通过超声和印迹基因检测联合鉴别甲状腺结节良恶性方法与流程 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及疾病检测领域，具体地，涉及通过超声和印迹基因检测联合鉴别甲状腺结节良恶性方法。背景技术：2.根据人群大样本统计分析，大约三分之二的成年人都有在超声下可以观察到的甲状腺结节，但其中只有约5％是恶性的。一方面，随着超声筛查的普及，甲状腺结节过度诊断的问题日益凸显。另一方面，淋巴结和血行转移的甲状腺癌和低分化甲状腺癌预后较差，需要早期发现和早期治疗。目前的甲状腺结节术前诊断依据超声分级和细针穿刺细胞学，但仍然有20-30％的样本无法明确诊断。基因检测在辅助甲状腺结节诊断中起到了重要作用，但是最常用的braf突变检测仅存在与约60-70％的甲状腺乳头状癌，对30％的甲状腺乳头状癌，以及占甲状腺癌总发病率约15％的甲状腺滤泡癌等其他甲状腺癌无法诊断。临床亟需一种能够在术前准确判断甲状腺结节良恶性的方法，指导治疗方案的选择。技术实现要素：3.本发明的目的在于提供一种通过超声和印迹基因检测联合鉴别甲状腺结节良恶性的方法。4.本发明第一方面提供一种通过超声和印迹基因检测联合鉴别甲状腺结节良恶性的方法，所述的方法包括步骤：5.(1)使用针对snrpn基因和hm13基因的nascent rna序列设计的探针，分别在甲状腺细胞样本中进行snrpn和hm13基因的原位杂交；6.(2)显色后在显微镜下计数甲状腺细胞核，根据细胞核内的信号点的数量对细胞核进行分类，分别计算双等位基因表达(biallelic expression,bae)、多等位基因表达(multiallelic expression,mae)和总表达(total expression,te)三个参数，公式如下：7.bae＝(两个信号点的细胞核数量)/(一个信号点的细胞核数量+两个信号点的细胞核数量+三个或更多信号点的细胞核数量)；8.mae＝(三个或更多信号点的细胞核数量)/(一个信号点的细胞核数量+两个信号点的细胞核数量+三个或更多信号点的细胞核数量)；9.te＝(一个信号点的细胞核数量+两个信号点的细胞核数量+三个或更多信号点的细胞核数量)/细胞核总数量；10.其中，印迹基因恶性风险分级模型如下：11.snrpn的te小于20％计0分，大于或等于20％计1分；12.snrpn的bae小于20％计1分，在20％-30％之间计2分，大于30％计3分；13.snrpn的mae小于3％计1分，在3％-5.5％之间计2分，大于5.5％计3分；14.snrpn基因的分值＝te分值×(bae和mae分值中的较大者)；15.hm13的te小于11％计0分，大于或等于11％计1分；16.hm13的bae小于20％计1分，在20％-30％之间计2分，大于30％计3分；17.hm13的mae小于3.5％计1分，在3.5％-6.5％之间计2分，大于6.5％计3分；18.hm13基因的分值＝te分值×(bae和mae分值中的较大者)；19.印迹风险分值＝snrpn基因的分值×0.3+hm13基因的分值×0.7；20.印迹风险分级(imprinting risk grade,irg)：风险分值小于1.5为irg 1级，在1.5-2.5之间为irg 2级，大于2.5为irg 3级；21.(3)k-ti-rads 1-5类，对甲状腺结节良恶性进行如下判断：[0022][0023]其中，恶性风险小于50％判断为甲状腺良性结节，恶性风险大于或等于50％判断为甲状腺恶性结节。[0024]优先地，所述的步骤(1)中，所述的甲状腺细胞样本通过以下方法制备：[0025](a)将甲状腺细针穿刺得到的甲状腺样本注入福尔马林中，固定；[0026](b)取出甲状腺细胞置于正电荷载玻片上，烤干，得到甲状腺细胞样本。[0027]优先地，所述的步骤(a)中，福尔马林的浓度为8-12％。[0028]优先地，所述的步骤(a)中，所述的固定为室温固定。[0029]优先地，所述的步骤(a)中，所述的固定的时间为20-30h。[0030]优先地，所述的步骤(1)中，根据rnascope试剂盒的操作方法，分别在甲状腺细胞样本中进行snrpn和hm13基因的原位杂交。[0031]优先地，所述的步骤(2)中，所述的信号点包括红色信号点和/或棕色信号点。[0032]优先地，所述的步骤(3)中，根据kwak甲状腺影像报告及数据系统(k-ti-rads)对甲状腺结节的超声特征计分，得到k-ti-rads 1-5类。[0033]本发明第二方面，提供一种装置或系统，包括：[0034]处理器；以及[0035]存储器，存储有计算机指令，当所述计算机指令被所述处理器执行时，使得所述处理器执行如本发明第一方面所述的通过超声和印迹基因检测联合鉴别甲状腺结节良恶性的方法。[0036]如本发明第三方面，提供一种非瞬时性计算机存储介质，存储有计算机程序，当所述计算机程序被一个或多个处理器执行时，使得所述处理器执行如本发明第一方面所述的通过超声和印迹基因检测联合鉴别甲状腺结节良恶性的方法。[0037]在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。附图说明[0038]图1为甲状腺细胞核内红色或棕色信号点。具体实施方式[0039]表观遗传的变化通常发生在肿瘤的最早期，印迹基因是一类受表观遗传调控的基因，正常情况下只有一条等位基因表达，另一条由于高度甲基化而处于沉默状态。肿瘤发生时，印迹基因处于沉默状态的一条等位基因发生去甲基化，开始表达，从而形成双等位基因表达状态。在快速生长的甲状腺肿瘤中，印迹基因还会发生拷贝数的增加，形成多等位基因表达的状态。本发明通过原位杂交技术使用识别nascent rna的探针直接标记细胞核内印迹基因的表达位点，根据细胞核内表达位点数量对细胞核进行分类，分别统计不同分类的细胞比例，计算得到甲状腺结节的恶性风险分级，将该恶性风险分级与根据kwak甲状腺影像报告及数据系统(k-ti-rads)得到的超声分级联合，计算得到更准确的甲状腺结节恶性风险，从而对甲状腺结节的良恶性做出判断。[0040]术语[0041]如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。[0042]如本文所用，术语“snrpn”是指small nuclear ribonucleoprotein polypeptide n。[0043]如本文所用，术语“hm13”是指minor histocompatibility antigen h13。[0044]如本文所用，术语“k-ti-rads”是指kwak thyroid imaging reporting and data system(kwak甲状腺影像报告及数据系统)。k-ti-rads是指kwak等提出了新的ti-rads，操作较简便，临床较为实用。该分类系统使用结节内部结构、内部回声、结节边缘、钙化和形态等5个指标，将实性结构、低回声或极低回声、边缘微小分叶或不规则、微钙化、纵横比＞1和颈部淋巴结转移或周围组织浸润作为恶性特征，然后根据结节出现这些恶性特征的数目确定分类等级：[0045]ti-rads 1类：阴性(无任何异常)(恶性率0)；[0046]ti-rads 2类：确认良性病变(恶性率0)；[0047]ti-rads 3类：(无可疑超声表现)(恶性率1.7％)[0048]ti-rads 4类：[0049](1)4a(1个可疑超声表现)(恶性率3.3％)[0050](2)4b(2个可疑超声表现)(恶性率9.2％)[0051](3)4c(3～4个可疑超声表现)(恶性率44.4％～72.4％)[0052]ti-rads 5类：(5个可疑超声表现)(恶性率87.5％)[0053]ti-rads 6类：活检证实的恶性病灶。[0054]方法[0055]本发明提供一种通过超声和印迹基因检测联合鉴别甲状腺结节良恶性的方法，所述的方法包括步骤：[0056](1)使用针对snrpn基因和hm13基因的nascent rna序列设计的探针，分别在甲状腺细胞样本中进行snrpn和hm13基因的原位杂交；[0057](2)显色后在显微镜下计数甲状腺细胞核，根据细胞核内的信号点的数量对细胞核进行分类，分别计算双等位基因表达(biallelic expression,bae)、多等位基因表达(multiallelic expression,mae)和总表达(total expression,te)三个参数，公式如下：[0058]bae＝(两个信号点的细胞核数量)/(一个信号点的细胞核数量+两个信号点的细胞核数量+三个或更多信号点的细胞核数量)；[0059]mae＝(三个或更多信号点的细胞核数量)/(一个信号点的细胞核数量+两个信号点的细胞核数量+三个或更多信号点的细胞核数量)；[0060]te＝(一个信号点的细胞核数量+两个信号点的细胞核数量+三个或更多信号点的细胞核数量)/细胞核总数量；[0061]其中，印迹基因恶性风险分级模型如下：[0062]snrpn的te小于20％计0分，大于或等于20％计1分；[0063]snrpn的bae小于20％计1分，在20％-30％之间计2分，大于30％计3分；[0064]snrpn的mae小于3％计1分，在3％-5.5％之间计2分，大于5.5％计3分；[0065]snrpn基因的分值＝te分值×(bae和mae分值中的较大者)；[0066]hm13的te小于11％计0分，大于或等于11％计1分；[0067]hm13的bae小于20％计1分，在20％-30％之间计2分，大于30％计3分；[0068]hm13的mae小于3.5％计1分，在3.5％-6.5％之间计2分，大于6.5％计3分；[0069]hm13基因的分值＝te分值×(bae和mae分值中的较大者)；[0070]印迹风险分值＝snrpn基因的分值×0.3+hm13基因的分值×0.7；[0071]印迹风险分级(imprinting risk grade,irg)：风险分值小于1.5为irg 1级，在1.5-2.5之间为irg 2级，大于2.5为irg 3级；[0072](3)根据kwak甲状腺影像报告及数据系统(k-ti-rads)对甲状腺结节的超声特征计分，得到k-ti-rads 1-5类，对甲状腺结节良恶性进行如下判断：[0073][0074]其中，恶性风险小于50％判断为甲状腺良性结节，恶性风险大于或等于50％判断为甲状腺恶性结节。[0075]具体地，本发明所述的通过超声和印迹基因检测联合鉴别甲状腺结节良恶性的方法如上本发明第一方面所述。[0076]本发明的主要优异技术效果包括：[0077]本发明首次开发一种通过超声和印迹基因检测联合鉴别甲状腺结节良恶性的方法，所述方法通过甲状腺结节超声分级和细针穿刺细胞的印迹基因表达状态对结节的良恶性做出判别。本发明所述的方法将影像学和表观遗传分子标志物联合，可以在术前更准确的鉴别甲状腺结节的良恶性，提高甲状腺癌的早期检出率，同时避免对良性结节进行不必要的手术。[0078]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下具体实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。[0079]实施例1通过超声和印迹基因检测联合鉴别甲状腺结节良恶性的系统[0080]1.检测方法[0081](1)将甲状腺细针穿刺得到的甲状腺样本注入10％福尔马林中，室温固定24小时。[0082](2)取出甲状腺细胞置于正电荷载玻片上，烤干。[0083](3)使用针对snrpn(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide n)基因和hm13(minor histocompatibility antigen h13)基因的nascent rna序列设计的探针，根据rnascope试剂盒的操作方法，分别在甲状腺细胞样本中进行snrpn基因和hm13基因的原位杂交。[0084](4)显色后在显微镜下计数2000个甲状腺细胞核，根据细胞核内红色或棕色信号点(见附图1)的数量对细胞核进行分类，分别计算双等位基因表达(biallelic expression,bae)、多等位基因表达(multiallelic expression,mae)和总表达(total expression,te)三个参数，公式如下：[0085]bae＝(两个信号点的细胞核数量)/(一个信号点的细胞核数量+两个信号点的细胞核数量+三个或更多信号点的细胞核数量)。[0086]mae＝(三个或更多信号点的细胞核数量)/(一个信号点的细胞核数量+两个信号点的细胞核数量+三个或更多信号点的细胞核数量)。[0087]te＝(一个信号点的细胞核数量+两个信号点的细胞核数量+三个或更多信号点的细胞核数量)/细胞核总数量。[0088]2.印迹基因恶性风险分级模型：[0089]snrpn的te小于20％计0分，大于或等于20％计1分。[0090]snrpn的bae小于20％计1分，在20％-30％之间计2分，大于30％计3分。[0091]snrpn的mae小于3％计1分，在3％-5.5％之间计2分，大于5.5％计3分。[0092]snrpn基因的分值＝te分值×(bae和mae分值中的较大者)。[0093]hm13的te小于11％计0分，大于或等于11％计1分。[0094]hm13的bae小于20％计1分，在20％-30％之间计2分，大于30％计3分。[0095]hm13的mae小于3.5％计1分，在3.5％-6.5％之间计2分，大于6.5％计3分。[0096]hm13基因的分值＝te分值×(bae和mae分值中的较大者)。[0097]印迹风险分值＝snrpn基因的分值×0.3+hm13基因的分值×0.7。[0098]印迹风险分级(imprinting risk grade,irg)：风险分值小于1.5为irg 1级，在1.5-2.5之间为irg 2级，大于2.5为irg 3级[0099]3、超声风险分层[0100]根据《kwak甲状腺影像报告及数据系统》(《kwak thyroid imaging reporting and data system》)(k-ti-rads)，对甲状腺结节的超声特征计分，得到k-ti-rads 1-5类。超声和印迹基因联合判断恶性风险：[0101]按以下表1计算恶性风险：[0102]表1[0103] k-tr 1k-tr 2k-tr 3k-tr 4ak-tr 4bk-tr 4ck-tr 5irg 10％0％0％0％10％30％90％irg 20％0％10％30％70％90％95％irg 30％0％30％70％90％95％》95％[0104]备注：k-tr是指k-ti-rads。[0105]表1中恶性风险小于50％可判断为甲状腺良性结节，恶性风险大于或等于50％可判断为甲状腺恶性结节。[0106]以上表1中恶性风险数据从实至少300例临床样本中进行进一步的证实，临床式样结果如下表2所示。[0107]表2临床病例检测结果[0108][0109][0110][0111]备注：k-tr是指k-ti-rads。[0112]从表2中可以看出，通过超声和印迹基因检测联合能够用于鉴别甲状腺结节良恶性。[0113]以上所述是本发明针对一种案例设计的实施方案，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下还可以作出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。









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