一种壳聚糖与碳酸盐矿化菌协同高效除锰的方法 专利技术说明

环保节能,再生,污水处理设备的制造及其应用技术1.本发明涉及环境废水处理技术领域，具体涉及一种壳聚糖与碳酸盐矿化菌协同高效除锰的方法。背景技术：2.锰是人体必需的微量元素，其工业应用广泛，但过量的锰暴露会引起多种生物急性中毒，危害人类神经系统，甚至致癌致畸。如贵州省铜仁市早期的锰矿开发导致下游河水严重污染，威胁十万人饮水安全，因此治理锰污染迫在眉睫。当前，常用的重金属污染修复方法像植物修复、污染物化学浸出法、生物吸附等费用昂贵且不能长期成功，其他方法像添加化学固定剂，虽效果快但容易造成二次污染等。鉴于重金属污染常常涉及面积很大，各种工程修复措施成本过高，因此发展低成本的锰污染原位修复技术是很好的选择。3.目前，对锰污染的微生物修复已有很多相关报道。中国专利cn115213217a公开了一种适用于土壤重金属锰污染修复的微生物菌剂，包含枯草芽孢杆菌、根瘤菌、小球藻混合而成的菌藻混合物(10-20％)及繁穗苋、龙胆草根部提取物a(20-70％)。该微生物菌剂与水混合后，经滴灌喷洒，可修复土壤锰污染，保持土壤生态结构良好。但其中的试剂使用量较大(30-80kg/亩土地)，执行起来有一定难度，且未说明适用的实际场景中的锰浓度。中国专利cn113736709a公开了一种用于锰污染修复的微生物菌剂，包括金属还原地杆菌、沼泽红假单胞菌，是通过共生细菌的作用将锰氧化，从而降低锰毒性。但这种方法容易受环境中氧化还原电位的影响，造成产物不稳定，修复效率降低，而且需要额外添加有机电子供体和co2，增加了成本。因此，在当前的锰污染生物修复反应中仍然存在周期长，成本高，效率低等问题。技术实现要素：4.微生物诱导碳酸钙沉淀(microbialinducedcalciumprecipitation,micp)是一种将化学固定和微生物原位修复结合的新型、环境友好的绿色技术。它可以固定重金属离子(像铜镉铅锰等)，或直接形成碳酸盐矿物，或以类质同象置换方式占据方解石中阴阳离子位置，进入其孔隙或晶格形成竞争性共沉淀，同时形成的碳酸钙表面还可以再吸附重金属离子。这种方法无需引入外源微生物，有助于保持原有生态环境，实现原位修复。产脲酶细菌由于水解机理简单，反应过程易控制而受到广泛关注。它可持续产生高活性脲酶，催化尿素水解，生成氨和二氧化碳，通过细胞壁分散到溶液中，然后迅速水解生成铵离子和碳酸根离子。遇到钙离子，即可形成碳酸钙沉淀。5.壳聚糖是一种可再生、生物相容性、可生物降解、无毒的天然线性多糖，在吸附重金属、有机污染物、土壤稳定等环境应用中越来越受到关注。壳聚糖对多种污染物具有较高的吸附潜力，其丰富的氨基和羟基官能团可作为重金属静电作用或离子交换的结合位点。在micp砂凝固实验中，壳聚糖的加入提高了沉淀收率，提高了胶结性和强度。壳聚糖中的官能团可以与ca2+结合，并作为caco3的成核位点，通过壳聚糖与micp结合实现协同矿化。6.鉴于此，本技术提出一种采用壳聚糖/碳酸盐矿化菌协同高效除锰的方法，对水中的锰离子进行原位处理，并且确定了最适壳聚糖浓度，为其大规模应用奠定了基础，能有效解决上述背景技术中提出的问题。7.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明公开了一种壳聚糖与碳酸盐矿化菌协同高效除锰的方法，原料包括上述的产脲酶菌巴氏芽孢杆菌，包括以下具体步骤：8.s1、配制碳酸盐矿化菌生长所需的营养肉汤培养基，灭菌，加入经过滤除菌的尿素溶液，得到含尿素的培养基，将菌种接种至含尿素的培养基中，振荡过夜培养，得到对数期菌液；9.s2、配制锰离子母液，经过滤除菌后加至含尿素培养基中，得到含锰模拟废水。取步骤s1中制备的对数期菌液，离心弃上清，用新鲜空白培养基重悬，浓缩，获得光密度值(od600)为0.8-1.2的菌种，并将其以0.5-1.5％(v/v)的比例加至含锰培养基中，培养3-5天，获得锰的碳酸盐沉淀，测定锰的去除率；10.s3、取不同量的壳聚糖加至空白培养基中，调节ph，加入锰母液，孵育2h，测定壳聚糖对锰的吸附去除率。取步骤s1中制备的对数期菌液，将其调至od600为0.8-1.2，以0.5-1.5％(v/v)的比例加至含锰含壳聚糖的培养基中，培养3-5天，获得锰的碳酸盐沉淀，测定锰的去除率。11.进一步的，所述步骤s1中，所述的培养基为营养肉汤培养基。12.进一步的，所述步骤s1中，所述含尿素的培养基成分至少包括蛋白胨8-12g/l，牛肉膏8-12g/l，氯化钠4-6g/l,(nh4)2so48-12g/l,尿素15-25g/l。13.进一步的，所述步骤s1中，所述含尿素的培养基成分包括蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，氯化钠5g/l,(nh4)2so410g/l,尿素20g/l。14.进一步的，所述步骤s2和s3中所述的含锰模拟废水为四水氯化锰氟溶液。15.进一步的，所述步骤s3中所述含壳聚糖溶液中的壳聚糖为脱乙酰度90-95％的壳聚糖粉末。16.进一步的，所述步骤s2和s3中所述体系的培养温度为28-35℃，振荡转速为0-180rpm。17.进一步的，所述步骤s2和s3中所述体系的培养温度为28-35℃，振荡转速为0-180rpm。18.进一步的，所述步骤s2和s3中所述体系的培养温度为28℃，振荡转速为180rpm。19.进一步的，所述步骤s2和s3中所述体系的培养温度为35℃，振荡转速为180rpm。20.进一步的，所述步骤s2和s3中所述体系的培养温度为30℃，振荡转速为180rpm。21.进一步的，所述步骤s2中所述的含锰培养基中锰的浓度为1-10mm，步骤s3中所述的含锰培养基中锰的浓度为3-5mm。22.进一步的，所述步骤s2中所述的含锰培养基中锰的浓度为1mm，步骤s3中所述的含锰培养基中锰的浓度为3mm。23.进一步的，所述步骤s2中所述的含锰培养基中锰的浓度为10mm，步骤s3中所述的含锰培养基中锰的浓度为5mm。24.进一步的，所述步骤s2中所述的含锰培养基中锰的浓度为3mm，步骤s3中所述的含锰培养基中锰的浓度为3mm。25.进一步的，所述步骤s3中所述的含壳聚糖溶液的制备方法为：取壳聚糖粉末溶于含0.8-1.0％乙酸的肉汤培养基溶液中，用氢氧化钠调ph至7.0-7.2。26.进一步的，所述步骤s3中所述的含壳聚糖溶液的制备方法为：取壳聚糖粉末溶于含0.8％乙酸的肉汤培养基溶液中，用氢氧化钠调ph至7.0。27.进一步的，所述步骤s3中所述的含壳聚糖溶液的制备方法为：取壳聚糖粉末溶于含1.2％乙酸的肉汤培养基溶液中，用氢氧化钠调ph至7.2。28.进一步的，所述步骤s3中所述的含壳聚糖溶液的制备方法为：取壳聚糖粉末溶于含1％乙酸的肉汤培养基溶液中，用氢氧化钠调ph至7.0。29.进一步的，所述步骤s3中所述的含壳聚糖溶液的制备方法为：取壳聚糖粉末溶于含1％乙酸的肉汤培养基溶液中，用氢氧化钠调ph至7.2。30.进一步的，所述步骤s3中所述的含壳聚糖培养基中壳聚糖的浓度为0.05％(m/v)-0.30％(m/v)。31.进一步的，所述步骤s3中所述的含壳聚糖培养基中壳聚糖的浓度至0.05％(m/v)。32.进一步的，所述步骤s3中所述的含壳聚糖培养基中壳聚糖的浓度至0.15％(m/v)。33.进一步的，所述步骤s3中所述的含壳聚糖培养基中壳聚糖的浓度至0.30％(m/v)。34.有益效果35.1、本发明中选用的碳酸盐矿化菌，具有很高的脲酶活性，在较高的锰离子浓度下仍保持一定的活性，产生的脲酶可以分解尿素，提高培养体系的ph，产生碳酸根离子，与锰离子结合形成碳酸盐沉淀，从而达到微生物修复锰污染的目的，具有绿色环保、经济高效、原理简单、易控制的优点。处理48h时，锰去除率可达94.1％，72h后，去除率可达最高值，即98.2％。36.而体系中加入壳聚糖后，菌株不仅可以被吸附在壳聚糖表面，同时壳聚糖自身也可以静电吸附少量的锰离子，增强了巴氏芽孢杆菌对高浓度锰的耐受性，并提高了脲酶活性。当处理48小时后，不添加壳聚糖条件下的脲酶活性为2.9毫摩尔尿素/分钟，而添加0.05％，0.15％，0.30％壳聚糖条件下的脲酶活性分别为不添加时的1.1倍，2.0倍，2.1倍，如图3所示。在壳聚糖的协同除锰作用下，锰修复的周期显著缩短，如图4所示，由48小时缩短为24小时，最大去除率提高，可达99％以上。37.2、如图2所示，单独使用壳聚糖的去除率为7.6％-8.7％，与不加壳聚糖的情况相比，体系中加入壳聚糖后，产生的碳酸锰晶体发育更好，结晶度更高(如图5和图6)，本发明利用壳聚糖/碳酸盐矿化菌产生的锰沉淀产物为碳酸锰晶体，结晶性好，呈较规则的球体，尺寸在6.2±1.8μm，对去除污染水体中的锰，表现出良好的效果，修复24小时后去除率可达97.1％。附图说明38.图1为本发明实施例2中碳酸盐矿化菌对锰离子的去除效果；39.图2为本发明实施例3中壳聚糖对锰离子的去除效果；40.图3为本发明实施例4中不同浓度壳聚糖添加条件下体系的脲酶活性；41.图4为本发明实施例5中壳聚糖/碳酸盐矿化菌对锰离子的去除效果；42.图5为本发明实施例2中碳酸盐矿化菌矿化产物的xrd图；43.图6为本发明实施例5中壳聚糖/碳酸盐矿化菌矿化产物的xrd图；44.图7为本发明实施例2中碳酸盐矿化菌矿化产物的sem图；45.图8为本发明实施例5中壳聚糖/碳酸盐矿化菌矿化产物的sem图；46.图9为本发明实施例2和实施例5中矿化产物的颗粒粒径分布图。具体实施方式47.为更加明确地阐述本发明的目的、技术方案和有益效果，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。48.本发明中碳酸盐矿化菌可有效改善废水中重金属锰的污染，首先进行碳酸盐矿化菌的培养，得到高浓缩菌液，然后将碳酸盐矿化菌菌液、模拟废水和壳聚糖按比例混合后培养，实现锰污染的高效修复。49.实施例1浓缩碳酸盐矿化菌液的制备50.配制营养肉汤培养基，包含蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，氯化钠5g/l,(nh4)2so410g/l，121℃高温灭菌15min，加入经过滤除菌的尿素溶液(尿素终浓度为20g/l)，得到含尿素的营养肉汤培养基。对应的固体平板培养基需额外补充1.5％的琼脂。51.在超净工作台中，将-80℃保存的巴氏芽孢杆菌接种到含尿素的固体培养基培养36h。挑取单菌落接种至含尿素的营养肉汤培养基中，30℃，180rpm振荡培养12h。测定菌液的光密度值(od600)。取1ml菌液，以6000rpm离心3min，弃上清用新鲜培养基洗2次，重悬，调整菌液的od600值为1.0，备用。52.所用碳酸盐矿化菌为巴氏芽孢杆菌(sporosarcinapasteurii)，菌株编号为atcc11859，为商品化模式菌株。53.实施例2巴氏芽孢杆菌矿化作用对废水中锰的固定效果54.配制1m的氯化锰母液，过滤除菌，取0.3ml加至已灭菌的100ml含尿素营养肉汤培养基中，其中锰离子的终浓度为3mm。55.取1ml实施例1中制备的浓缩菌液，以1％(v/v)的比例接种至上述含3mm锰的培养基中，混合后溶液中所含菌液的od600值为0.01。将混合溶液置于30℃培养箱中静置培养3天。在培养过程中，每隔12h取样1ml，离心，取上清，并用0.22μm针头过滤器过滤，然后用原子吸收光谱仪测定剩余锰离子浓度。计算锰去除率。图1为巴氏芽孢杆菌对3mm锰的去除效果。结果显示，24h时锰的去除率只有50.8％，到48h时，锰去除率可达94.1％，之后趋势趋于平缓，最高可达98.2％。56.实施例3壳聚糖对废水中锰的吸附效果57.取1ml乙酸加至100ml含尿素培养基中，然后加入0.05/0.15/0.3g壳聚糖粉末，搅拌溶解，分别得到0.05％，0.15％，0.30％(m/v)的壳聚糖溶液。用0.1m的氢氧化钠调节溶液ph为7.0。取0.3ml已过滤除菌的锰母液加至该含壳聚糖的尿素培养基中，其中锰离子的终浓度为3mm。58.将上述混合溶液置于30℃摇床中振荡48h，分别在0h，6h,12h,24h,48h时取样2ml，8000rpm离心10min，取上清，并用0.22μm针头过滤器过滤，然后用原子吸收光谱仪测定上清液中锰离子浓度。计算锰去除率。59.图2为不同浓度壳聚糖对3mm锰的吸附去除效果。结果显示，随着时间的推移，壳聚糖对锰离子的吸附逐渐增多，达到最大值后吸附去除率趋于稳定，表明吸附已达饱和，但整体的吸附效率不高。当体系中壳聚糖浓度分别为0.05％，0.15％，0.30％条件下，锰去除率(24h)达到最大值，分别为7.6％，8.3％，8.7％，表明添加的壳聚糖越多，锰的去除率越高，但去除率增加不明显。60.实施例4壳聚糖添加对巴氏芽孢杆菌脲酶活性的影响61.取1ml乙酸加至100ml含尿素培养基中，然后加入0.05/0.15/0.3g壳聚糖粉末，搅拌溶解，分别得到0.05％，0.15％，0.30％的壳聚糖溶液。用0.1m的氢氧化钠调节溶液ph为7.0。取0.3ml已过滤除菌的锰母液加至该含壳聚糖的尿素培养基中，其中锰离子的终浓度为3mm。62.取1ml实施例1中制备的浓缩菌液，以1％(v/v)的比例接种至上述含3mm锰的培养基中，混合后溶液中所含菌液的od600值为0.01。将混合溶液置于30℃培养箱中静置培养4天。在培养过程中，分别在2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，48h，72h，96h取样2ml，用电导率仪测定电导率变化，计算脲酶活性。63.图3为不同浓度壳聚糖添加条件下，体系中脲酶活性的变化。结果表明，48h时，脲酶活性最高。不添加壳聚糖时，酶活为2.9毫摩尔尿素/分钟，而添加0.05％，0.15％，0.30％壳聚糖条件下的脲酶活性显著提高，分别为不添加时的1.1倍，2.0倍，2.1倍。64.实施例5壳聚糖/巴氏芽孢杆菌对废水中锰的固定效果65.取1ml乙酸加至100ml含尿素培养基中，然后加入0.05/0.15/0.3g壳聚糖粉末，搅拌溶解，分别得到0.05％，0.15％，0.30％的壳聚糖溶液。用0.1m的氢氧化钠调节溶液ph为7.0。取0.3ml已过滤除菌的锰母液加至该含壳聚糖的尿素培养基中，其中锰离子的终浓度为3mm。66.取1ml实施例1中制备的浓缩菌液，以1％(v/v)的比例接种至上述含3mm锰的培养基中，混合后溶液中所含菌液的od600值为0.01。将混合溶液置于30℃培养箱中静置培养4天。在培养过程中，分别在2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，48h，72h，96h取样2ml，8000rpm离心10min，取上清，并用0.22μm针头过滤器过滤，然后用原子吸收光谱仪测定上清液中锰离子浓度。计算锰去除率。67.图4为巴氏芽孢杆菌联合壳聚糖对3mm锰的去除效果。结果显示，随着时间的推移，锰的去除率迅速提高，8-10h增长最快，在24h即可达到97.1％。在前4h内，不同壳聚糖添加量导致的锰去除率差异不大。而反应6h时，0.05％，0.15％，0.30％的壳聚糖添加条件下，锰的去除率分别为10.1％，47.0％，31.7％；反应12h时，去除率分别高达79.4％，94.5％，93.9％。而在不添加壳聚糖条件下，12h的去除率只有6.1％。由此可见，壳聚糖可显著提高巴氏芽孢杆菌对锰的固定效果，壳聚糖的最适浓度为0.15％。最大去除率可高达99.1％。68.实施例6壳聚糖/巴氏芽孢杆菌固定锰的矿化产物表证69.取实施例2中反应72h的溶液2ml，6000rpm离心3min，弃上清，用灭菌的超纯水清洗3次，收集沉淀，置于冻干机中24h，获得冻干的沉淀粉末。取10mg粉末，喷金60s，用扫描电子显微镜(sem)观察矿物形貌。取适量粉末进行x射线衍射能谱(xrd)分析。70.取实施例5中反应72h的溶液2ml(添加0.15％壳聚糖)，6000rpm离心3min，弃上清，用灭菌的超纯水清洗3次，收集沉淀，置于冻干机中24h，获得冻干的沉淀粉末。取适量粉末，喷金60s，用扫描电子显微镜(sem)观察矿物形貌。取10m粉末进行x射线衍射能谱(xrd)分析。71.图5和图6分别为巴氏芽孢杆菌以及巴氏芽孢杆菌联合壳聚糖产生锰矿物的xrd图。经xrd主要衍射峰与标准pdf卡片检索发现，产生的矿物成分均为碳酸锰。图6与图5相比，特征吸收峰更尖锐，表明添加壳聚糖后形成的碳酸锰矿物结晶性更好。72.巴氏芽孢杆菌以及巴氏芽孢杆菌联合壳聚糖产生锰矿物的微观形貌表征如图7和图8所示。两种条件下产生的碳酸锰晶体均呈现较规则的球形或椭球形，每个球形颗粒由众多1-2微米的微菱面体组合而成，微菱面体的表面光滑，边缘清晰整齐。图8中大尺寸无定形不规则块状物质为壳聚糖，产生的碳酸锰颗粒均匀分布在壳聚糖表面，也有少量颗粒未在壳聚糖上生长，而是于溶液中生成，这些颗粒与图7的形貌相似。73.利用图片处理软件imagej统计两种条件下的碳酸锰颗粒尺寸，发现不添加和添加壳聚糖条件下形成的碳酸锰颗粒平均尺寸分别为9.7±2.9μm，6.2±1.8μm(见图9)。可以看出添加壳聚糖后形成的碳酸锰晶体的尺寸明显小于不添加壳聚糖条件下形成的颗粒，且具有显著性差异(p＜0.01)。同时由图8中颗粒的粒径分布可以看出，两种条件下产生的颗粒尺寸均较均一，分布较集中。这可能是因为壳聚糖可螯合锰离子，提高静置条件下局部区域的饱和度，同时壳聚糖的存在可作为成核位点，因此促进碳酸锰晶体的成核，加速了晶体生长的过程，产生更多数量尺寸更小的晶体。对于球形晶体，粒径越小则其比表面积越大。因为产生的碳酸锰可以作为吸附剂进一步吸附溶液中的锰离子，壳聚糖添加的条件下形成的碳酸锰粒径更小且数量更多，所以具有更大的比表面积，进一步提高了吸附性能。另一方面，添加壳聚糖后，可吸附7.6％-8.7％的锰离子，减轻了锰对巴氏芽孢杆菌的毒性，使菌可以迅速生长繁殖，进而缩短整个修复周期。因此，通过壳聚糖的吸附，巴氏芽孢杆菌矿化以及碳酸锰晶体的再吸附，共同实现了短时间内锰离子的高效固定，为锰污染废水的高效处理提供了新的思路和策略。74.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步说明，但以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。









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