一种克雷伯氏菌W6及其在海水养殖尾水处理中的应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术一种克雷伯氏菌w6及其在海水养殖尾水处理中的应用技术领域1.本发明属于应用微生物技术领域，尤其涉及一种克雷伯氏菌w6及其在海水养殖尾水处理中的应用。背景技术：2.水域污染是当前水产养殖产业发展面临的最大瓶颈和危机。目前，环保部门正在科学出台水产养殖尾水污染物强制性排放标准。水产养殖布局将形成“稳定池塘，拓展远海、控制污染、修复环境”的新格局，绿色发展的产业发展方向已经确立，从追求产量产能转变为环境友好优质高效。3.好氧反硝化菌的发现和研究为开发新型生物脱氮技术奠定了重要的基础。好氧反硝化作为一种新型的脱氮工艺，具有技术简单、占地小、硝化与反硝化同时进行等优点，被国内外学者广泛关注。海水水产养殖尾水处理中，反硝化主要受碳氮比、碳源、溶氧和盐度等因素的影响。溶氧通过抑制反硝化酶的合成、活性或者与硝酸盐竞争电子供体等途径影响反硝化反应进程，对细菌的反硝化性能至关重要。高盐度会引起渗透压的大幅增加和微生物的新陈代谢变化从而导致细胞质壁分离。即使是海洋环境中分离出的微生物仍会受高浓度盐的抑制，由于酶活性受到抑制而表现出较低的处理效率。大多数好氧反硝化菌的最适盐度都在5-10左右。集约化对虾养殖尾水溶解氧含量高，甚至接近饱和状态，加上海水养殖尾水中污染物结构的特殊性，以及海水的盐度效应和离子强度效应，导致其处理难度和复杂度都大大增加。4.反硝化过程中产生的温室气体n2o一直是水处理领域研究者们关注的问题，目前多数好氧反硝化菌反硝化的最终产物也以n2o为主，因此有必要筛选高效、耐高溶氧、反硝化产物以n2为主的好氧反硝化菌株，以提升好氧反硝化菌应用的技术可行性。5.因此，完全好氧反硝化菌能去除海水对虾养殖尾水中的氮污染，解决海水对虾养殖尾水高效脱氮的关键问题，技术推广和成果转化价值高，产业化前景广阔。技术实现要素：6.本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种克雷伯氏菌w6。7.本发明所要解决的第二个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种克雷伯氏菌w6的应用。8.本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种克雷伯氏菌 klebsiella sp，其特征在于：所述克雷伯氏菌 klebsiella sp保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.1.61328，保藏日期为2023年2月22日，该克雷伯氏菌属w6的基因序列如seq id no.1所示。9.进一步地，所述克雷伯氏菌w6在12h内，硝酸氮的去除率为58.62％，去氮速率达48.27mg/l·h-1；在48h时内，总氮的去除率达到61.33％，去氮速率为12.62mg/l·h-1，硝酸氮的去除率达68.24％，去氮速率为14.05mg/l·h-1，w6菌在前12h时，去氮速率最高。10.进一步地，所述克雷伯氏菌w6具有硝酸还原酶(narghi)的编码基因、亚硝酸还原酶(nir)的编码基因、一氧化氮还原酶(norb)的编码基因和一氧化二氮还原酶(nosz)的编码基因，使反硝化过程终产物为n2；11.所述硝酸还原酶(narghi)的编码基因的序列如seq id no.2所示；12.所述亚硝酸还原酶(nir)的编码基因的序列如seq id no.3所示；13.所述一氧化氮还原酶(norb)的编码基因的序列如seq id no.4所示；14.所述一氧化二氮还原酶(nosz)的编码基因的序列如seq id no.5所示。15.进一步地，所述克雷伯氏菌w6具有如下代谢途径的一个或多个：16.硝酸氮→亚硝酸氮，硝酸盐还原酶(narghi)是催化该代谢途径的酶；17.亚硝酸氮→一氧化氮，亚硝酸还原酶(nir)是催化该代谢途径的酶；18.一氧化氮→一氧化二氮，一氧化氮还原酶(norb)是催化该代谢途径的酶；19.一氧化二氮→氮气，一氧化二氮还原酶(nosz)是催化该代谢途径的酶；20.所述硝酸还原酶基因的引物为：narghif：gcatccgtttattcacccgc，narghir：cgtcttctttgttcagcgcc；21.所述亚硝酸还原酶基因的引物为：nirf：gaacctgtacgtgtgcggta，22.nirr：tccaccagagtaaccgggat；23.所述一氧化氮还原酶编码基因的引物为：norbf：gcagccgattttactcagcg，norbr：tctttggcggccacgatatt；24.所述一氧化二氮还原酶基的引物为：noszf：cgcracggcaasaaggtsmssgt，noszr：cakrtgcaksgcrtggcagaa。25.本发明还提供一种克雷伯氏菌w6的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法包括以下步骤：26.s1、富集驯化：取海水对虾养殖尾水处理池塘的底泥5-10g，加入300-400ml灭菌培养基a，培养3天；之后，取上述培养液50ml加入至300ml灭菌的培养液，设置3个平行，180r/min，20-40℃培养；所述灭菌的培养液包括灭菌培养基a和海水b；所述灭菌的培养液中灭菌培养基a的含量每次以10％的梯度递减，间隔3天一次，直到用10％的灭菌培养基a进行培养；27.s2、分离：将富集驯化好的培养液，进行梯度稀释后进行平板涂布培养，当平板上呈现清晰的单一菌落时，再进一步分离纯化出单一菌株，将上述纯化后所得菌株至50％甘油中，在-80℃冰箱保存，然后对上述菌株开展脱氮性能检测。28.进一步地，所述灭菌培养基a按下述比例配置：ch3coona 0.5g/l，nano3 0.1g/l，k2hpo4·3h2o 0.1g/l，cacl2 0.05g/l，mgcl2·6h2o 0.05g/l，海水1000ml，ph 8.0-8.5。29.进一步地，所述步骤s2中采用分离培养基；所述分离培养基为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠30g/l，琼脂粉15g/l，ph 7.30-7.50。30.本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种克雷伯氏菌属w6在海水养殖尾水处理中的应用。31.进一步地，所述应用为去除海水养殖尾水中的总氮、硝基氮和亚硝基氮。32.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的克雷伯氏菌w6在海水集约化对虾养殖尾水处理中表现出很强的好氧反硝化的能力，可有效的去除硝态氮和亚硝态氮，高效脱氮、反硝化终产物为n2，且去氮速率快，硝酸氮最高去除速率达48.27mg/l·h-1在海水养殖尾水的脱氮处理中展现出巨大的应用潜力。33.保藏说明34.1、克雷伯氏菌 klebsiella sp，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc no.1.61328，保藏日期为：2023年2月22日。附图说明35.图1为本发明的实施例2的电镜图；36.图2为本发明的实施例2的系统发育树图；37.图3为本发明的实施例3的反硝化性能测定时的硝酸氮含量变化图；38.图4为本发明的实施例3的反硝化性能测定时的亚硝酸氮含量变化图；39.图5为本发明的实施例3的反硝化性能测定时的总氮含量变化图；40.图6为本发明的实施例3的在特定条件时48h内总氮和硝酸氮含量变化图；41.图7为本发明的实施例3的在特定条件时48h内亚硝酸氮和氨氮含量变化图；42.图8为本发明的实施例4的反硝化功能基因扩增产物电泳图。具体实施方式43.以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。44.实施例1好氧反硝化细菌的筛选45.(1)富集驯化：取海水对虾养殖尾水处理池塘的底泥5g，加入300ml灭菌培养基a(ch3coona 0.5g/l，nano3 0.1g/l，k2hpo4·3h2o 0.1g/l，cacl2 0.05g/l，mgcl2·6h2o 0.05g/l，海水1000ml，调节ph8.5)，置于500ml三角烧瓶中，培养3天。之后，取上述培养液50ml加入至300ml灭菌的培养液(a+b)，置于500ml三角烧瓶中，设置3个平行。(a表示富集培养基，b表示海水)。a的值分别为270ml、240ml、210ml、180ml、150ml、120ml、90ml、60ml、30ml；b的值分别对应为30ml、60ml、90ml、120ml、150ml、180ml、210ml、240ml、270ml。上述a培养基每次以10％的梯度递减，间隔3天换一次，直到用10％的a培养基进行培养(此过程每3天测一次od观察菌生长情况，180r/min，30℃培养)。46.(2)分离：将富集驯化好的培养液，进行梯度稀释后进行平板涂布培养当平板上呈现清晰的单一菌落时，再进一步分离纯化出单一菌株，将上述纯化后所得菌株至50％甘油-80℃冰箱保存，然后对上述菌株开展脱氮性能检测。所用分离培养基为：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeast extract)5g/l，氯化钠(nacl)30g/l，琼脂粉15g/l，ph 7.50。47.如上所述，将实施例1筛选分离的菌株接种到以硝酸钾为唯一氮源的反硝化筛选培养基中，设三个平行，在180r/min，30℃条件下培养。间隔24h取样测定培养液中的总氮、硝酸盐(no3-‑n)、亚硝酸盐(no2-‑n)的浓度，通过分析4种氮的含量变化来判断菌株反硝化能力；最终筛选出脱氮能力最强的菌株为w6。48.实施例2好氧反硝化细菌w6菌株的鉴定及命名保藏49.(1)菌株w6形态学、生理与分子生物学鉴定50.①菌落形态：在lb平板30℃，12h，该菌落为浅黄色光滑圆形隆起，表面温润有光泽，边缘整齐；直径在1-2mm；为革兰氏阴性菌，无芽孢、有荚膜，含有菌毛，大小为(0.5-0.8)×(2-4)um的短粗壮杆菌，呈单独，成双或短链排列(见图1)。51.②生理、生化特征：生化指标鉴定结果显示，其中邻硝基苯-β-d-吡喃半乳糖苷(onpg)、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、柠檬酸、硫化氢、脲酶、乳糖、明胶、肌醇、鼠李糖均成阳性；vp、吲哚、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁甙、阿拉伯糖、氧化酶均为阴性。52.(2)菌株w6的16s rdna序列及菌株保藏信息53.采用分子克隆方法进行菌株w6的16s rdna基因扩增与测定。经上海生工生物工程有限公司测序。w6菌株的16s rdna序列，如seq id no.1所示，基因全长1438bp，经ncbi数据库同源性序列比对分析，结果表明，菌株w6与klebsiella sp的亲缘关系最接近，具有99％的相似性，如图2所示，系统发育进化分析也表明该菌株属于klebsiella sp菌属。54.实施例3好氧反硝化细菌克雷伯氏菌w6的反硝化能力的测定55.对w6在反硝化基础培养基(dm培养基)中培养过程中进行总氮、硝酸盐(no3-‑n)和亚硝酸盐(no2-‑n)浓度测定，如图3-5所示，结果表明：9天内，no3-‑n含量呈明显下降趋势，从0天-第1天下降最快，之后呈持续下降趋势。no2-‑n含量先增加后减少最高值为38.35mg/l。总氮含量明显下降，因此，克雷伯氏菌w6菌株具备良好的脱氮性能，且具备反硝化功能。dm培养基的配方为：ch3coona 1.54g/l，mgso4·7h2o 0.10g/l，k2hpo4·3h2o 6.00g/l，kh2po4 1.50g/l，nacl 30.00g/l，kno3 1.44g/l，微量元素2.00ml，ph 7.50；微量元素的组成及终浓度为：edta5g/l，cacl2 5.5g/l，cuso4·5h2o 0.25g/l，feso4·7h2o 0.5g/l，znso4 0.43g/l，cocl2·6h2o 0.24g/l，mncl2·4h2o 0.99g/l，h3bo4 0.014g/l；硝基氮(no3-)浓度为200mg/l，含量为100mg。56.在初始硝酸氮浓度988.05mg/l的条件下，用dm培养基，测定了菌株w6在48h内3种氮含量的变化。每隔12h采集一次进行测定，分析tn、no3-‑n、no2-‑n。实验在最佳预测值条件下连续培养48小时，并设立3个平行组，计算平均值和误差值，其结果如表1、图6、图7所示：在12h内，硝酸氮的去除率为58.62％，去氮速率达48.27mg/l·h-1。在48h时内，总氮的去除率达到61.33％，去氮速率为12.62mg/l·h-1，硝酸氮的去除率达68.24％，去氮速率为14.05mg/l·h-1。w6菌在前12h时，去氮速率最高。57.表1菌株w6在48h内的去氮率与去氮速率[0058][0059]实施例4反硝化功能基因的扩增与反硝化通路验证[0060]使用特定基因设计的特异性引物对基因进行pcr扩增。一共设计了四对引物，分别是膜结合硝酸盐还原酶(narghi)、亚硝酸还原酶(nir)、一氧化氮还原酶(norb)、一氧化亚氮还原酶(nosz)。其组成了完整的反硝化代谢通路，表2总结了对应于选定基因的引物和预期的pcr产物大小，其引物是使用ncbi primer blast工具设计。所使用的引物由上海生工生物工程有限公司合成。pcr产物由上海生工生物工程有限公司进行测序。[0061]电泳图如图8所示。pcr结果表明，所选基因的特异性引物产生了与特定pcr产物大小相对应的pcr条带。证实了w6菌对相应基因的遗传潜力，也表明了w6具有完整的反硝化代谢通路，其终产物为n2，具有良好的应用前景。[0062]表2反硝化基因引物表[0063]









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