一种丹知青娥片特征图谱的构建及质量控制方法与流程 专利技术说明

测量装置的制造及其应用技术1.本发明涉及中药检测领域，具体涉及一种丹知青娥片特征图谱的构建及质量控制方法。背景技术：2.丹知青娥片是在《太平惠民和剂局方》中的“青娥丸”(以下简称“青娥方”)的基础上，根据临床实践经验，从“补阳法”入手，保留“青娥方”中补肾助阳的盐杜仲等，增加活血化瘀的丹参和清热除烦的知母，即以盐杜仲、丹参、知母等中药饮片经科学方法提取精制而成的纯中药制剂，其中，各组分的重量份为：盐补骨脂1份、丹参2份、盐杜仲2份、知母1份。3.丹知青娥片为含多种有效成分的复方制剂，其主要指标成分有补骨脂素、异补骨脂素、丹酚酸b、芒果苷及绿原酸等；具有补益肝肾、清热除烦的功能，用于肝肾亏虚之围绝经期、绝经期综合征者，症见潮热、多汗、烦躁、心悸、乏力，腰膝酸软；或见畏寒肢冷，舌质淡红或偏红或有瘀斑，苔薄白，脉沉细。4.目前，对丹知青娥片的质量控制方法主要是各药材的薄层鉴别、以及补骨脂、丹参、知母中指标成分的含量测定，该方法虽能在一定程度上控制丹知青娥片的质量，但还是无法全面的反映其质量状况，例如，盐杜仲作为君药存在，但没有合适的指标来评价和控制其质量。且现有技术中公开的丹知青娥片的质量标准研究中，无法同时实现对所有原料种类的指标成分进行整体检测，且各个指标成分均是分别采用不同的色谱条件进行检测，例如：其中丹参的指标成分丹酚酸b需要以乙腈-0.1％甲酸水溶液(24:76)为流动相，在286nm波长下检测；补骨脂中的指标成分补骨脂素和异补骨脂素需要以甲醇-水(51:49)为流动相，在246nm波长下检测；知母中的指标成分芒果苷需要以乙腈-0.2％冰醋酸水溶液(12:88)为流动相，在258nm波长下检测，检测十分不便。为了弥补现有丹知青娥片质量控制方法的缺陷，有必要构建该产品的标准特征图谱，以便更好的进行产品的质量控制。技术实现要素：5.因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中没有能有效实现丹知青娥片整体质量控制的方法的缺陷，从而提供只需一个色谱条件即可同时实现包含盐补骨脂、丹参、盐杜仲、知母的指标成分检测的一种丹知青娥片特征图谱的构建及质量控制方法。6.一种丹知青娥片特征图谱的构建方法，采用以下色谱条件对供试品溶液进行梯度洗脱：7.色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为40℃～45℃；流动相a为0.2％的甲酸水溶液，流动相b为甲醇；8.所述梯度洗脱程序为：[0009][0010][0011]供试品溶液的制备方法为：取质量为m1的供试品，精密称定，加溶剂进行超声处理，放冷，加溶剂定容至体积v1，摇匀，离心取上清或过滤取续滤液，得到供试品溶液。[0012]所述离心条件为13000rpm～20000rpm离心5min～15min；[0013]所述滤过条件为0.22um～0.80um微孔滤膜过滤；[0014]和/或，所述超声条件为220v、600w，超声10min～30min；[0015]和/或，所述溶剂为甲醇或体积浓度大于50％的甲醇水溶液；[0016]所述m1与v1的料液比为1g：(80～500)ml。[0017]所述m1与v1的料液比为1g：(200～300)ml，优选为1g：250ml。[0018]所述色谱柱的规格为4.6mm×150mm，5μm；[0019]和/或，所述检测波长为190nm～400nm；[0020]和/或，所述柱温为35℃～45℃；[0021]和/或，所述流速为1.0ml·min-1；[0022]和/或，所述进样量为5μl～10μl。[0023]所述检测波长为254nm。[0024]一种丹知青娥片的质量控制方法，包括：[0025]采用上述的一种丹知青娥片的特征图谱的构建方法获取供试品的特征图谱，所述供试品的特征图谱中至少包括与绿原酸、芒果苷、丹酚酸b、补骨脂素相对应的四个特征峰。[0026]所述待测供试品的特征图谱中至少包括与标准特征图谱相对应的10个特征峰。[0027]待测供试品的特征图谱中至少包括与标准特征图谱中绿原酸、芒果苷、丹酚酸b、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、补骨脂二氢黄酮甲醚、丹参酮ⅱa和补骨脂酚相对应的特征峰。[0028]所述标准特征图谱中，参照物峰相应的峰为s峰，计算其他各个特征峰与s峰的相对保留时间；在待测丹知青娥片的特征图谱中，与标准特征图谱相对应的特征峰的相对保留时间与标准特征图谱中相应特征峰的相对保留时间之间的相对标准偏差在±5％以内。[0029]本发明技术方案，具有如下优点：[0030]1、本发明提供的一种丹知青娥片特征图谱的构建方法中，通过色谱条件以及供试品溶液的优化配合，只需进行一次梯度洗脱即可至少有效同时实现包含盐补骨脂、丹参、盐杜仲、知母的指标成分的检测，具体的，至少可以同时实现补骨脂素、绿原酸、丹酚酸b和芒果苷四种指标成分的含量测定，检测周期短、快速、效率高，且该方法操作简便、专属性强，为丹知青娥片的整体质量控制提供良好前提。[0031]2、本发明提供的一种丹知青娥片的质量控制方法中，可以至少同时实现补骨脂素、绿原酸、丹酚酸b和芒果苷四种指标成分的控制，达到同时鉴别盐补骨脂、丹参、盐杜仲、知母的指标成分的目的，更全面地反应丹知青娥片质量整体特征，满足丹知青娥片整体质量控制的要求。[0032]3、本发明进一步限定了特征峰成分，采用峰面积较大、峰形和分离度较好的绿原酸、芒果苷、丹酚酸b、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、补骨脂二氢黄酮甲醚、丹参酮ⅱa和补骨脂酚10个色谱峰为特征指纹峰，更加全面的地实现丹知青娥片整体质量控制，提高整体质量控制的精准性。附图说明[0033]为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。[0034]图1是本发明中供试品溶液的特征图谱；[0035]图2是本发明中对照品参照物溶液的特征图谱；[0036]图3是本发明中供试品溶液在45℃条件下检测得到的指纹图谱；[0037]图4是本发明中供试品溶液在35℃条件下检测得到的指纹图谱；[0038]图5是本发明中供试品溶液在50℃条件下检测得到的指纹图谱。具体实施方式[0039]实施例1[0040]一种丹知青娥片特征图谱的构建方法，包括：[0041](1)供试品的制备：称取丹知青娥片粉末(过三号筛)0.2g，精密称定，置于25ml量瓶内，加入适量甲醇，超声处理(电压220v、功率600w)20分钟，取出，放置室温，甲醇定容至刻度，摇匀，20000rpm离心5min，取上清即得；[0042](2)对照品参照物溶液的制备：[0043]取绿原酸、芒果苷、丹酚酸b、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂宁、补骨脂二氢黄酮甲醚、丹参酮ⅱa、补骨脂酚对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并制成每1ml含绿原酸50.2μg、芒果苷51.3μg、丹酚酸b49.8μg、补骨脂素50.2μg、异补骨脂素49.6μg、新补骨脂异黄酮52.5μg/、补骨脂宁48.9μg、补骨脂二氢黄酮甲醚52.3μg、丹参酮ⅱa50.4μg、补骨脂酚51.7μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。[0044](3)测定法：分别精密吸取对照品参照溶液与供试品溶液各5ul，注入液相色谱仪，液相色谱仪的色谱条件为：[0045]流动相a为体积浓度为0.2％的甲酸水溶液，流动相b为甲醇，按照下表1所示的梯度洗脱程序进行梯度洗脱；检测波长为254nm；柱温为40℃；流速1.0ml/min；色谱柱为agilenteclipsexdb-c18，色谱柱的规格为4.6mm×150mm，填料粒度为5μm。[0046]表1[0047][0048]上述检测得到的对照品参照溶液与供试品溶液的特征图谱分别如图1和图2所示。[0049]通过图1和图2可知，本发明进行一次梯度洗脱获得色谱，至少有效同时实现盐补骨脂、丹参、盐杜仲、知母中指标成分的检测，例如：可以同时实现盐补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素、丹参中丹酚酸b、知母中芒果苷、盐杜仲中绿原酸等有效成分的检测。本发明方法检测周期短、快速、效率高，且该方法操作简便，可以实现所有原料的指标成分的检测，专属性强，因此用于丹知青娥片的整体质量控制。[0050]综上，在采用本发明特征图谱进行整体质量控制时，可以将待测丹知青娥片的色谱图与构建的标准特征图谱进行比对，若待测丹知青娥片的色谱图中出现标准特征图谱中相同的绿原酸、芒果苷、丹酚酸b、补骨脂素相对应的四个特征峰；优选的，待测丹知青娥片的色谱图与标准特征图谱相比，其中至少包括10个特征峰，与参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，各特征峰的相对保留时间与标准特征图谱中各特征峰的相对保留时间的相对标准偏差在±5％以内，则该丹知青娥片的质量合格，反之则不合格，如此可以实现快速检测判断丹知青娥片的质量。本实施例中，该10个特征峰分别为绿原酸(1号峰)、芒果苷(2号峰)、丹酚酸b(3号峰)、补骨脂素(4号峰)、异补骨脂素(5号峰)、新补骨脂异黄酮(6号峰)、补骨脂宁(7号峰)、补骨脂二氢黄酮甲醚(8号峰)、丹参酮ⅱa(9号峰)、补骨脂酚(10号峰)。[0051]本实施例中采用上述检测条件获取多批次丹知青娥片的指纹图谱，并得到标准特征图谱，该标准特征图谱中上述各个特征峰的参照物峰为异补骨脂素峰，各个峰与异补骨脂素色谱峰的相对保留时间分别为0.31、0.49、0.80、0.94、1.00、1.45、1.55、1.79、2.02、2.11。[0052]实施例2[0053]本实施例与实施例1的区别在于，供试品溶液制备中，溶剂采用体积浓度为50％的甲醇水溶液或75％的甲醇水溶液替换甲醇，其他与实施例1相同，测定各指标成分的峰面积，计算各指标成分峰面积与称样量比值(a/g)，检测结果如下表2所示。[0054]表2[0055][0056]由表2可知，当提取溶剂为纯甲醇时，丹知青娥片中除绿原酸外其他指标成分的测定值均相对较高，且不同提取溶剂得到的绿原酸的检测结果差异较小，综合考虑，选择纯甲醇为丹知青娥片的提取溶剂。[0057]实施例3[0058]本实施例与实施例1的区别在于，供试品溶液制备中，提取溶剂的料液比不同，具体的，分别取丹知青娥片粉末(0.3g、0.2g、0.1g)，精密称定，置于不同体积量瓶中(25ml、50ml)，按照实施例1的方法进行检测，测定各指标成分的峰面积，计算各指标成分峰面积与称样量比值(a/g)，检测结果如下表3所示。[0059]表3[0060][0061]由表3可知，与3:250、1:125和1:500相比，不同条件下指标成分的检测结果差异较小，料液比(m:v)为1:250时，丹知青娥片中指标成分的测定值相对较高，因此，确定最佳提取溶剂体积为1:250。[0062]实施例4[0063]供试品溶液制备中，提取时间不同，具体的，分别超声处理(电压220v、功率600w)不同时间(10分钟、20分钟、30分钟)，其他均按照实施例1的方法进行检测，测定各指标成分的峰面积，计算各指标成分峰面积与称样量比值(a/g)，检测结果如下表4所示。[0064]表4[0065][0066]由表4可知，与10min和30min相比，不同条件下指标成分的检测结果差异较小，当超声处理的时间为20min时，丹知青娥片中指标成分的测定值相对较高，因此，选择最佳提取时间为20min。[0067]实施例5[0068]本实施例与实施例1的区别在于，色谱洗脱时柱温调至45℃，按照实施例1的方法进行检测，检测色谱图如图3所示。[0069]由图3可知，按照实施例1的方法对供试品溶液进行检测，柱温45℃时，各成分色谱峰分离效果均良好。[0070]实施例6[0071]本实施例与实施例1的区别在于，供试品溶液制备时，采用的离心条件为13000rpm离心15min，其他与实施例1相同。[0072]实施例7[0073]本实施例与实施例1的区别在于，供试品溶液制备时，采用过滤取续滤液的方式获得供试品溶液，其他与实施例1相同，具体的，本实施例中采用0.22μm微孔滤膜过滤。[0074]实施例8[0075]本实施例与实施例1的区别在于，供试品溶液制备时，采用过滤取续滤液的方式获得供试品溶液，其他与实施例1相同，具体的，本实施例中采用0.80μm微孔滤膜过滤。[0076]按照实施例1的方法进行检测，测定各指标成分的峰面积，计算各指标成分峰面积与称样量比值(a/g)，上述实施例6-8的检测结果如下表5所示。[0077]表5[0078][0079]通过表5可知，不同条件下指标成分的检测结果差异较小，表明上述供试品溶液的工艺条件对检测结果影响较小。[0080]对比例1[0081]本对比例与实施例1的区别在于，色谱洗脱时柱温调至35℃，按照实施例1的方法进行检测，检测色谱图如图4所示。[0082]由图4可知，按照实施例1的方法对供试品溶液进行检测，柱温调至35℃或以下时，7号色谱峰(补骨脂宁)和8号色谱峰(补骨脂二氢黄酮甲醚)分离效果均较差。[0083]对比例2[0084]本对比例与实施例1的区别在于，色谱洗脱时柱温调至50℃，按照实施例1的方法进行检测，检测色谱图如图5所示。[0085]由图5可知，按照实施例1的方法对供试品溶液进行检测，柱温调至50℃或以上时，3号色谱峰(丹酚酸b)和7号色谱峰(补骨脂宁)分离效果均较差。[0086]实验例-精密度检测[0087]1、精密度试验[0088]1.1、日内精密度试验[0089]采用实施例1相同的制备方法配制供试品溶液，精密吸取同一份供试品溶液，重复进样6次测定各共有峰的峰面积和保留时间，以5号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果如表6和表7所示。[0090]表6[0091][0092]表7[0093][0094]通过表6和表7可知，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于2.47％，表明该方法精密度良好。[0095]1.2、日间精密度[0096]按照实施例1的方法配置一份供试品溶液，精密吸取同一份供试品溶液，每天重复进样6次，连续进样三天，测定各共有峰的峰面积和保留时间，以5号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果如表8和表9所示。[0097]表8[0098][0099]表9[0100][0101]通过上述表8和表9的数据可知，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于2.17％，表明该方法精密度良好。[0102]2、重复性[0103]由同一试验人员按照实施例1的方法平行制备6份供试品溶液，测定各共有峰的峰面积和保留时间，以5号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果如表10和表11所示。[0104]表10[0105][0106]表11[0107][0108]通过上述表10和表11的数据可知，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于1.72％，表明该方法重复性良好。[0109]3、稳定性[0110]取供试品溶液，室温放置，分别于不同时间点取样检测，考察供试品溶液在室温条件下的稳定性，测定各共有峰的峰面积和保留时间，以5号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，检测结果如表12-表13所示。[0111]表12[0112][0113]表13[0114][0115]通过表12和表13可知，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于2.11％，表明样品在室温条件下放置12h基本稳定。[0116]通过实验例的数据可知，通过系统的方法学考察，精密度、稳定性、重复性的相对保留时间和相对峰面积的rsd值均小于2.47％，说明构建的丹知青娥片指纹图谱方法符合指纹图谱研究要求。[0117]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。









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