6号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效QTL紧密连锁的InDel标记及其应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术6号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效qtl紧密连锁的indel标记及其应用技术领域：1.本发明涉及6号染色体上一种与水稻黑条矮缩病抗性主效qtl紧密连锁的分子标记qrbsdv6m1和qrbsdv6m2，可应用于分子标记辅助育种，属于水稻抗病育种和分子生物学领域。背景技术：2.水稻黑条矮缩病是由水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus， rbsdv)引起的一种恶性病毒病，由灰飞虱以持久性不经卵的方式传播。感染rbsdv的水稻病株发育受到影响，结实率降低，减产严重。20世纪60及 90年代后期该病害在华北、华东等地暴发成灾。近年来，感病水稻品种的广泛种植和稻麦轮作方式的推广以及冬季气候变暖等环境条件的变化使传毒介体灰飞虱的发生量不断上升，导致该病害在华东稻区大面积发生。3.迄今为止，尚没有能有效防治病毒病的化学药剂，通过杀虫剂来抑制病毒传播的应急措施对环境有害并且成本高昂，无法作为一项长期策略。利用品种自身抗病性是防治病毒病最为经济、有效的方法。水稻对rbsdv的抗性是由多个基因控制的复杂性状，目前对于水稻黑条矮缩病抗性遗传的研究只有初步定位结果，有超过30个qtl与rbsdv的抗性相关，分布在除12号染色体之外的其它所有染色体上，表明不同来源的水稻资源中可能存在差异化的水稻黑条矮缩病抗性机制，而且遗传机制较为复杂。充分了解其分子遗传机制是高效准确分子育种的基础，但目前还没有水稻黑条矮缩病抗病基因被克隆及育种应用的报道，严重影响了针对黑条矮缩病的水稻抗性育种进展。4.水稻黑条矮缩病重病区田间鉴定方便快捷，但易受环境条件、年度和区域间灰飞虱发生情况(发生量和带毒率)不一致等因素的影响，导致不同研究间抗性鉴定结果相差较大，并且由于灰飞虱同时传播水稻条纹叶枯病，会干扰田间鉴定结果。人工接种鉴定是在可控条件下开展的一种抗性鉴定方法，利用其评价水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平，能够很好地克服田间鉴定中难以规避的问题，但是由于rbsdv不经灰飞虱卵传，使得该方法相对费时费力。导致抗性鉴定成为制约水稻黑条矮缩病抗性育种工作的一个重要原因。5.分子标记辅助育种技术可以有效解决上述问题。利用源自不同国家和地区具有不同抗性的水稻品种，通过关联分析获得与抗病品种vandana第6号染色体上抗病主效qtl连锁的分子标记，可以对该抗病品种的后代及其衍生品系在苗期进行早世代筛选，能够有效筛选出抗病植株，淘汰感病植株，在节约成本的同时大大提高了育种效率。技术实现要素：6.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了能够有效筛选水稻抗黑条矮缩病基因的分子标记及所述分子标记的使用方法。7.本发明利用来源于不同国家和地区对黑条矮缩病抗性不同的509份水稻种质资源，通过包含700kb位点的snp芯片数据和抗病性鉴定结果间的关联分析，获得了与抗病品种vandana第6号染色体上黑条矮缩病抗性主效qtl 连锁的snp标记snp-6.1148209，比较抗病品种vandana和感病品种日本晴在该位点的序列信息，根据抗病品种及感病品种间的序列差异开发indel分子标记qrbsdv6m1和qrbsdv6m2，可应用于水稻黑条矮缩病抗病品种的辅助选择育种。8.本发明所提供的6号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效qtl紧密连锁的分子标记qrbsdv6m1和qrbsdv6m2，是通过以下方法获得的：9.1)收集来源于不同国家和地区对黑条矮缩病抗性不同的509份水稻种质资源，结合自然发病和人工接种鉴定各水稻种质对黑条矮缩病的抗病性；10.2)ctab法提取509份水稻种质资源dna；11.3)通过全基因组关联分析定位抗黑条矮缩病qtl，其中位于6号染色体的主效qtl与snp标记snp-6.1148209紧密连锁，该抗病等位基因存在于抗病水稻种质vandana中；12.4)通过重测序分析抗病品种vandana位于snp-6.1148209区段的基因组序列，与感病品种日本晴相应区段序列比对，寻找indel(插入缺失)位点并设计引物qrbsdv6m1和qrbsdv6m2。13.6号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性主效qtl紧密连锁的分子标记 qrbsdv6m1和qrbsdv6m2的应用包括：以vandana及其衍生品种(系) 与感病品种杂交组合后代的单个水稻植株为对象，通过检测其6号染色体上 qrbsdv6m1和qrbsdv6m2标记的带型数据，可以预测该植株对水稻黑条矮缩病的抗性。14.本发明能克服常规育种中水稻黑条矮缩病抗性鉴定稳定性、重复性差及费时费力等缺点，其结果能够简化选择方法并提高育种效率，进而加快抗病品种的育种进程。附图说明：15.图1利用509份水稻种质资源通过snp芯片数据结合自然发病及人工接种鉴定进行关联分析的结果16.图2抗病品种vandana和感病品种日本晴在snp-6.1148209区段的基 因组序列存在插入-缺失差异17.具体实施方式：18.下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。19.实施例1，与水稻黑条矮缩病抗性主效qtl紧密连锁的分子标记的获得20.1、植物材料21.从72个国家或地区的水稻群体中，选取509份水稻材料，包括籼稻、粳稻、aus稻和芳香稻，进行水稻黑条矮缩病抗性鉴定。22.2、病毒来源及病毒接种23.(1)水稻黑条矮缩病毒采集自河南开封、江苏建湖、江苏南京等地，采集4-5叶龄的水稻黑条矮缩病疑似病株，用rbsdv特异性引物进行rt-pcr 检测。将rbsdv阳性植株进行人工接种鉴定，经过检测确认后移栽到本实验室试验田保存毒源，用于饲毒试验。24.(2)灰飞虱来自实验室保存的成虫群体，在rbsdv阳性水稻植株上饲养7天。然后将灰飞虱转移到健康的武育粳3号水稻苗上持续8天，使rbsdv 在灰飞虱体内渡过循回期。用斑点酶联免疫吸附试验(dot-elisa)测定灰飞虱群体的带毒率。25.3、水稻黑条矮缩病抗性评价26.2015年和2016年，河南省开封市水稻黑条矮缩病流行，将509份水稻材料种植于该地区自然感病。为了确保有足够的含毒昆虫，选择周边麦田曾发生小麦绿矮病(同样由rbsdv引起的)的田块作为水稻秧田。在小麦收获前两周，播种水稻品种。一个月后，秧苗被移栽到江苏句容水稻田中，显症前不施用杀虫剂或抗病毒药物，栽培与正常田间管理相同。移植后1个月，记录水稻黑条矮缩病的发病率。与健康植株相比，病株表现出极显著的矮化现象，叶片僵硬，呈深绿色，叶背、叶鞘、茎部呈蜡白色凸起。对每一个品种或品系进行三次重复。以重复数的平均值作为表型值。以发病率(水稻黑条矮缩病感染株数/总株数×100％)为指标，评价其对水稻黑条矮缩病的抗性。27.人工接种试验在江苏省农业科学院进行，将水稻播种于500ml烧杯中，在 1.5叶期，根据灰飞虱带毒率，按每株水稻苗接种2头带毒灰飞虱的强度接种 48小时。移除灰飞虱后将秧苗移栽到江苏省农科院的水泥池试验区，在水稻生长期不喷洒农药和抗病毒药物，其他栽培管理按常规田间管理进行按标准管理。调查和数据处理方法与田间自然发病鉴定试验相同。28.4、水稻植株dna提取(ctab法)29.1)称取500mg水稻叶片置于2.0ml eppendorf管中，将离心管置于液氮中冷却，灌满液氮后迅速取出，用研磨棒研磨成粉末状；30.2)65℃条件下水浴0.5h，每隔10min震荡1次；31.3)4℃条件下12,000rpm离心10min，取上层水相；32.4)加入900μl氯仿：异戊醇溶液(24∶1)，充分混匀震荡至溶液颜色由绿色变为白色；33.5)4℃条件下12,000rpm离心10min，取上层水相；34.6)加入等体积异丙醇(或2倍体积无水乙醇)，-20℃静置20-30min，沉淀出絮状dna；35.7)4℃条件下12,000rpm离心10min，弃上清，加入1ml70％乙醇洗涤， 4℃条件下12,000rpm离心5min，弃上清并用滤纸吸干，置于超净台上晾干。36.8)加30μl去离子水溶解dna，4℃保存备用。37.用eppendorf biophotometer plus核酸蛋白测定仪测定od值和浓度，将各样品dna稀释至20ng/μl备用。38.5、全基因组关联分析39.利用基于illumina平台的700kb芯片分析水稻植株的基因型。根据缺失数据小于15％和次要等位基因频率(maf)＞0.05的标准，用gapit v2进行gwas 分析。采用带亲属关系矩阵的混合线性模型，pca在gapit中进行。曼哈顿图采用cmr软件包绘制。以水稻基因组序列版本msu v7.0作为分析参考。40.结合700kb的snp数据，采用gwas对田间自然接种和人工接种的表型数据进行标记定位(p＜10-4)，在水稻品种vandana的6号染色体上定位了一个主效qtl qrbsdv6，与snp标记snp-6.1148209紧密连锁(图1)，p值达 3.24e-06。41.6、snp-6.1148209区段在vandana和感病品种日本晴间存在差异42.为开发方便使用的分子标记，我们对vandana进行了基因组的重测序组装，比对已知基因组序列的日本晴，发现在snp-6.1148209位点存在indel (插入缺失)变异(图2)。利用primer5设计引物qrbsdv6m1，qrbsdv6m2 用于检测indel。43.qrbsdv6m1 forward：tggttgtgcttgtgcttgac44.qrbsdv6m1 reverse：acttagcttgatgtggtgttgc45.qrbsdv6m2 forward：cccatgtgggaagagagcag46.qrbsdv6m2 reverse：gtctagtgggcccatgcgttag47.7、pcr扩增及检测48.采用20μl的pcr反应体系(表1)；49.pcr反应程序：94℃变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸10min，4℃保存，采用2％琼脂糖凝胶检测上述pcr反应产物。50.表1 pcr反应体系[0051][0052]实施例2，6号染色体上与水稻黑条矮缩病抗性qtl紧密连锁的分子标记在以vandana与金镶玉及8387为亲本的杂交组合后代中的应用。[0053]6号染色体上获得的与水稻黑条矮缩病抗性qtl紧密连锁的indel标记，对vandana与金镶玉及8387杂交的f2∶3家系的部分单株进行了水稻黑条矮缩病抗性预测，分别提取各单株dna，然后用indel标记qrbsdv6m1和 qrbsdv6m2的引物进行pcr扩增分析，通过带型分析来确定是否存在相应标记，存在标记说明该株系对水稻黑条矮缩病具有抗性，不存在则是感病。随后利用人工接种鉴定的方法测定受试株系水稻黑条矮缩病实际抗性并与预测结果进行比对，结果显示(表2，3)，预测结果与实际检测结果相吻合。[0054]表2利用qrbsdv6m1及qrbsdv6m2预测vandana/金镶玉杂交后代f2∶3的黑条矮缩病抗性[0055][0056][0057]表3利用qrbsdv6m1及qrbsdv6m2预测vandana/8387杂交后代f2∶3的黑条矮缩病抗性[0058][0059]上述实施不以任何形式限定本发明。









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