一种用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于胶原蛋白提取的技术领域，更具体涉及一种用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法。背景技术：2.胶原蛋白是广泛存在于人和动物细胞外基质的一种结构性蛋白，同时也是一种功能蛋白，它与细胞增生、分化、运动、免疫、关节润滑、伤口愈合等密切相关，广泛应用于生物医学研究、生物工程、生物医药、化妆品、化工、食品等领域。我国是较早使用纺织品的国家之一，但是皮革类纺织品有难以检测的问题。生物领域的免疫检测方法可以有效地解决这一问题，在运用特异性免疫检测皮革纺织品文物的过程中，提取牛皮胶原蛋白来制备抗体就是重中之重。技术实现要素：3.鉴于此，为实现上述目的，本发明提供了一种用于制备抗体的牛皮胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：4.步骤1、将预处理后的牛皮原料使用含胃蛋白酶磷酸盐缓冲溶液进行酶解，在ph＝2.0-2.5、温度为35-39℃下酶解8-10h；5.步骤2、将酶解后所得物进行离心，取上清液，加入nacl进行盐析；盐析后离心，沉淀物即为粗胶原蛋白；将粗胶原蛋白溶于醋酸溶液中，然后在磷酸氢二钠溶液中透析，再转入蒸馏水中透析，得到牛皮胶原蛋白。6.本发明在步骤2真空冷冻干燥后将牛皮粉碎，可以使其酶解更加完全并且可以降低酶解时间。本发明在步骤3中使用胃蛋白酶酶解，是因为胃蛋白酶对于牛皮有最好的酶解效果。酶解温度过低会降低酶解的效率，而酶解温度过高会使胶原蛋白失活，失去提取价值；酶解的时间过短会导致胃蛋白酶还没来得及破坏其细胞结构；ph过低或过高都会导致酶失活失去作用，也会导致胶原蛋白的变性与失活；加酶量与料液比会影响到酶解的速率，过低会导致速率下降，过高会导致浪费。盐析用中性盐来破坏蛋白质在溶液中稳定存在的两大因素，使蛋白质发生沉淀；透析可以除去污染物，特别是重金属和蛋白酶等对蛋白质有毒害作用的物质。7.进一步优选的，步骤1中，所述含胃蛋白酶磷酸盐缓冲溶液的加酶量为2.0-4.0wt％。8.进一步优选的，步骤1中，所述酶解的过程中料液质量体积比为1：20-40。9.进一步优选的，步骤1中，所述预处理为：将牛皮清洗后，将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净，之后修剪成小块，再用磷酸盐溶液浸泡后冲洗、沥干；再进行真空冷冻干燥，粉碎，在nacl溶液中浸泡，除去盐溶性杂质，得到的固体沉淀物，即为预处理后的牛皮原料。10.进一步优选的，除去盐溶性杂质，5000-8000r/min离心4-15min，得到固体沉淀物。11.进一步优选的，所述磷酸盐溶液的ph为5-8；所述真空冷冻干燥的时间为12-48h；所述在nacl溶液中浸泡的过程中料液质量体积比为0.5-3:45-60，nacl溶液的质量浓度为6-18％，浸泡时间为12-14h。12.进一步优选的，步骤2中，所述离心为8000-12000r/min离心7-20min。13.进一步优选的，步骤2中，在上清液中加入nacl至2-5mol/l时进行盐析。14.进一步优选的，步骤2中，所述醋酸溶液的浓度为0.3-0.9mol/l。15.进一步优选的，步骤2中，所述磷酸氢二钠的浓度为0.01-0.1mol/l，透析时间为1-4d；所述蒸馏水中透析的时间为1-4d。16.相比于现有技术，本发明具有以下优点：只运用单一酶在酸性条件下对其进行酶解，在不降低效率的同时，使操作流程更加方便，通过多次离心和层析等方式，去除细菌、病毒、内毒素、杂蛋白等杂质，提取保留生物活性的胶原蛋白。附图说明17.图1为对比例1中不同酶在各自酶解条件下的胶原蛋白提取率；18.图2为实施例2和实施例3的胶原蛋白提取率19.图3为对比例2中不同酶解ph条件下对猪皮胶原蛋白提取率；20.图4为对比例3中不同酶解温度条件下对猪皮胶原蛋白提取率；21.图5为对比例4中不同酶解时间条件下对猪皮胶原蛋白提取率；22.图6为对比例5中不同加酶量条件下对猪皮胶原蛋白提取率；23.图7为对比例6中不同料液比条件下对猪皮胶原蛋白提取率。具体实施方式24.下面结合实施例对本发明作进一步详细说明技术内容和效果，但不因此限制本发明。25.实施例126.一种用于制备抗体的牛皮胶原蛋白提取方法，包括以下步骤：27.步骤1：将新鲜牛皮清洗干净后，用手术刀将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净后，用剪刀将猪皮修剪成1cm×1cm的方块。用ph＝7.5的磷酸盐溶液浸泡牛皮后，再用蒸馏水冲洗4次，沥干后进行真空冷冻干燥48h，粉碎后，按照料液比1:50(w/v)在10wt％nacl溶液中浸泡12h，除去盐溶性杂质。除杂后，8000r/min离心10min，得到固体沉淀物。28.步骤2：使用胃蛋白酶对固体沉淀物进行酶解，在料液比为1：20(w/v)的加酶量为2.0wt％的含胃蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液中，在ph＝2.0、温度为37℃下酶解8h。29.步骤3：酶解后，将所得物进行8000r/min离心10min，取上清液，加入nacl至4mol/l进行盐析；盐析后8000r/min离心10min，保留沉淀物，即为粗胶原蛋白。将粗胶原蛋白溶于0.5mol/l醋酸溶液中，然后在0.02mol/l磷酸氢二钠溶液中透析2d，再转入蒸馏水中透析1d，得到牛皮胶原蛋白，冷冻干燥保存。30.实施例231.步骤1：将新鲜牛皮清洗干净后，用手术刀将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净后，用剪刀将猪皮修剪成1cm×1cm的方块。用ph＝7.5的磷酸盐溶液浸泡牛皮后，再用蒸馏水冲洗4次，沥干后进行真空冷冻干燥48h，粉碎后，按照料液比1:50(w/v)在10wt％nacl溶液中浸泡12h，除去盐溶性杂质。除杂后，4000r/min离心5min，得到固体沉淀物。32.步骤2：使用胃蛋白酶对固体沉淀物进行酶解，在料液比为1：20(w/v)的加酶量为2.0wt％的含胃蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液中，在ph＝2.0、温度为37℃下酶解8h。33.步骤3：酶解后，将所得物进行8000r/min离心10min，取上清液，加入nacl至4mol/l进行盐析；盐析后4000r/min离心5min，保留沉淀物，即为粗胶原蛋白。将粗胶原蛋白溶于0.5mol/l醋酸溶液中，然后在0.02mol/l磷酸氢二钠溶液中透析2d，再转入蒸馏水中透析1d，得到牛皮胶原蛋白，冷冻干燥保存。34.实施例335.步骤1：将新鲜牛皮清洗干净后，用手术刀将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净后，用剪刀将猪皮修剪成1cm×1cm的方块。用ph＝7.5的磷酸盐溶液浸泡牛皮后，再用蒸馏水冲洗4次，沥干后进行真空冷冻干燥48h，粉碎后，按照料液比1:50(w/v)在5wt％nacl溶液中浸泡12h，除去盐溶性杂质。除杂后，8000r/min离心10min，得到固体沉淀物。36.步骤2：使用胃蛋白酶对固体沉淀物进行酶解，在料液比为1：20(w/v)的加酶量为2.0wt％的含胃蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液中，在ph＝2.0、温度为37℃下酶解8h。37.步骤3：酶解后，将所得物进行8000r/min离心10min，取上清液，加入nacl至2mol/l进行盐析；盐析后8000r/min离心10min，保留沉淀物，即为粗胶原蛋白。将粗胶原蛋白溶于0.3mol/l醋酸溶液中，然后在0.01mol/l磷酸氢二钠溶液中透析2d，再转入蒸馏水中透析1d，得到牛皮胶原蛋白，冷冻干燥保存。38.对比例1(与实施例1的区别在于采用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)39.步骤1：将新鲜牛皮清洗干净后，用手术刀将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净后，用剪刀将猪皮修剪成1cm×1cm的方块。用ph＝7.5的磷酸盐溶液浸泡牛皮后，再用蒸馏水冲洗4次，沥干后进行真空冷冻干燥48h，粉碎后，按照料液比1:50(w/v)在10wt％nacl溶液中浸泡12h，除去盐溶性杂质。除杂后，8000r/min离心10min，得到固体沉淀物。40.步骤2：使用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶对固体沉淀物进行酶解，在料液比为1：20(w/v)的加酶量为2.0wt％的含胃蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液中，，胰蛋白酶的反应条件为ph＝8.0，温度为42℃，酶解8h(木瓜蛋白酶的反应条件为ph＝6.0，温度为55℃，酶解8h)；41.步骤3：酶解后，将所得物进行8000r/min离心10min，取上清液，加入nacl至4mol/l进行盐析；盐析后8000r/min离心10min，保留沉淀物，即为粗胶原蛋白。将粗胶原蛋白溶于0.5mol/l醋酸溶液中，然后在0.02mol/l磷酸氢二钠溶液中透析2d，再转入蒸馏水中透析1d，得到牛皮胶原蛋白，冷冻干燥保存。42.对比例2(与实施例1的区别在于酶解时的ph)43.步骤1：将新鲜牛皮清洗干净后，用手术刀将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净后，用剪刀将猪皮修剪成1cm×1cm的方块。用ph＝7.5的磷酸盐溶液浸泡牛皮后，再用蒸馏水冲洗4次，沥干后进行真空冷冻干燥48h，粉碎后，按照料液比1:50(w/v)在10wt％nacl溶液中浸泡12h，除去盐溶性杂质。除杂后，8000r/min离心10min，得到固体沉淀物。44.步骤2：使用胃蛋白酶对固体沉淀物进行酶解，在料液比为1：20(w/v)的加酶量为2.0wt％的含胃蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液中，分别在ph值为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5条件下，温度为37℃下酶解8h。45.步骤3：酶解后，将所得物进行8000r/min离心10min，取上清液，加入nacl至4mol/l进行盐析；盐析后8000r/min离心10min，保留沉淀物，即为粗胶原蛋白。将粗胶原蛋白溶于0.5mol/l醋酸溶液中，然后在0.02mol/l磷酸氢二钠溶液中透析2d，再转入蒸馏水中透析1d，得到牛皮胶原蛋白，冷冻干燥保存。46.对比例3(与实施例1的区别在于酶解时的温度)47.步骤1：将新鲜牛皮清洗干净后，用手术刀将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净后，用剪刀将猪皮修剪成1cm×1cm的方块。用ph＝7.5的磷酸盐溶液浸泡牛皮后，再用蒸馏水冲洗4次，沥干后进行真空冷冻干燥48h，粉碎后，按照料液比1:50(w/v)在10wt％nacl溶液中浸泡12h，除去盐溶性杂质。除杂后，8000r/min离心10min，得到固体沉淀物。48.步骤2：使用胃蛋白酶对固体沉淀物进行酶解，在料液比为1：20(w/v)的加酶量为2.0wt％的含胃蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液中，在ph＝2.0，分别在温度为27℃、32℃、37℃、42℃、47℃条件下，酶解8h。49.步骤3：酶解后，将所得物进行8000r/min离心10min，取上清液，加入nacl至4mol/l进行盐析；盐析后8000r/min离心10min，保留沉淀物，即为粗胶原蛋白。将粗胶原蛋白溶于0.5mol/l醋酸溶液中，然后在0.02mol/l磷酸氢二钠溶液中透析2d，再转入蒸馏水中透析1d，得到牛皮胶原蛋白，冷冻干燥保存。50.对比例4(与实施例1的区别在于酶解时的时间)51.步骤1：将新鲜牛皮清洗干净后，用手术刀将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净后，用剪刀将猪皮修剪成1cm×1cm的方块。用ph＝7.5的磷酸盐溶液浸泡牛皮后，再用蒸馏水冲洗4次，沥干后进行真空冷冻干燥48h，粉碎后，按照料液比1:50(w/v)在10wt％nacl溶液中浸泡12h，除去盐溶性杂质。除杂后，8000r/min离心10min，得到固体沉淀物。52.步骤2：使用胃蛋白酶对固体沉淀物进行酶解，在料液比为1：20(w/v)的加酶量为2.0wt％的含胃蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液中，在ph＝2.0、温度为37℃下，分别酶解2h、4h、6h、8h、10h。53.步骤3：酶解后，将所得物进行8000r/min离心10min，取上清液，加入nacl至4mol/l进行盐析；盐析后8000r/min离心10min，保留沉淀物，即为粗胶原蛋白。将粗胶原蛋白溶于0.5mol/l醋酸溶液中，然后在0.02mol/l磷酸氢二钠溶液中透析2d，再转入蒸馏水中透析1d，得到牛皮胶原蛋白，冷冻干燥保存。54.对比例5(与实施例1的区别在于酶解时的加酶量)55.步骤1：将新鲜牛皮清洗干净后，用手术刀将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净后，用剪刀将猪皮修剪成1cm×1cm的方块。用ph＝7.5的磷酸盐溶液浸泡牛皮后，再用蒸馏水冲洗4次，沥干后进行真空冷冻干燥48h，粉碎后，按照料液比1:50(w/v)在10wt％nacl溶液中浸泡12h，除去盐溶性杂质。除杂后，8000r/min离心10min，得到固体沉淀物。56.步骤2：使用胃蛋白酶对固体沉淀物进行酶解，在料液比为1：20(w/v)的加酶量分别为1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％的含胃蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液中，在ph＝2.0、温度为37℃下酶解8h。57.步骤3：酶解后，将所得物进行8000r/min离心10min，取上清液，加入nacl至4mol/l进行盐析；盐析后8000r/min离心10min，保留沉淀物，即为粗胶原蛋白。将粗胶原蛋白溶于0.5mol/l醋酸溶液中，然后在0.02mol/l磷酸氢二钠溶液中透析2d，再转入蒸馏水中透析1d，得到牛皮胶原蛋白，冷冻干燥保存。58.对比例6(与实施例1的区别在于酶解时的料液比)59.步骤1：将新鲜牛皮清洗干净后，用手术刀将牛皮的皮下脂肪与表面毛发清理干净后，用剪刀将猪皮修剪成1cm×1cm的方块。用ph＝7.5的磷酸盐溶液浸泡牛皮后，再用蒸馏水冲洗4次，沥干后进行真空冷冻干燥48h，粉碎后，按照料液比1:50(w/v)在10wt％nacl溶液中浸泡12h，除去盐溶性杂质。除杂后，8000r/min离心10min，得到固体沉淀物。60.步骤2：使用胃蛋白酶对固体沉淀物进行酶解，在料液比分别为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50(w/v)的加酶量为2.0wt％的含胃蛋白酶的磷酸盐缓冲溶液中，在ph＝2.0、温度为37℃下酶解8h。61.步骤3：酶解后，将所得物进行8000r/min离心10min，取上清液，加入nacl至4mol/l进行盐析；盐析后8000r/min离心10min，保留沉淀物，即为粗胶原蛋白。将粗胶原蛋白溶于0.5mol/l醋酸溶液中，然后在0.02mol/l磷酸氢二钠溶液中透析2d，再转入蒸馏水中透析1d，得到牛皮胶原蛋白，冷冻干燥保存。62.如图1所示，对比例1表明胃蛋白酶较其余的两种酶能更好的与牛皮发生反应，水解程度更加的彻底，所以其胶原蛋白提取率是三者中最高的。63.如图2所示为实施例2-3所得胶原蛋白提取率。64.如图3所示，对比例2表明在ph值在1.5-2.5之间，随着ph值的增大，胶原蛋白提取率呈现先升后降的变化趋势，在ph为2.0-2.5时，胃蛋白酶的提取率最高。65.如图4所示，对比例3表明在27～47℃范围内，随着温度的升高，胶原蛋白提取率呈现先升后降的变化趋势，在37℃左右，胃蛋白酶对胶原蛋白的提取率最高。66.如图5所示，对比例4表明随着酶解时间的延长，猪皮胶原蛋白提取率在酶解2～6h时，提取率缓慢上升，在酶解6～8h之间，提取率快速提升，而8h后提取率逐渐趋于平缓，因而酶解时间为8～12h时，胃蛋白酶对胶原蛋白的提取率较高。67.如图6所示，对比例5表明随着加酶量的变化，在加酶量1％～5％之间，胶原蛋白提取率呈现先升后降的变化规律，在加酶量2-4％时，其胶原蛋白提取率较高，能够达到40％以上。68.如图7所示，对比例6表明胶原蛋白提取率随着料液比的增大而出现先升后降的变化规律。在料液比为1:20～1:40范围内，提取率仍会随着料液比的增大而提升，但更优选的料液比为1:20，之后由于增加幅度较低，成本也会随之提高。69.综上，本发明只运用单一酶在酸性条件下对其进行酶解，在不降低效率的同时，提取保留生物活性的胶原蛋白，胃蛋白酶在不同条件下酶解时的胶原蛋白的提取率会有很大差异，而在本发明限定条件配合下，胃蛋白酶对胶原蛋白的提取率能够达到较高水平。70.本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。









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