一种Cs-4虫草菌粉提取物及其制备方法和应用与流程 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术一种cs-4虫草菌粉提取物及其制备方法和应用技术领域1.本发明涉及一种cs-4虫草菌粉提取物及其制备方法和应用，cs-4虫草菌粉提取组分具有治疗慢性肾衰竭的药理作用，属于医药技术领域。背景技术：2.市场上，金水宝系列产品所使用的cs-4虫草菌粉具有抗肺纤维化、抗肾衰、免疫抑制等临床应用优势。据文献报道cs-4虫草菌粉主要含有核苷类、甾醇、脂肪酸和氨基酸小分子成分，以及多糖、多肽大分子成分。在抗肾衰药物上，往往直接服用cs-4虫草菌粉，服用量的最小剂量为3g/日。而且cs-4虫草菌粉的成分较多，对抗肾衰疾病针对性不强，反而有可能其他组分对身体有其他影响。cs-4虫草菌粉不适合与某些药物同时使用，比如一些降压药、降糖药等，如果同时使用，容易引起药物相互作用，影响药效，甚至对身体造成不良影响。技术实现要素：3.本发明目的在于提供一种cs-4虫草菌粉提取物及其制备方法和应用，以及通过动物体内药效实验，以及动物药效学评价实验，确定上述两提取物可协同增效治疗慢性肾衰，减少用药量。4.一种cs-4虫草菌粉提取物的制备方法，首先采用乙醇作为溶剂，充分提取菌粉中不同极性小分子成分后，依次用石油醚、氯仿、乙醚萃取得到不同极性组分；其次将不同性质的组分用于体内药效实验；最后对有效组分进行动物药效学评价实验。5.优选的，本发明的制备方法如下：取cs-4虫草菌粉加8-10倍量乙醇，回流提取至少三次，每次0.5-1.5h，合并醇提液；将醇提液减压浓缩，得到稠膏，将稠膏减压干燥，粉碎，制得醇提物；取醇提物，加8-10倍量重量的水溶解，混合均匀；加入等体积的石油醚，搅拌，静置；分离萃取，合并石油醚层，弃去；取下层液体，加入等体积氯仿，搅拌，静置；分离萃取，合并氯仿层，将氯仿层减压浓缩，制得cs-4氯仿提取物；取上述氯仿萃取的上层液体，加入等体积乙醚，搅拌，静置；分离萃取，合并乙醚层；将乙醚层减压浓缩，继续减压干燥，粉碎，制得cs-4乙醚提取物。6.本发明还公开了采用上述制备方法制得的一种cs-4虫草菌粉提取物。7.本发明还公开了上述一种cs-4虫草菌粉提取物在制备治疗慢性肾衰药物上的应用。8.作为本发明的优选方案，所述药物的活性物质包括质量比2-4:4的cs-4氯仿提取物和cs-4乙醚提取物。9.作为本发明的优选方案，所述药物包括以下制剂中的一种：胶囊剂、片剂、散剂以及颗粒剂。10.作为本发明的优选方案，所述片剂包括以下重量份的原料：20-40份 cs-4虫草菌粉提取物和10-15份辅料。11.作为本发明的优选方案，所述辅料包括填充剂、粘合剂、润滑剂中的至少一种。12.本发明的有益效果：本发明利用cs-4虫草菌粉获取了cs-4氯仿提取物，cs-4乙醚提取物。将获取的组分进行体内药效实验，发现两者均为抗肾衰有效成分；并通过动物药效学评价实验，而且发现两者具有协同增效作用。两者协同使用可有效降低患者cs-4虫草菌粉给药剂量（cs-4虫草菌粉服用最小剂量为3g/日）；而cs-4虫草菌粉提取组分服用剂量仅为0.6g/日。13.本发明通过对cs-4氯仿提取物、cs-4乙醚提取物的流动性进行研究，并根据其流动性开展制剂研究，获得了治疗慢性肾衰的有效药品。具体实施方式14.以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。15.实施例1cs-4提取物的制备方法取1000gcs-4虫草菌粉加10倍量（重量）体积分数80%乙醇，回流提取三次，每次1h，合并醇提液；醇提液65℃减压浓缩，至密度为1.15-1.20（热测）；稠膏70℃减压干燥，粉碎，制得280.6gcs-4醇提物（棕黄色粉末)。16.取280.6gcs-4醇提物，加10倍量（重量）水溶解，搅拌均匀；加入等体积的石油醚，250rpm搅拌15分钟，静置30分钟；分离萃取3次，合并石油醚层，弃去；下层液体，加入等体积氯仿，250rpm搅拌15分钟，静置30分钟；分离萃取3次，合并氯仿层；70℃减压浓缩至1.20（80℃），制得30.2gcs-4氯仿提取物（棕黄色粉末）。17.取上述氯仿萃取上层液体，加入等体积乙醚，250rpm搅拌15分钟，静置30分钟；分离萃取3次，合并乙醚层；30℃减压浓缩，至密度为1.20（热测）；70℃减压干燥，粉碎，制得40gcs-4乙醚提取物（棕黄色粉末）。18.实施例2动物体内药效实验将实施例1制得的2种提取物进行体内药效实验，实验过程如下：方法概述：50只sd大鼠，雌雄各半，按体重随机分组，每组10只：正常对照组、模型组、受试药2组（cs-4氯仿组、cs-4乙醚组）、地塞米松组。试验前，大鼠放入代谢笼，禁食24h（照常进水），记录24h的尿量，检测尿蛋白和尿肌酐。大鼠称重后眼眶取血1ml，置于1.5ml离心管中，以3000转/min离心10min，取血检测尿素氮（bun）作为基础值。给药剂量根据各组提取得率，按照菌粉给药剂量（1.6g/kg）进行折算。除正常对照组外，其余组别大鼠灌胃给予腺嘌呤（生理盐水溶解）200mg/kg，每天一次，连续28天边造模变给药，最后第29-35天不造模只给药；并分别于第7、14、21、28、35天大鼠眼眶取血，以3000转/min离心10min，取血清检验尿素氮（bun）值，记录24h的尿量。实验分组及bun结果见下表1：表1实验分组及bun结果组别造模给予药物第7天bunmmol/l第14天bunmmol/l第21天bunmmol/l第28天bunmmol/l第35天bunmmol/l正常对照组生理盐水生理盐水5.22±1.165.39±0.745.43±0.555.16±0.64.81±1.06模型组腺嘌呤生理盐水24.94±4.1028.00±9.8747.73±16.5975.00±22.9555.43±25.10地塞米松组腺嘌呤po.1g/kg/天24.93±3.4219.26±3.5023.03±13.6615.06±20.8714.81±23.22cs-4氯仿组腺嘌呤po.48mg/kg/天24.93±2.6019.06±9.6516.87±8.3212.19±23.838.56±13.95cs-4乙醚组腺嘌呤po.64mg/kg/天26.37±3.2127.98±4.4433.70±10.5525.35±17.7815.62±9.94结果表明：与模型组比较，造模第7天正常对照组bun水平为5.22±1.16mmol/l，模型组bun水平在24.94±4.10mmol/l，两组间有非常显著的差别；实验第14天，与第7天相比，地塞米松组、cs-4氯仿部位组bun水平明显降低；实验第21天，与第14天相比，cs-4氯仿组的bun水平明显降低；实验第28天，与第21天相比，地塞米松组、cs-4氯仿组、cs-4乙醚组bun水平明显降低；实验第35天，与第28天相比，cs-4氯仿组、cs-4乙醚组bun水平明显降低。19.试验结论：与模型组比较，cs-4氯仿组、cs-4乙醚组能减轻腺嘌呤所致的慢性肾衰的作用。20.通过对cs-4发酵虫草菌粉的不同部位的药效体内实验发现，cs-4氯仿提取物、cs-4乙醚提取物具有改善慢性肾功能衰竭功效。21.实施例3动物药效学评价实验药效学评价：取cs-4氯仿组、cs-4乙醚组两者合用组对大鼠5/6肾切除慢性肾病模型影响，意外发现两者合用具有协同增效作用。具体实验如下：方法概述：实验动物110只，一共分为11组，具体包括：空白对照组、cs-4氯仿低剂量组、cs-4氯仿中剂量组、cs-4氯仿高剂量组、cs-4乙醚低剂量组、cs-4乙醚中剂量组、cs-4乙醚高剂量组、两者合用低剂量组、两者合用中剂量组、两者合用高剂量组以及地塞米松组，每组10只；空白对照组不进行手术，其他组进行手术。手术前禁食12h，大鼠麻醉后，备皮固定消毒，从左肋骨下缘、脊柱旁开一纵向切口，进入后腹膜腔，分离脂肪层，暴露左侧肾脏，钝性分离脂肪囊，小心剥离肾包膜及肾上腺，注意避免损伤肾上腺，剪掉左肾上、下极2/3肾实质，明胶海绵压迫创面止血，将残肾还纳入腹腔，逐层缝合肌层、皮下及皮肤，局部消毒。术后大鼠肌肉注射抗生素，每天一次，共3天。1周后麻醉消毒后手术切去整个右肾。术后大鼠肌肉注射抗生素，每天一次，共3天。第二次手术结束第二天开始分组给药。空白对照组及受试物组大鼠灌胃给予相应药物，模型组大鼠灌胃给予地塞米松，每日1次，共给药12周。具体给药剂量及实验结果见下表2：表2各组给药剂量及实验结果组别给药剂量bun水平存活率空白对照组纯化水未变化100%cs-4氯仿低剂量组30mg/kg未变化57.1%cs-4氯仿中剂量组60mg/kg降低65.2%cs-4氯仿高剂量组90mg/kg降低76.2%cs-4乙醚低剂量组30mg/kg未变化61.0%cs-4乙醚中剂量组60mg/kg降低70.6%cs-4乙醚高剂量组90mg/kg显著降低80.3%两者合用低剂量组30mg/kg降低78.4%两者合用中剂量组60mg/kg显著降低87.8%两者合用高剂量组90mg/kg显著降低94.2%模型组1.08mg/kg显著降低73.6%注：地塞米松大鼠给药剂量根据临床给药剂量折算，其中两者合用剂量中cs-4氯仿提取物和cs-4乙醚提取物的质量比为3.02:4。22.试验结论：从上表可知：cs-4氯仿中、高剂量组bun水平有降低，但未有显著降低，存活率均未超过80%；cs-4乙醚中剂量组bun水平有降低，其高剂量组bun水平有显著降低，存活率均未超过90%；通过将cs-4氯仿组，cs-4乙醚组两者合用中剂量60mg/kg、高剂量90mg/kg对5/6肾切除大鼠肾功能有一定的改善作用，bun水平出现显著降低，并且其高剂量能一定程度地提高5/6肾切除大鼠的存活率，存活率≥85%；该剂量折算成成人（60kg）有效剂量为190mg/天、380mg/天。23.实施例4cs-4虫草菌粉提取组分流动性研究本说明书将cs-4氯仿、cs-4乙醚两组分的提取物命名为cs-4虫草菌粉提取组分，其有效剂量，适合多种口服常规剂型，优选制备成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂4种口服剂型。24.cs-4虫草菌粉提取组分粉体性质考察：将提取所得cs-4虫草菌粉提取组分取部分筛分成大于80目和小于80目两部分，另取部分药粉用90%体积浓度的乙醇制粒，备用。25.物料流动性：采用erweka粉末颗粒流动性测试仪，将上述药粉分别沿漏斗壁倒入上方的漏斗中直到下方的药粉形成圆锥体，测出圆锥底部的直径，根据tga=h/r，计算出休止角。结果见下表3表3cs-4虫草菌粉提取组分休止角结果cs-4虫草菌粉提取组分cs-4虫草菌粉提取组分（小于80目）cs-4虫草菌粉提取组分（大于80目）cs-4虫草菌粉提取组分颗粒休止角29.56°33.8°30.6°30.6°cs-4虫草菌粉提取组分的休止角为29.56°，筛分成小于80目和大于80目以及制粒后的休止角也均在30°上下，药粉流动性都比较好，无需处理已适合大生产胶囊、散剂分装等设备直接生产。26.实施例5cs-4虫草菌粉提取组分制剂研究胶囊剂制备方法：cs-4虫草菌粉提取组分流动性好，可直接填充灌装胶囊，各型号胶囊直接填充cs-4虫草菌粉提取组分装量见下表4：表4不同型号胶囊壳cs-4虫草菌粉提取组分装量胶囊号00#0#1#2#3#4#容积（ml）0.950.680.500.320.250.21cs-4虫草菌粉提取组分装量（mg/粒）817584.8430356.2258180.6备注：胶囊号出处为《空心胶囊规格尺寸及外观质量》是2020年06月16日实施的一项行业标准。27.从各型号胶囊容积计算可知，当成人（60kg）有效剂量为260mg/天-520mg/天时，cs-4虫草菌粉提取组分适合采用2#胶囊直接填充，每粒装0.3g，日用剂量为2粒。28.胶囊剂样品稳定性考察：将cs-4虫草菌粉提取组分粉末直接填充2#胶囊工艺，每粒装0.3g/粒，控制环境相对湿度在65%rh以下，制得胶囊样品；将样品进行加速稳定性考察，考察条件为：温度40℃±2℃、相对湿度75%±5%的条件下放置6个月。在试验期间第0个月，第3个月，第6个月分别取样一次，进行检测。加速稳定性考察结果见下表5：表5加速稳定性考察结果项目0个月3个月6个月水分2.35%2.35%2.55%装量差异符合规定符合规定符合规定崩解时限5分钟6分钟5分钟总氨基酸含量（mg/粒）182176168从上述所有数据分析得出：采用优选制备方法的样品水分、装量差异、崩解时限、含量的稳定性良好，所得产品稳定性强，疗效稳定；且整体工艺易于操作，适于推广应用，日用剂量为每日2粒。29.片剂制备方法：处方筛选cs-4虫草菌粉提取组分颗粒流动性好，可通过加入填充剂、粘合剂、润滑剂等辅料制备成片剂，片剂规格为0.45g/片（每片含cs-4虫草菌粉提取组分0.3g），试制量为1000片。处方筛选见下表6，试制结果见下表7：表6片剂处方筛选处方/批号202205012022050220220503cs-4虫草菌粉提取组分300g300g300g微晶纤维素86g86g76g羧甲基淀粉钠20g22g28g二氧化硅20g26g20g10wt%淀粉浆226005wt%羟丙甲纤维素0268010wt%明胶浆00240g硬脂酸镁2.5g2.5g2.5g表7试制结果检测项目/批号202205012022050220220503水分5.2%4.9%4.95%硬度3-4kg5-6kg8-9kg崩解16min25min46min总氨基酸含量（mg/片）176172179从上述结果，筛选20220502批处方为最佳处方，所得样品检测项目均符合规定，根据成人（60kg）有效剂量为190mg/天-380mg/天时，cs-4虫草菌粉提取组分服用剂量为每日2片。30.片剂稳定性考察：按20220502批处方完成三批小试放大中试研究（中试量为10000片），所得中试样品批号为20220601、20220602、20220603；将所得三批中试样品进行加速稳定性考察，考察条件为：温度40℃±2℃、相对湿度75%±5%的条件下放置6个月。在试验期间第0个月，第3个月，第6个月分别取样一次，进行检测。片剂加速稳定性实验结果见下表8：表8片剂加速稳定性实验结果31.从上述所有数据分析得出：采用优选制备方法的样品水分、崩解时限、外观、含量的稳定性良好，所得产品稳定性强，疗效稳定；且整体工艺易于操作，适于推广应用。32.散剂制备研究工艺筛选：因cs-4虫草菌粉提取组分流动性好，可以不加任何辅料适合制备散剂，规格为0.3g/袋；现通过考察cs-4虫草菌粉提取组分细度对散剂装量的影响，试制结果见下表9：表9 散剂试制结果（单位：g/袋）项目12345678910平均装量rsd%药粉（g/袋）0.3160.3180.3120.3060.3150.3160.3160.3080.3150.3180.3141.30080目（g/袋）0.3210.3230.3080.3120.320.3180.3190.3060.3150.3180.3161.79060目（g/袋）0.2150.3120.3060.3000.210.2060.2150.280.3030.2680.26217.186从表9结果可知，药粉和80目药粉分装成散剂装量差异均符合药典要求，因药粉的rsd%指标低于80目，故优选药粉为最佳工艺，装量符合预期，日服量为2袋/日。33.散剂稳定性考察：将cs-4虫草菌粉提取组分分装成三批中试样品，所得中试样品批号为20220501、20220502、20220503；将所得三批中试样品进行加速稳定性考察，考察条件为：温度40℃±2℃、相对湿度75%±5%的条件下放置6个月。在试验期间第0个月，第3个月，第6个月分别取样一次，进行检测。散剂加速稳定性实验结果见下表10：表10 散剂加速稳定性实验结果34.从上述所有数据分析得出：采用cs-4虫草菌粉提取组分制得的散剂样品水分、装量、含量的稳定性良好，所得产品稳定性强，疗效稳定；且整体工艺易于操作，适于推广应用。35.颗粒剂制备研究处方筛选：因cs-4虫草菌粉提取组分颗粒流动性好，可通过加入辅料制备成颗粒剂，颗粒剂规格为1g/袋，试制量为500g。处方筛选见下表11，试制结果见下表12：表11 颗粒剂处方筛选处方/批号2022050120220502202205032022050420220505发酵虫草菌粉cs-4提取组分150g150g150g150g150g糖粉150g170g135g0130g淀粉60g180g0140g65g糊精140g0215g210g155g纯化水176g168g184g162g180g36.表12 试制结果37.从上述结果得出，所得样品除20220503批检测项目符合规定外，其它批次粒度不符合规定，故优选20220503批处方为最佳处方；根据成人（60kg）有效剂量为190mg/天-380mg/天时，cs-4虫草菌粉提取组分颗粒日用剂量为每日2袋。38.散剂稳定性考察：按20220503批处方完成三批小试放大中试研究，所得中试样品批号为20220601、20220602、20220603；将所得三批中试样品进行加速稳定性考察，考察条件为：温度40℃±2℃、相对湿度75%±5%的条件下放置6个月。在试验期间第0个月，第3个月，第6个月分别取样一次，进行检测。加速稳定性实验结果见下表13：表13 加速稳定性实验结果39.从上述所有数据分析得出：采用优选制备方法的样品性状、溶化性、口感、含量的稳定性良好，所得产品稳定性强，疗效稳定；且整体工艺易于操作，适于推广应用。40.以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，还可以做出其他各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。









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