的商业生产的若干缺点。前体烟酰胺核糖核苷三氟甲磺酸酯是非常昂贵的，是非常吸湿的材料，并且必须在-20℃下在惰性气氛下储存。此外，该化合物不是食品级的，因为在烟酰胺核糖核苷三氟甲磺酸酯的结构中存在三氟甲磺酸根阴离子。因此，还原后需要从剩余的nr(三氟甲磺酸酯)中完全纯化nrh。[0012]用于合成nrh的另一种方法是使用三乙酰化烟酰胺核糖核苷三氟甲磺酸酯来代替烟酰胺核糖核苷三氟甲磺酸酯(方案3)。在该间接程序的第一步骤中，用na2s2o4将三乙酰化nr转化为三乙酰化nrh。在下一步骤中，在球磨的同时，通过三乙酰化nrh的甲醇分解形成nrh。该方法可能适合于nrh的可规模化合成，因为它提供良好的产率。然而，三乙酰化烟酰胺核糖核苷三氟甲磺酸酯(一种昂贵且非食品级的物质)的使用可能限制该程序。[0013][0014]方案3.由三乙酰化烟酰胺核糖核苷三氟甲磺酸酯间接合成nrh。[0015]应当注意，已用于合成nrh的大多数烟酰胺核糖核苷是两种端基异构的α-和β-形式的混合物。然而，只有nr的β-端基异构体表现出生物活性和药物性质。在nr衍生物中，仅烟酰胺核糖核苷氯化物(nrcl)可作为饮食补充剂商购获得。技术实现要素：[0016]本公开包括以下认识：使用β-nrcl作为前体来合成nrh将代表nrh的商业化的突破，nrh是期望的和有价值的产物。实际上，本文所公开的生产nrh的方法从可商购获得的nr或其衍生物诸如β-nrcl具有有利的高产率。附图说明[0017]图1是示出根据本公开所提供的实施方案的由烟酰胺核糖核苷氯化物生产二氢烟酰胺核糖核苷的示例性方法的图；[0018]图2是示出根据本公开所提供的实施方案的与nr和na相比在纯化后在ph 8.1下合成的nrh的tlc(图2a)以及纯化的nrh和原始nr的ft-ir(图2b)的一组照片和曲线图；[0019]图3是示出根据本公开所提供的实施方案的纯化的nrh在d2o中的1hnmr的一组曲线图；[0020]图4是示出根据本公开所提供的实施方案的nrcl(图4a)、nrh(图4b)和na(图4c)在d2o中的1h nmr谱的一组曲线图；[0021]图5是示出根据本公开所提供的实施方案的与nrcl和na相比在纯化后在ph 8.5下合成的nrh的tlc(图5a)以及纯化后在ph 8.5下合成的nrh的1hnmr(图5b)的一组照片和曲线图；[0022]图6是示出根据本公开所提供的实施方案的在25℃至900℃的范围内在n2气氛下与nrcl相比，nrh的tga热谱曲线的一组曲线图，重量损失与温度的关系(图6a)，衍生物重量损失与温度的关系(图6b)；[0023]图7是示出根据本公开所提供的实施方案的nrh降解动力学研究的一组图表，在黑暗/光照中以及在空气中/n2下储存60天期间水性样品中的nrh回收率(％)(图7a)，在空气中/n2下储存60天期间保持在4℃和25℃的水性溶液中的nrh回收率(图7b)、在25℃下在空气中和n2下储存60天期间ph 5、7和9缓冲液对nrh稳定性的影响(图7c)、在4℃和25℃下储存30天和60天期间水性样品中的nr和nrh回收率(％)(图7d)；[0024]图8是示出nrh在d2o中的1h nmr谱的曲线图；[0025]图9是示出nrh在d2o中的1h nmr谱(在5.00ppm-7.20ppm之间扩展)的一组曲线图；[0026]图10是示出nrh在d2o中的1h nmr谱(在4.11ppm-4.95ppm之间扩展)的一组曲线图；[0027]图11是示出nrh在d2o中的1h nmr谱(在3.09ppm-4.03ppm之间扩展)的一组曲线图；[0028]图12是示出nrh在d2o中的13c nmr谱的曲线图；[0029]图13是示出nrh在cd3od中的1h nmr谱的曲线图；[0030]图14是示出nrh在cd3od中的1h nmr谱(在4.76ppm-7.22ppm之间扩展)的一组曲线图；[0031]图15是示出nrh在cd3od中的1h nmr谱(在3.06ppm-4.12ppm之间扩展)的一组曲线图；[0032]图16是示出nrh在cd3od中的13c nmr谱的曲线图；[0033]图17是示出nrh的ms的曲线图；[0034]图18是示出nrh的选择反应监测(srm)的曲线图；[0035]图19是示出nrh在h2o中的uv-vis谱的曲线图；[0036]图20是示出纯化的nrh的hplc色谱图的一组曲线图，图20a)在220nm处的uv检测器，图20b)在340nm处的uv检测器，以及图20c)荧光检测器；[0037]图21是示出在不同条件下储存60天的nrh水性溶液的hplc色谱图的一组曲线图，图21a)在4℃下，在n2和黑暗下；图21b)在4℃下，在空气和黑暗下；图21c)在25℃下，在n2和黑暗下；图21d)在25℃下，在空气和黑暗下；图21e)在25℃下，在n2和光照下；以及图21f)在25℃下，在空气和光照下；[0038]图22是示出在不同条件下储存60天的nrh水性溶液的hplc色谱图的一组曲线图，图22a)ph＝7.0，在25℃下，在n2和黑暗下；图22b)ph＝7.0，在4℃下，在空气和黑暗下；图22c)ph＝9.0，在25℃下，在n2和黑暗下；以及图22d)ph＝9.0，在25℃下，在空气和黑暗下；并且[0039]图23是示出一些nrh样品的动力学图和一级降解速率的一组图表，图23a，图23b)ph＝7.0，在25℃下，在n2和空气下；图23c，图23d)ph＝9.0，在25℃下，在n2和空气下；图23e，图23f)去离子水，在25℃下，在n2和空气下。具体实施方式[0040]定义[0041]下文提供了一些定义。然而，定义可位于下文的“实施方案”部分，并且以上标题“定义”并不表示“实施方案”部分中的此类公开不是定义。[0042]本文中表示的所有百分数均以占组合物的总重量的重量计，除非另有表示。如本文所用，“约”、“大约”和“基本上”应理解为是指某一数值范围内的数字，例如该所提及数字的-10％至+10％的范围内，优选该所提及数字的-5％至+5％，更优选该所提及数字的-1％至+1％，最优选该所提及数字的-0.1％至+0.1％。本文中的所有数值范围都应理解为包括该范围内的所有整数或分数。另外，这些数值范围应理解为对涉及该范围内任何数字或数字子集的权利要求提供支持。例如，1至10的公开应理解为支持1至8、3至7、1至9、3.6至4.6、3.5至9.9等的范围。[0043]如在本公开和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述(该)”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一种组分”或“所述组分”包括两种或更多种组分。[0044]词语“包括/包含”都将被解释为包含性的而非排他性的。同样地，术语“包括/包含”和“或”都应当视为包含性的，除非上下文明确禁止这一解释。然而，本文所公开的组合物可不含本文未具体公开的任何要素。因此，使用术语“包括/包含”的实施方案的公开内容包括“基本上由所指明的组分组成”的实施方案和“由所指明的组分组成”的实施方案的公开内容。[0045]在“x和/或y”的上下文中使用的术语“和/或”应解释为“x”或“y”或“x和y”。类似地，“x或y中的至少一者”应解释为“x”或“y”或“x和y”。例如，“至少一种连二亚硫酸盐或官能类似的还原剂”应解释为“连二亚硫酸盐”或“官能类似的还原剂”或“连二亚硫酸盐和官能类似的还原剂两者”。[0046]在本文中使用的情况下，术语“示例”和“诸如”(尤其后跟术语的列表时)仅为示例性和例示性，而不应被视为排他性的或全面的。如本文所用，一种病症与另一种病症“相关联”或“有联系”是指病症同时发生，优选意指病症由相同的潜在病症引起，并且最优选意指所鉴定的病症之一由另一个所鉴定的病症引起。[0047]如本文所用，术语“碱性溶液”是指ph大于7.0的溶液。例如，碱性溶液可具有约7.5至约10.0、约7.8至约9.0、约7.9至约8.8、或优选地约8.0至约8.5范围内的ph。本文提及ph时，其值对应于利用标准设备在25℃下测量的ph。[0048]如本文所用，术语“中性ph”是指约7.0的ph。本文提及ph时，其值对应于利用标准设备在25℃下测量的ph。[0049]如本文所用，术语“室温”是指通常用于物理和化学中的温度，即基本上约293k(或约20℃)的温度。[0050]如本文所用，术语“厌氧条件”是指不存在游离氧的条件。[0051]如本文所用，术语“需氧条件”是指存在游离氧的条件。[0052]如本文所用，术语“连二亚硫酸根”是指s2o42-的阴离子。[0053]如本文所用，术语“烟酰胺核糖核苷”或“nr”是指充当烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或nad+的前体的维生素b3的吡啶-核苷形式。烟酰胺核糖核苷或nr具有α-形式或β-形式。例如，烟酰胺核糖核苷或nr的β-形式具有如下的化学结构式i：[0054][0055]如本文所用，术语“碱金属盐”或“碱性盐”是指作为强碱和弱酸的中和产物的盐。当水解时，碱金属盐或碱性盐可形成碱性溶液。碱金属盐或碱性盐的示例可包括金属碳酸盐、金属碳酸氢盐、金属乙酸盐、金属磷酸盐衍生物等等。[0056]如本文所用，术语“高产率”是指合成的总产率为至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。优选地，本公开的高产率为至少50％、至少51％、至少52％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。[0057]如本文所用，术语“高纯度”是指化合物或物质的纯度为至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。优选地，本公开的高纯度为至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。[0058]如本文所用，术语“有效量”是指能够增加(直接或间接)还原产物的产率或增加对1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)的选择性的物质的量。给定物质的最佳量可基于反应条件和其他组分的特性而变化，但可根据给定应用的离散情况容易地确定。[0059]如本文所用，术语“色谱法”是指任何类型的纯化技术，其将感兴趣的化合物与混合物中的其他分子分离(例如通过它们在固体基质和移动相(包括但不限于溶液、缓冲液或溶剂)之间的分配差异)，并且允许感兴趣的化合物被分离。[0060]如本文所用，术语“洗脱液”是指在色谱法过程中用于从固定载体材料移动或洗脱一种或多种物质的溶剂或者两种或更多种溶剂的混合物。在一个实施方案中，极性溶剂诸如甲醇可用作洗脱液以在色谱法过程期间从固定相中洗出nrh。[0061]如本文所用，术语“吸附剂”或“固定相”是指在色谱法过程中以固体形式存在于流体流中的材料。在一个实施方案中，碱性氧化铝和二氧化硅的混合物可在色谱过程期间用作吸附剂。[0062]如本文所用，术语“溶剂”是指能够溶解另一种物质(溶质)的物质。[0063]实施方案[0064]本发明的一方面是由可商购获得的化学品诸如烟酰胺核糖核苷氯化物(nrcl)生产1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)的方法。烟酰胺核糖核苷氯化物(nrcl)是唯一可商购获得的nr衍生物(例如，作为饮食补充剂)。因此，本方法代表了用于生产和商业化1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)的新途径。[0065]申请人惊奇地发现，在液体溶液中用还原剂诸如连二亚硫酸盐还原可商购获得的烟酰胺核糖核苷氯化物(nrcl)可导致1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)的有效形成和生产。申请人还令人惊讶地发现，所得1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)可以通过使用柱色谱法以高产率分离和纯化。[0066]在一方面，本公开涉及由烟酰胺核糖核苷氯化物(nrcl)生产1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)的方法。[0067]图1示出根据本公开所提供的实施方案的由烟酰胺核糖核苷氯化物生产1,4-二氢烟酰胺核糖核苷的示例性方法(100)。[0068]如图1所示，方法100包括在液体溶液中提供烟酰胺核糖核苷氯化物(nrcl)(102)。8.5，优选地8.1)以有效生产nrh。[0083][0084]方案5.通过使用na2s2o4从nr合成nrh的机制。[0085]在整个公开内容中，na2s2o4用作示例性还原剂。也可以使用其他官能类似的还原剂。优选地，还原剂是na2s2o4。[0086]β-烟酰胺核糖核苷氯化物(β-nrcl)与还原剂(诸如na2s2o4)的摩尔比优选地在约1:1和约1:5之间，在约1:1.5和约1:4之间，或者在约1:2和约1:3之间，优选地在约1:2和约1:3之间，更优选地为约1:2.7。[0087]由于na2s2o4的水性溶液在中性ph(例如ph＝7)的需氧条件下不稳定，因此优选地将通过使用na2s2o4的β-烟酰胺核糖核苷氯化物(β-nrcl)的还原反应的液体溶液保持在厌氧和碱性条件下。[0088]例如，可以用惰性气体吹扫液体溶液以去除溶液中的游离氧。惰性气体可以包括氮气(n2)、氩气(ar)等等。在一个实施方案中，使用氮气或氩气作为惰性气体。可在整个还原反应中用惰性气体吹扫液体溶液。[0089]在一个实施方案中，惰性气体包括氮气。在一个实施方案中，仅惰性气体是氮气。[0090]在一个实施方案中，液体溶液包含碱性溶液。在一个实施方案中，液体溶液是碱性溶液。[0091]在一个实施方案中，碱性溶液包含碳酸氢钠(nahco3)。例如，液体溶液可以包括至少一种碱金属盐或碱性盐，诸如碳酸氢钠(nahco3)以形成碱性溶液。在一个实施方案中，唯一的碱金属盐或碱性盐是碳酸氢钠(nahco3)。然而，可任选地使用其他碱金属盐或碱性盐，诸如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钾和类似化合物。[0092]在一个实施方案中，可通过溶液中至少一种碱金属盐或碱性盐的浓度来控制液体溶液的ph值。例如，通过使用1m-1.5m、优选地1.1m-1.4m、更优选地1.2m的nahco3，可将液体溶液的ph值控制在约8.0至约8.5、约8.05至约8.45、约8.07至约8.35、约8.08至约8.29、约8.09至约8.19的范围内，优选地为约8.1。[0093]在一个实施方案中，方法100包括将nahco3溶液的ph值维持在8.0-8.5之间。在一个实施方案中，方法100包括将nahco3溶液的ph值维持在约8.0和约8.5之间。在一个实施方案中，方法100包括将nahco3溶液的ph值维持为约8.1。[0094]在一个实施方案中，nahco3溶液具有约1.0m至约1.5m的浓度。在一个实施方案中，nahco3溶液具有约1.2m的浓度。[0095]在一个实施方案中，还原剂(诸如na2s2o4)可以在惰性气体气氛下在第一温度下逐渐添加到β-烟酰胺核糖核苷氯化物(β-nrcl)的液体溶液中。在一个实施方案中，可以将还原剂(诸如na2s2o4)预先溶解在溶剂(诸如水)中，并且还原剂(诸如na2s2o4)的溶液可以在第一温度下在惰性气体气氛下滴加到β-烟酰胺核糖核苷氯化物(β-nrcl)的液体溶液中。[0096]在一个实施方案中，第一温度是低温，诸如约0℃(例如，通过使用冰水控制)使得还原反应可在还原剂(诸如na2s2o4)的添加期间被控制。[0097]返回图1，在添加还原剂(诸如na2s2o4)之后，方法100可包括使连二亚硫酸盐与烟酰胺核糖核苷氯化物(nrcl)在液体溶液中在第二温度下反应以形成混合物，其中混合物的一部分是1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)(106)。[0098]因此，液体溶液的温度优选地从第一温度升高到第二温度。在第二温度下，液体溶液中的烟酰胺核糖核苷氯化物(nrcl)可与还原剂(诸如na2s2o4)完全且有效地反应以形成1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)。在一个实施方案中，第二温度是室温。[0099]在室温下，还原剂(诸如na2s2o4)和β-烟酰胺核糖核苷氯化物(β-nrcl)可以连续且完全地反应以形成混合物，其中混合物的至少一部分是1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)。[0100]在一个实施方案中，还原剂(诸如na2s2o4)和β-烟酰胺核糖核苷氯化物(β-nrcl)之间还原反应的进程可以通过使用色谱法技术来监测。例如，如图2a所示，β-nrcl、nrh和烟酰胺的所有化合物(na；来自nrh的降解产物；参见方案6)在254nm波长下是可见的。然而，在365nm的波长下，仅nrh可见。通过监测对应于起始材料β-nrcl和所得产物nrh的峰的密度和位置，可以确定还原剂(诸如na2s2o4)和β-烟酰胺核糖核苷氯化物(β-nrcl)之间还原反应的进程。[0101]在还原剂(诸如na2s2o4)和β-烟酰胺核糖核苷氯化物(β-nrcl)之间的还原反应完成后，可以干燥所得混合物以获得混合物的固体。在一个实施方案中，可将所得混合物冷冻干燥以获得混合物的黄色固体。[0102]在本公开的另一个方面，公开了用于获得高纯度的所得nrh的纯化方法。申请人令人惊讶地发现，所得1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)可以通过使用柱色谱法以高产率分离和纯化。以下实施例提供了通过使用柱色谱法的详细示例性纯化方法(例如，使用碱性氧化铝和二氧化硅的混合物作为吸附剂)。[0103]在一个实施方案中，可使用色谱方法从混合物中分离所得的nrh。例如，基于化合物对吸附剂的不同吸附，柱色谱法可用于从β-nrcl或其他杂质中分离nrh；化合物以不同速率移动通过柱，从而允许它们被分离成级分。[0104]在一个实施方案中，柱色谱方法使用醇作为其洗脱液。在一个实施方案中，洗脱液包含甲醇。在一个实施方案中，唯一的洗脱液是甲醇。然而，其他溶剂(诸如甲醇和乙醇的混合物)可任选地附加地或另选地用作洗脱液。[0105]在一个实施方案中，柱色谱法的吸附剂至少包含碱性氧化铝和二氧化硅。在一个实施方案中，碱性氧化铝和二氧化硅是柱色谱法的唯一吸附剂。[0106]碱性氧化铝和二氧化硅的重量比可以在约1:10和约10:1之间，在约1:9和约9:1之间，在约1:8和约8:1之间，在约1:7和约7:1之间，在约1:6和约6:1之间，在约1:5和约5:1之间，在约1:4和约4:1之间，在约1:3和约3:1，或者在约1:2和约2:1之间，优选地为约2:3。[0107]在实施方案中，柱色谱法纯化方法可以例如以2:3的重量比使用碱性氧化铝与二氧化硅，以便以至少70％、至少72％、至少75％、至少77％、至少80％、至少83％、至少85％、至少87％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％或至少98％、优选地至少96％的纯度分离nrh。[0108]在一个实施方案中，通过使用碱性氧化铝和二氧化硅的柱色谱法纯化方法可以去除混合物中至少90％、至少95％、至少99％、至少99.9％或至少99.999％的未反应的nrcl。在优选的实施方案中，通过使用碱性氧化铝和二氧化硅的柱色谱法纯化方法可以从混合物中未反应的nrcl中完全纯化nrh产物。[0109]在一个实施方案中，如实施例中所证实的，申请人的结果显示单独在二氧化硅或碱性氧化铝上的柱色谱法在从nrh分离nr方面不是有效的。因此，碱性氧化铝和二氧化硅的混合物可能是柱色谱法的必需的吸附剂。[0110]碱性氧化铝(作为在其上具有许多羟基基团的极性表面)可以推测在一定程度上将nr与nrh物理分离(通过它们的极性差异)。此外，因为碱性氧化铝在其表面上具有负电荷并且nr具有正电荷，所以碱性氧化铝可以充当阳离子交换树脂以将nr固定在碱性氧化铝的表面上。[0111]可以认为这是为什么氧化铝与二氧化硅相比是用于纯化nrh的更好的固定相的主要原因。然而，申请人发现在柱色谱法中纯化nrh期间，碱性氧化铝将堵塞并导致非常慢的流速，这导致nrh的降解。[0112]在一个实施方案中，本方法的nrh的总产率可以是至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％、优选地至少55％。[0113]在一个实施方案中，在液体溶液中生产nrh的本方法的产率比固态方法的产率显著更高。例如，在液体溶液中生产nrh的本方法产生的产率比固态方法的产率高至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少120％、至少140％、至少160％、至少180％、至少200％、至少220％、至少240％、至少260％、至少280％、至少300％、至少320％、至少340％、至少360％、至少380％、至少400％、至少420％、至少440％、至少460％、至少480％、至少500％或至少600％。[0114]以下实施例提供了以约15％至约17％的产率生产nrh的详细示例性固态方法。[0115]如实施例中所示，根据本公开的某些实施方案，生产和纯化nrh的示例性的基于溶液的方法证实了在约42％至约55％范围内的产率。[0116]因此，在液体溶液中生产nrh的本方法可以产生比示例性固态方法的产率高至少267％的产率。[0117]在另一个方面，本公开涉及由本文所讨论的方法生产的nrh的稳定性。[0118]在一个实施方案中，所产生的一定百分比的nrh将水解以形成1,4-二氢烟酰胺(dhna)。如图5a的方案中所示，1,4-二氢烟酰胺(dhna)可能在反应过程期间通过nrh的水解形成(例如，ph＝8.5)。[0119]如图2所示，当ph＝8.1时，仅存在痕量峰，对应于纯化的nrh的1hnmr中的na。这表明在形成na的反应过程期间只有痕量的nr水解(参见方案6)。[0120]在一个实施方案中，可以操纵生产nrh的方法的液体溶液的ph值以控制该方法的反应速率以及nrcl的起始材料和nrh产物两者的水解。[0121]例如，通过将ph从8.1增加到8.5，反应速率明显降低，并且随后副反应的可能性增加，诸如nr和nrh的水解。[0122]在一个实施方案中，约8.1的ph值可能是优选的，以提高还原的反应速率，同时降低副反应的可能性，诸如nr和nrh两者的水解。[0123]在一个实施方案中，为了减少反应时间，用于生产nrh的反应的ph可能必须调节到使na和dhna的形成最小化。例如，na和dhna的这些副产物的延迟因子(rf)值接近nrh的rf值。因此，na和dhna不能通过普通柱色谱法从nrh产物中分离出来(参见图5a)。优选的实施方案中，用于产生nrh的反应的ph可被调节至约8.1。[0124]在一个实施方案中，nrh在氮气气氛下比nrcl更热稳定。图6a和图6b显示，尽管nrh和nr分别在约218℃和910℃显示出其最大的重量损失，但nrh在该温度下仅显示出约50％的重量损失，而nrcl在该温度下显示出约65％的重量损失。nrh显示了另一个不同的重量损失，在约800℃处具有峰，这促成了30％的重量损失。[0125]在一个实施方案中，nrh在空气的存在下可能易于氧化，并且nrh在n2气氛下可能比在空气的存在下更稳定，如图7中所示。此外，纯nrh(作为粉末)在密封管中在冰箱中可以稳定几个月而没有任何降解。[0126]在一个实施方案中，如图7c和图22中所示，nrh产物在ph 5下可在不到一天内完全降解，而在ph 7的乙酸铵缓冲液中制备的nrh产物可以显示nrh浓度从第一天的约70％线性降低至第30天的约2％。[0127]此外，在ph 9的碳酸盐缓冲液中制备的nrh产物在空气中(例如，在60天后测量的约45％降解)和在n2下(例如，在60天后测量的约42％降解)可以是空气稳定的。[0128]在一个实施方案中，水性溶液中的nr可以是非常稳定的，在60天后没有可检测的降解，而储存在空气中的水性溶液中的nrh可以在30天和60天后分别显示9％和10％的降解。[0129]在一个实施方案中，在n2覆盖层下储存的水性溶液中的nrh可以是相当稳定的，在储存60天后没有可检测的降解。[0130]实施例[0131]以下非限制性实施例提供了开发和支持用于由烟酰胺核糖核苷氯化物生产1,4-二氢烟酰胺核糖核苷的方法和过程的概念以及相关纯化和稳定性研究的科学数据。[0132]在本工作中，描述了用于从可商购获得的烟酰胺核糖核苷氯化物(nrcl)并且在存在连二亚硫酸钠作为还原剂的情况下合成和纯化1,4-二氢烟酰胺核糖核苷(nrh)的有效方法。该方法是潜在可规模化的。nrh作为最有效的合成nad+前体是工业上相关的。[0133]据证明，固相合成不能用于以高产率将nrcl还原为nrh，而在室温下在厌氧条件下在水中的还原反应显示出非常有效、达到55％的分离产率。第一次，通过使用普通的柱色谱法，能够以良好的产率高度纯化这种敏感的生物化合物。对纯化的样品进行一系列鉴定和分析，包括hplc、nmr、lc-ms、ftir和uv-vis光谱，确认nrh的结构以及其纯度为96％。nrh的热分析显示出比nrcl更高的热稳定性，并且具有两个主要的重量损失，一个在218℃下，另一个在805℃下。还研究了温度、ph、光和氧气(作为空气)对水性溶液中的nrh的长期稳定性影响。结果显示nrh可以在氧气的存在下被氧化，并且它在酸性条件下快速水解。还发现，在n2气氛下、在较低温度下以及在碱性ph中降解速率较低。[0134]实验部分[0135]材料.nr氯化物(β形式)是来自chromadex company的礼物。连二亚硫酸钠购自vwr，碳酸氢钠购自aldrich，硅胶(p60，40μm-63μm，)购自silicycle，并且碱性氧化铝(50μm-200μm，ph 8)购自acros。甲醇(99.9％，acs认证，fisher)、丙酮(99.8％，acs认证，fisher)、氢氧化钠(acs认证，fisher chemical)、己烷(≥98.5％，gr acs)、乙酸乙酯(etoac，》99.9％，acs认证)和硅胶60f254涂覆的铝背衬tlc片购自emd millipore,billerica,ma,usa。氘化水和二甲基亚砜(dmso-d6，d，99.9％)购自cambridge isotope laboratories,inc。[0136]表征.使用500nmr(bruker inova)光谱仪在氘化水中制备1h和13c-nmr谱。通过收集分辨率为8cm-1的128次扫描，在shimadzu iraffinity-1s分光光度计上记录傅里叶变换红外光谱(ftir)。在shimadzu uv-2600分光光度计上记录nr和nrh溶液的uv-vis光谱。使用ta q100仪器，在n2流下以10℃min-1的温度速率在20℃-900℃范围内制备热重分析(tga)热谱曲线。使用配备有binary sl泵和二极管阵列检测器和shodex ri-501折射率检测器(单通道)的agilent 1200lc系统进行高效液相色谱法(hplc)测量。反相hplc在discovery c18柱上进行，(孔径)，直径为5μm，尺寸为250×4.6mm。乙酸铵(20mm)用作移动相，在25℃下30分钟或45分钟内流速为1.0ml min-1。在测量之前，使用具有0.22μm孔径的13mm尼龙注射过滤器过滤所有样品。对于lc-ms分析，使用与质谱仪耦接的lc(agilent 1100系列)。反相色谱法与phenomenex luna omega(phenomenex)lc柱一起使用，规格如下：100×4.6mm，3μm，极性c18，孔径，流速为0.3ml min-1。lc洗脱液包括20mm乙酸铵(溶液a)和乙腈(溶液b)，使用梯度洗脱(溶液a:b组成随时间变化：0分钟：95:5，3分钟：95:5，15分钟：85:15，17分钟：90:10，以及20分钟：95:5)。质谱仪(finnigan ltq质谱仪)配备有电喷雾接口(esi)，其设定为正电喷雾电离模式，用于分析nrh。优化的参数为：鞘气流速为20个任意单位，喷雾电压设定为4.00kv，毛细管温度为350℃，毛细管电压为41.0v，并且管透镜设定为125.0v。[0137]从β-烟酰胺核糖核苷氯化物合成1,4-二氢烟酰胺核糖核苷[0138]将0.5g nrcl(1.72mmol)和20ml nahco3溶液(1.2m)添加到具有磁力搅拌棒的圆底烧瓶中。将该系统置于冰浴中，清除氧气，并保持在氮气下。然后，将0.80g连二亚硫酸钠(4.60mmol)逐渐添加到反应混合物中。在添加na2s2o4之后，将烧瓶从冰浴中取出，并且随后在室温下再进行反应三小时。将反应混合物冷冻干燥以获得黄色固体。最后，分别使用重量比为2:3的碱性氧化铝和二氧化硅的混合物，使用甲醇作为洗脱液，通过柱色谱法纯化残余物。在室温下通过旋转蒸发器移除多余的甲醇以获得浅黄色粘性固体，接下来通过添加乙酸乙酯将该固体转化为黄色粉末(沉淀物)。最后，将分离的产物用n-己烷洗涤并在室温下减压干燥以便以55％产率获得纯nrh(0.24g)。1h nmr(500mhz，d2o)，δppm：7.19(s，1h)，6.14(dd，j1＝8.2hz，j2＝1.5hz，1h)，5.05-5.02(m，1h)，4.92(d，j＝7hz，1h)，4.24(t，j＝5.5hz，1h)，4.18-4.16(m，1h)，4.03-3.99(m，1h)，3.79(dd，j1＝12.5hz，j2＝3.5hz，1h)，3.73(dd，j1＝12.5hz，j2＝5.0hz，1h)，3.11(s，2h)(图8至图11)。13c nmr(125mhz，d2o)，δppm：173.03，137.92，125.32，105.30，101.05，95.01，83.62，71.06，70.24，61.64，22.09(图12)。另外，纯化的nrh在cd3od视觉中的1hnmr和13c nmr谱在支持信息部分中(图13至图16)，其中ms:实测m/z＝257.18(m+1)。计算c11h17n2o5(m+1):257.11(图17和图18)。uv(h2o中的λmax):338nm(图19)。[0139]由nrcl固态合成nrh[0140]在第一步骤中，为了降低反应过程期间nrh的水解，在无溶剂环境中建立还原反应。使用sio2作为固体载体以增加反应发生的表面。在该程序中，将sio2(0.25g)、nrcl(0.1g，0.34mmol)、na2s2o4(0.2g，1.15mmol)、nahco3(0.25g)置于研钵中并研磨5分钟以获得均匀的粉末。然后，将1ml去离子水滴加到反应混合物中，并且将反应在室温下研磨10分钟(表1，条目1)。应当提及的是，在不使用固体载体的情况下，反应混合物变得较粘并且不容易研磨。在研磨后，用meoh萃取产物并通过tlc(薄层色谱法)跟踪反应进程。结果显示痕量的nrh是不能分离和纯化以进一步鉴定的一种产物。假设在不存在足够的水的情况下，亚磺酸盐中间体不能被质子化以产生亚磺酸中间体并且然后产生nrh作为产物(方案5)。为了检验这种假设，用另选最终步骤重复该程序。最后，将反应混合物转移到具有磁力搅拌棒的圆底烧瓶中，添加8ml nahco3溶液(1m)，并使反应在室温下继续进行30分钟。然后，将反应混合物冷冻干燥并通过柱色谱法在碱性氧化铝和二氧化硅的混合物中使用甲醇作为洗脱液纯化残余物。以15％的产率获得分离的nrh(表1，条目3)。通过改变固体载体(al2o3代替sio2)，没有观察到产物产率的显著提高(表1，条目2，4)。[0141]在环境条件下工作的能力是该程序的优点，但是产物的低产率是严重的缺点。因此，在寻找高产率的生产方法时，决定在厌氧条件下在水性溶液中进行反应(表1，条目5-9)。[0142]表1.在不同条件下从nrcl合成nrh。[0143][0144]a将nrcl(0.1g)、na2s2o4(0.2g)、碱和固体载体置于研钵中并研磨。[0145]b将nrcl(0.1g)、na2s2o4(0.2g)、碱和固体载体置于研钵中并研磨15分钟，然后将所有反应混合物添加到8ml的nahco3(1m)溶液中并搅拌30分钟。[0146]c nrcl(0.5g)和na2s2o4(0.8g)的反应在20ml nahco3(1.2m)溶液中在n2气氛下在ph 8.1下进行。[0147]d nrcl(0.5g)和na2s2o4(0.8g)的反应在20ml nahco3(1.2m)和0.2g的na2co3的溶液中在n2气氛下在ph 8.5下进行。[0148]e产率是指分离的纯产物。[0149]f基于1h nmr，产物含有12％的二氢烟酰胺杂质。[0150]结果与讨论[0151]在本研究中，引入了通过使用可商购获得的β-nrcl来规模化合成nrh的直接程序。该反应在nahco3和na2s2o4的水性溶液中在氮气氛下进行(方案4)。开发了从反应混合物中纯化nrh的快速柱色谱方法，其产生96％的纯度。由于nrh的主要应用之一是在补充饮料中，还研究了温度、光、ph和氧气对nrh在水性溶液中的稳定性的影响，并将这些结果与nr在类似条件下的稳定性进行比较。[0152]最重要的参数之一是ph，其直接影响nrh合成反应和nrh产物。在反应过程期间调节和保持恒定的ph是重要的。通过回顾反应的机制可以更好地理解这个问题(方案5)。na2s2o4的水性溶液在ph＝7下在需氧条件下是不稳定的。因此，该反应必须在厌氧和碱性条件下进行。首先，nr和s2o42-之间的反应导致亚磺酸盐中间体的形成，其在碱性条件下是稳定的。通过质子化该化合物，形成其亚磺酸衍生物。该亚磺酸中间体在环境条件下是不稳定的并且经由so2离开而转化成nrh。因此，重要的是找到并建立不仅将稳定na2s2o4而且还将质子化磺酸盐中间体以产生nrh的ph。此外，由于nrh在其结构中具有n-糖苷键，因此其易于水解。因此，在整个反应过程期间必须调节ph并精确地保持该ph，使得nrh不水解。[0153]稳定na2s2o4水性溶液而不降低其作为还原剂的活性的最低ph在8.0-8.5之间。最初，通过采用nahco3溶液(1.2m)将反应设定在ph 8.1。接下来，将nrcl溶解于该溶液中，并且在氮气气氛下、在0℃下将na2s2o4逐渐添加到反应混合物中。通过向溶液中添加na2s2o4，并且在其整个氧化过程中，ph降低。然而，浓度为1.2m的碳酸氢钠溶液足以在反应过程期间保持ph恒定。在添加na2s2o4后，反应在室温下进行3小时。然后，将混合物冷冻干燥以获得黄色固体。最后，通过短柱色谱法使用碱性氧化铝和二氧化硅的混合物(甲醇作为洗脱液)纯化残余物，以便以55％产率获得纯nrh产物(表1，条目7)。nrcl与na2s2o4之间的最佳摩尔比为1比2.7，并且连二亚硫酸钠的量的增加没有提高产物产率(表1，条目8)。在纯化粗产物后，用纯化的nrh进行薄层色谱法(tlc)，使用甲醇作为洗脱液，并与原始nrcl和烟酰胺(na)进行比较(图1a)。所有化合物在254nm的波长下都是活性的。然而，通过将波长转换到365nm，发现仅nrh发荧光。据报道，nrh在340nm附近具有强荧光。因为nrh和na的rf值几乎相同，所以nrh的荧光特性有助于在tlc期间识别该化合物的准确位置。如图1a所示，纯化的nrh在tlc板上显示出高纯度。[0154]研究了合成和纯化的nrh的ft-ir谱并将其与原始nrcl的光谱进行比较(图2b)。在nrh的ft-ir谱中，在1643cm-1处的特定峰的存在可以归因于c＝c带的伸缩振动，并且证实了nr吡啶鎓环的还原。在3340cm-1和3209cm-1处的两个峰是指nrh结构中nh2基团的不对称和对称拉伸带，这暗示了在反应过程期间酰胺基团是完整的。在1685cm-1处的尖峰表明酰胺基团的拉伸c＝o带。在2920cm-1和2840cm-1处的两个峰证实了nrh结构的核糖和二氢烟酰胺环两者中的脂族c-h的拉伸振动。在nrh的结构中羟基基团的存在被证实具有在3500cm-1至3000cm-1范围内出现的宽峰。[0155]为了进一步确保nrh的成功合成及其纯度，还在氘化水中取纯化的nrh的1hnmr和13cnmr谱。不可与d2o交换的十一个质子的存在完全证实了合成的nrh的结构(图3)。每个质子的化学位移和对应的偶联常数与先前在科学文献中报道的一致。13cnmr和更多细节在图12中给出。[0156]为了研究用于纯化nrh的柱的功效，比较了纯化的nrh的1hnmr与纯nrcl和na的1hnmr(图4)。反应混合物中的主要杂质是未反应的nr，并且在纯化后，在纯化的nrh的1hnmr谱中没有观察到特定的nr峰。通过比较nrh谱与na谱，发现仅存在痕量峰，因此在纯化的nrh的1hnmr中指示na。这表明在形成na的反应过程期间只有痕量的nr水解。还使用反相色谱法hplc来进一步确认nrh样品的纯度(图20)。hplc发现与1hnmr数据一致，并且显示nrh的纯度为96％，并且na的杂质为4％。有趣的是，用hplc没有检测到nr，但是nr与1hnmr一起存在。这意味着在碱性氧化铝和二氧化硅的混合物上的柱色谱法是非常有效的并且能够从剩余的nrcl中完全纯化nrh产物。[0157]接下来，尝试使用二氧化硅上的柱色谱法并使用甲醇作为洗脱液来纯化粗nrh。结果显示单独在二氧化硅上的柱色谱法在从nrh中分离nr方面不是有效的。碱性氧化铝，作为其上具有许多羟基基团的极性表面，可以适度地将nr与nrh物理分离(通过它们极性的不同)。此外，因为碱性氧化铝在其表面上具有负电荷并且nr具有正电荷，所以它可以充当阳离子交换树脂以将nr固定在其表面上。据信这是为什么氧化铝与二氧化硅相比是用于纯化nrh的更好的固定相的主要原因。然而，发现在柱色谱法中纯化nrh期间，碱性氧化铝将堵塞并导致非常慢的流速，这导致nrh的降解。采取步骤通过分别以2:3的重量比混合碱性氧化铝与二氧化硅来容易地解决该问题。因此，首次可以在制备模式(不使用hplc)下，在碱性氧化铝和二氧化硅的混合物上使用普通柱色谱方法，同时使用甲醇作为洗脱液来定量纯化nrh。[0158]接下来，通过采用nahco3和na2co3的溶液在ph 8.5下建立nrcl还原反应(表1，条目9)。将nrcl溶解于该溶液中，然后在氮气气氛下、在0℃下将na2s2o4逐渐添加到反应混合物中。在添加na2s2o4之后，反应在室温下进行15小时。在反应完成后(随后进行tlc)，将混合物冷冻干燥以获得黄色固体。最后，使用甲醇作为洗脱液在碱性氧化铝上通过短柱色谱法纯化残余物。作为定性测试，从该纯化的nrh进行tlc，并使用甲醇作为溶剂与nr和na进行比较(图5a)。结果显示，获得的nrh在柱色谱法后不是纯的。此时，观察到新的杂质被定位成在tlc上仅略高于nrh。我们的观察有助于解释为什么这种污染不能通过普通柱色谱法从nrh中分离。有趣的是，这种新杂质的荧光性质类似于nrh，导致它们两者在tlc上在365nm处发荧光。通过研究文献，发现可能在反应过程期间通过nrh的水解形成1,4-二氢烟酰胺(dhna)。[0159]为了进一步证明，取得该样品在d2o中的1hnmr(图5b)。所获得的结果表明在该样品中不存在残余nrcl。然而，在7.5ppm-9ppm之间存在四个低强度的峰证实了在纯化的nrh中存在痕量的na。如图5b所示，在7.19ppm、6.14ppm、5.03ppm和3.11ppm处的四个主峰强烈地证实了nrh结构中的1,4-二氢烟酰胺环。在主峰中的每个主峰的右侧，存在具有较低强度的峰，并且形状类似于对应的主峰。这些峰的化学位移分别为7.12ppm、6.05ppm和4.98ppm。每个峰的积分约为0.12，并且每个主峰的积分为0.89。[0160]这些结果表明约12％的dhna存在于纯化的nrh中。换句话说，这意味着通过提高ph，反应速率降低并且nrh在反应条件下在15小时内被水解。显然，通过水解nrh，同时形成d-核糖和dhna。如图5b所示，在5.19ppm和5.10ppm处的对应杂质峰分别归因于d-核糖的α端基异构质子和β端基异构质子。核糖的其他杂质峰出现在3.65ppm和4.65ppm之间。[0161]通过将ph从8.1增加到8.5，反应速率明显降低，并且随后副反应的可能性增加，诸如nr和nrh的水解。[0162]这些观察与nr还原成nrh的反应机制一致，如方案5所示。在该机制中，反应涉及亚磺酸盐中间体，其在碱性条件下是稳定的，并且因此不容易质子化以产生nrh。在nrh合成过程中，硫代硫酸根和亚硫酸氢根阴离子作为连二亚硫酸盐的水解和氧化的产物形成。这些具有高亲核性的阴离子可攻击nrh结构中的碳1’并取代dhna。这将间接增加nrh水解的速率。通过提高ph，nrh水解的可能性降低，而同时充当亲核试剂的一些阴离子的存在可以增加nrh水解。这些阴离子对nrh的水解更严重，并且增加了nrh合成的反应时间。因此，作为最重要的参数，必须调节反应的ph以使na和dhna的形成最小化以减少反应时间。这是非常重要的因素，因为这些副产物的rf值接近于nrh的rf值；因此，它们不能通过普通柱色谱法从nrh产物中分离出来(图4a)。在本工作中，发现从nr合成nrh的最佳ph是8.1；在该ph(8.1)下，没有观察到任何dhna并且na的量是可忽略的。[0163]由于工业加工经常需要高温，热稳定性对于具有用于食品的潜力的药物和补充剂是非常重要的。为了研究nrh的热稳定性，对纯nrh从25℃至900℃进行了tga并且将结果与原始nrcl进行比较。图6示出对于nrh和nrcl在25℃-900℃范围内的tga热谱曲线。如在图6a和图6b中可见，nrh明显比nrcl更热稳定。尽管nrh和nr分别在约218℃和910℃显示出其最大的重量损失，但nrh在该温度下仅显示出约50％的重量损失，而nrcl在该温度下显示出约65％的重量损失。nrh显示了另一个不同的重量损失，在约800℃处具有峰，这促成了30％的重量损失。这些结果证实nrh与nrcl相比在氮气气氛下更热稳定。这可能是由于nrcl结构中存在氯离子，当温度升高时该氯离子可以以hcl的形式离开。[0164]nrh和nr水性溶液的稳定性研究[0165]在脱氧去离子水中制备新鲜合成和纯化的nrh(10,000ppm)的储备溶液。该储备溶液用于制备用于稳定性测量的1000ppm nrh溶液。在60天的储存周期期间研究光、ph(缓冲液)、温度和氧气(作为空气)的影响。使用hplc测量剩余的nrh浓度。该程序也用于nr稳定性测量，并且将结果在相同条件下与nrh样品进行比较。[0166]nrh在不同条件下的稳定性的研究[0167]nrh由于其n-糖苷键是不稳定的敏感分子，并且在暴露于高温、亲核试剂和氧气期间可经历降解、水解和氧化。这些nrh降解反应的主要产物中的一些主要产物在方案6中示出。在不同条件变量下研究nrh降解对于开发新的补充剂或潜在的饮料产品是重要的。此处，研究了光、温度、氧气和ph对水性溶液中新鲜合成和纯化的nrh在60天的周期期间的降解速率的影响。[0168][0169]方案6.nrh的降解产物包括水解和氧化。[0170]氧气和光的影响[0171]作为二氢烟酰胺衍生物的nrh的氧化敏感性是众所周知的。作为nr的还原形式，nrh具有高氧化电位。为了研究空气以及环境光对nrh在水性溶液中的稳定性的影响，在空气中和n2覆盖层下以及在黑暗和环境光中制备了新鲜纯化的nrh(通过柱色谱法)在去离子水中的溶液。在60天的过程中通过hplc监测nrh浓度。图7a示出基于样品在黑暗/光照中和在空气中/在n2下的hplc结果的在60天储存期间的nrh回收率(％)。[0172]从图7a中所示的结果明显的是，虽然与保存在黑暗中的样品相比，光对nrh稳定性的影响可以忽略不计，但氧气(作为空气)对nrh的稳定性有显著影响。在25℃下在去离子水中在黑暗中保存的样品显示出更快的降解，在空气下60天内达到50％。相比之下，在保持在n2覆盖层下的相同条件下，对于样品观察到约27％的降解。这些发现表明nrh在空气存在下易于氧化。[0173]温度的影响[0174]温度可对具有n-糖苷键的分子的稳定性具有深远影响。nr分子降解是温度依赖性的，遵循一级动力学规则。这最可能是由于n-糖苷键解离的敏感性，因为烟酰胺(na)是良好的离去基团。然而，nrh的离去基团是二氢烟酰胺(dhna)并且nrh不是离子的(环中的氮不具有正电荷)。因此，可以预期，就n-糖苷键由于温度的自发解离而言，nrh应当比nr分子更稳定。然而，nrh的氧化降解也对其稳定性起重要作用，如在先前部分中所显示的。[0175]研究了nrh在空气中和在n2覆盖层下在两个不同温度下的稳定性。图7b示出在储存60天期间保持在4℃和25℃的水性溶液中nrh的回收率的结果。图21示出样品中的一些样品在储存60天内的对应hplc色谱图。这些结果证实了nrh在25℃下比在4℃下更快地降解，并且还显示了空气在25℃下对nrh的氧化降解的加速效果。在4℃下在n2覆盖层下保存的样品在储存60天后没有显示任何可检测的降解，而在4℃下在空气中的样品在60天内显示约10％降解。对于25℃下的样品，在n2气氛下降解为约27％，并且在储存60天后在空气中降解为约50％。纯nrh(作为粉末)在密封管中在冰箱中稳定几个月而没有任何降解。[0176]ph(缓冲液)的影响[0177]nr分子的解离降解是与ph无关的。nrh分子显示出在碱性介质中相对较好的稳定性(如在结果和讨论中所强调的)，以及在10小时的监测周期期间在酸性条件下的快速降解研究了分别使用柠檬酸盐缓冲液、乙酸铵缓冲液和碳酸盐缓冲液制备的ph 5、7和9对nrh在水性溶液中的稳定性的影响，该水性溶液在25℃下在空气中和在n2下以及在黑暗中保存60天的周期(图7c和图22)。来自图7c的结果证实nrh在ph 5下在不到一天内完全降解，而在ph 7的乙酸铵缓冲液中制备的样品显示nrh浓度从第一天的约70％线性降低至第30天的约2％。然而，在ph 9的碳酸盐缓冲液中制备的样品在空气中(60天后测量的约45％降解)和在n2下(60天后测量的约42％降解)均显示出相当的稳定性，这与来自其他的短期数据一致。[0178]比较图7c(25℃，ph 7，空气和n2)与图7b(25℃，去离子水)，清楚的是nrh在ph 7下的快速降解是由于用于制备缓冲液的乙酸铵盐。一些阴离子诸如氯离子和乙酸根的存在加速了nrh向nr的氧化，因为在该氧化过程中作为nr的反离子的阴离子的存在是必要的。此外，乙酸根离子可充当亲核试剂并加速nrh水解。通过消耗乙酸根阴离子，铵与乙酸根的比率增加，并且通过该额外量的铵的水解，溶液逐渐变成酸性并且nrh水解速率增加。因此，可以说，当在ph 7.0使用由乙酸铵产生的缓冲液时，对于nrh的降解存在协同效应。[0179]nrh降解速率的动力学曲线图基于在具有相当快降解速率的样品的60天储存期间收集的hplc数据。图23示出在ph 7.0下、在25℃下、在n2和空气下储存的nrh样品(图23a和图23b)，在ph 9.0下、在25℃下、在n2和空气下储存的样品(图23c和图23d)以及保存在去离子水中、25℃下、n2和空气下的nrh样品(图23e和图23f)的动力学曲线图和一级降解速率。在25℃下保存在空气下的去离子水中的样品的降解速率为1.27×10-7s-1，其对应于63天的半衰期。相比之下，对于保存在25℃下在去离子水中在n2下的nrh样品，降解速率为5.90×10-8s-1，这对应于136天的半衰期(图23)。[0180]nrh与nr在水性溶液中的稳定性的比较[0181]nrh是nr的还原形式并且具有高得多的生物活性。然而，必须比较nr与nrh的稳定性。如果nrh不如nr稳定，则后者可用于更多应用。此处，比较了nr和nrh在水性溶液中的稳定性。由于nr在水性溶液中的稳定性与ph无关，研究了nr和nrh在去离子水中在4℃和25℃下在60天周期内的稳定性。图6d比较了30天和60天的该研究结果。[0182]从图7d的结果可以清楚地看出，在4℃下，水性溶液中的nr非常稳定，在60天后没有可检测的降解。然而，储存在空气中的水性溶液中的nrh在30天和60天后分别显示出9％和10％的降解，而储存在n2覆盖层下的水性溶液中的nrh相当稳定，在储存60天后没有可检测的降解。另一方面，保存在25℃(代表环境温度)下的nr溶液在储存30天和60天后显示出48％和68％的降解，而这种降解对于保存在空气下30天和60天后的nrh溶液而言分别是36％和50％，对于保存在n2下30天和60天后的nrh溶液而言分别是13％和27％。这清楚地表明在水性溶液中nr的热降解比nrh更严重，并且远离空气储存nrh改善了它的稳定性。[0183]结论[0184]开发了从可商购获得的nrcl合成和纯化nrh的方便、有效和可规模化的程序。在本方法中，在不同条件下使用连二亚硫酸钠作为还原剂。虽然需氧固相合成不能提供高产率，但在ph＝8.1下在碳酸氢钠(1.2m)溶液中的厌氧合成在3小时反应时间后达到约55％产率。第一次，通过使用具有碱性氧化铝的短的普通柱色谱法进行纯化过程。发现反应ph的影响是非常关键的，并且优化为8.1。在整个反应中保持该ph是必要的。据显示从ph＝8.1到ph＝8.5的增加导致反应时间的增加和一些显著的副反应，包括nrh水解成核糖和二氢烟酰胺。nmr、ftir、lc-ms、uv-vis和hplc证实了通过该方法合成的nrh的结构以及高纯度。为了研究温度、ph、光和氧气(空气)对水性溶液中nrh降解的影响，进行了长期稳定性研究。结果显示nrh在氧气的存在下被氧化，并且它在酸性条件下快速水解。降解速率在n2气氛下、在较低温度下并且在碱性ph下较低。[0185]应当理解，对本文该的实施方案作出的各种变化和修改对于本领域的技术人员将是显而易见的。可在不脱离本发明主题的实质和范围且不减弱其预期优点的前提下作出这些变化和修改。因此，此类变化和修改旨在由所附权利要求书涵盖。









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