抗CTLA-4抗体药物组合物及其用途的制作方法 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术抗ctla-4抗体药物组合物及其用途技术领域1.本发明涉及治疗性药物组合物领域，具体涉及抗ctla-4抗体药物组合物及其用途。背景技术：2.细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla4或ctla-4，cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4)，也称为cd152(cluster of differentiation 152)，是由ctla-4基因编码的跨膜蛋白，该基因位于人类第2号染色体2q33。ctla-4是免疫球蛋白超家族的一员，由胞外v区、跨膜区和胞浆区组成。ctla-4与t细胞表面的协同刺激分子受体cd28具有同源性，两者竞争结合其配体b7-1(cd80)和b7-2(cd86)，这类配体主要表达于抗原递呈细胞表面。与cd28相比，ctla-4与cd80和cd86的结合亲和力更高，因此能够竞争和阻断cd28介导的激活作用。ctla-4通常表达在调节性t细胞(treg)和活化状态的常规t细胞表面上。其在与b7类分子结合后，抑制t细胞的激活，参与免疫反应的负调控，充当免疫检查点并下调免疫应答，所以ctla-4在免疫调节中起到非常重要的作用。3.t细胞的激活需要两个信号的刺激，第一个信号来自t细胞受体(tcr)特异性结合抗原递呈细胞(apc)表面的抗原肽-mhc复合物，第二个信号通路需要共刺激分子(如cd28)的参与，当cd28与b7-1/b7-2(cd80/cd86)结合后可以进一步活化t细胞，促进其成熟和增殖。目前的研究表明，在免疫应答过程中，ctla-4通过下列途径下调t细胞的功能：其一，ctla-4可以通过其与cd80/cd86的高亲和力，竞争性阻断cd28与cd80/86共刺激信号的传递，进而抑制t细胞的增殖，减少il-2的分泌。其二，ctla-4可以通过降低cd80/cd86在抗原递呈细胞(apc)上的表达水平或者通过反式内吞作用将cd80/cd86分子从抗原递呈细胞(apc)表面移除，从而减少了cd28参与的t细胞激活。其三，ctla-4可以通过介导树突状细胞结合cd80/cd86并诱导色氨酸降解酶ido的表达，抑制tcr信号。此外，ctla-4还可以通过招募抑制性分子结合到免疫突触，诱导产生调节性细胞因子，从而抑制apc和tcr信号的传递。4.已在许多研究中证明ctla-4的阻断可以诱导肿瘤消退。抗ctla-4抗体能够在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫应答，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用低。5.尽管目前已有ctla-4的单抗药物ipilimumab(百时美施贵宝)和tremelimumab(阿斯利康)用于一些癌症治疗并且正在测试其他抗癌适应症，但是仍需要在各方面包括活性相比于已知抗体改善的新型抗ctla-4抗体。6.但是，抗体药物其分子量大，结构复杂，容易降解、聚合或发生不希望发生的化学修饰等而变得不稳定。为了使抗体适合于生产和给药，并且在储存和随后使用过程中能保持稳定性，及发挥更好的效果，抗体药物的稳定制剂研究显得尤为重要。技术实现要素：7.本发明所述的药物组合物是一种含有与ctla-4特异性结合的抗体或其抗原结合片段的高稳定性药物组合物。特别地，本发明通过选择适当的缓冲体系和ph，优化稳定剂和表面活性剂，开发得到的抗体制剂可用于静脉注射，且各成分之间相互作用、协同配合，为抗ctla-4抗体或其抗原结合片段提供了适宜长期保存的存储环境，能够避免制剂在长期保存或运输过程中导致的抗体降解、聚集或沉淀，抗体在该环境中可以长期存储，存储期间能够保证抗体活性和纯度均保持稳定，保证了生物药物的药效。8.本发明提供了一种药物组合物，包含：(1)缓冲液；(2)抗ctla-4抗体或其抗原结合片段。9.在一些方案中，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含的lcdr1、lcdr2、lcdr3、hcdr1、hcdr2和hcdr3分别为：10.lcdr1：rasqnvgtyva(seq id no:1)；11.lcdr2：stsyrys(seq id no:2)；12.lcdr3：hqydtyplt(seq id no:3)；13.hcdr1：sgyywn(seq id no:4)；14.hcdr2：yigydgsnx1ynpslkx2，其中，x1为n或y，x2为s或n；15.hcdr3：x3yysgyfds，x3为d或n。16.在一些方案中，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含：17.氨基酸序列如seq id no:1所示的lcdr1；18.氨基酸序列如seq id no:2所示的lcdr2；19.氨基酸序列如seq id no:3所示的lcdr3；20.氨基酸序列如seq id no:4所示的hcdr1；21.氨基酸序列如seq id no:5或7或9所示的hcdr2；22.氨基酸序列如seq id no:6或8所示的hcdr3。23.在一些方案中，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含：24.(1)氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或25.(2)氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:7和seq id no:8所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；或26.(3)氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:9和seq id no:6所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。27.在一些方案中，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段，优选为人源化抗体或其抗原结合片段。28.在一些方案中，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含：29.(1)氨基酸序列如seq id no:10所示的轻链可变区，和氨基酸序列如seq id no:11所示的重链可变区；或30.(2)氨基酸序列如seq id no:12所示的轻链可变区，和氨基酸序列如seq id no:11所示的重链可变区；或31.(3)氨基酸序列如seq id no:13所示的轻链可变区，和氨基酸序列如seq id no:14所示的重链可变区；或32.(4)氨基酸序列如seq id no:13所示的轻链可变区，和氨基酸序列如seq id no:15所示的重链可变区。33.在一些方案中，上述抗ctla-4抗体包含：34.(1)氨基酸序列如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列，和氨基酸序列如seq id no:17所示的重链氨基酸序列。35.(2)氨基酸序列如seq id no:18所示的轻链氨基酸序列，和氨基酸序列如seq id no:19所示的重链氨基酸序列。36.(3)氨基酸序列如seq id no:20所示的轻链氨基酸序列，和氨基酸序列如seq id no:21所示的重链氨基酸序列。37.(4)氨基酸序列如seq id no:22所示的轻链氨基酸序列，和氨基酸序列如seq id no:23所示的重链氨基酸序列。38.在一些方案中，上述药物组合物中抗ctla-4抗体或其抗原结合片段的浓度为约1～100mg/ml，优选为约1～50mg/ml，更优选为约5～30mg/ml；更优选地，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段浓度为约1mg/ml，5mg/ml，7mg/ml，9mg/ml，10mg/ml，11mg/ml，15mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，40mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml，100mg/ml或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约9mg/ml，10mg/ml，11mg/ml或15mg/ml。39.在一些方案中，上述药物组合物的ph为约4.5～6.5，优选为约5.0～6.0，更优选为约5.3～5.7，上述药物组合物的ph非限制性实施例为约4.5，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约5.4，5.5或5.6。40.在一些方案中，上述药物组合物的渗透压为约250～350mosm/kg。41.在一些方案中，上述缓冲液选自醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液中的一种或多种；优选地，所述缓冲液为醋酸缓冲液。42.在一些方案中，上述缓冲液为醋酸缓冲液，优选地，所述醋酸缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钾缓冲液，优选为醋酸-醋酸钠缓冲液。43.在一些方案中，上述醋酸缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。在一些方案中，醋酸-醋酸钠缓冲液由约1～20mm的醋酸和约1～20mm的醋酸钠制成。在一些方案中，醋酸-醋酸钠缓冲液由摩尔比为约1:2到约1:3的醋酸和醋酸钠制成。在一些方案中，醋酸-醋酸钠缓冲液由摩尔比为约1:5到约1:8的醋酸和醋酸钠制成。在一些方案中，醋酸-醋酸钠缓冲液为：由约6.5mm的醋酸和约13.5mm的醋酸钠制成的ph为约5.0的醋酸缓冲液。在一些方案中，醋酸-醋酸钠缓冲液为：由约2～4mm的醋酸和约16～18mm的醋酸钠制成的ph为约5.0～6.0的醋酸缓冲液；优选为由约3mm的醋酸和约17mm的醋酸钠制成的ph为约5.5的醋酸缓冲液。44.在一些方案中，上述组氨酸缓冲液选自组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液或组氨酸-组氨酸醋酸盐缓冲液，优选组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液。在一些方案中，上述组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液由组氨酸和组氨酸盐酸盐制成，优选l-组氨酸和l-组氨酸单盐酸盐。在一些方案中，组氨酸缓冲液由约1～20mm的l-组氨酸和约1～20mm的l-组氨酸单盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为约1:1到约1:4的组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为约1:1组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为约1:3的组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸制剂为：由约4.5mm的l-组氨酸和约15.5mm的l-组氨酸单盐酸盐制成的ph为约5.5的组氨酸缓冲剂。在一些方案中，组氨酸制剂为：由约10mm的组氨酸和约10mm的组氨酸盐酸盐制成的ph为约6.0的组氨酸缓冲液。45.在一些方案中，上述缓冲液为柠檬酸缓冲液，优选地，所述柠檬酸缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。在一些方案中，柠檬酸缓冲液由约1～20mm的柠檬酸和约1～20mm的柠檬酸钠制成。在一些方案中，柠檬酸缓冲液由摩尔比为约1:1到1:4的柠檬酸和柠檬酸钠制成。在一些方案中，柠檬酸缓冲液为：由约5.0mm的柠檬酸和约15.0mm的柠檬酸钠制成的ph为约6.5的柠檬酸缓冲液。在一些方案中，柠檬酸缓冲液为：由约10mm的柠檬酸和约10mm的柠檬酸钠制成的ph为约6.0的柠檬酸缓冲液。46.在一些方案中，上述缓冲液为磷酸盐缓冲液，优选地，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。在一些方案中，磷酸盐缓冲液由约1～20mm的磷酸氢二钠和约1～20mm的磷酸二氢钠制成。在一些方案中，磷酸盐缓冲液由摩尔比为约1:1到1:4的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠制成。在一些方案中，磷酸盐缓冲液为：由约10mm的磷酸氢二钠和约10mm的磷酸二氢钠制成的ph为约7.0的磷酸盐缓冲液。47.在一些方案中，上述缓冲液的浓度为约5～100mm，优选为约10～50mm，优选为约10～30mm；优选为约15～25mm，上述缓冲液浓度非限制性实施例为约10mm，15mm，20mm，25mm，30mm，40mm，45mm，50mm或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约15mm，20mm或25mm。48.在一些方案中，上述缓冲液的ph为约4.5～6.5，优选为约5.0～6.0，更优选为约5.3～5.7，上述缓冲液的ph非限制性实施例为约5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约5.4，5.5或5.6。在一些方案中，上述的药物组合物还包括稳定剂，所述稳定剂选自精氨酸、精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖和海藻糖中的一种或多种；优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。在一些方案中，上述稳定剂的浓度为约10～400mm，优选为约100～300mm，优选为约130～280mm，优选为约200～260mm，上述稳定剂浓度非限制性实施例为约130mm，135mm，140mm，150mm，160mm，170mm，180mm，190mm，200mm，210mm，220mm，228mm，230mm，240mm，250mm，260mm或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约210mm，220mm，228mm或230mm。49.在一些方案中，上述稳定剂为浓度约130～280mm的甘露醇；或上述稳定剂为浓度约130～280mm的蔗糖；或上述稳定剂为浓度约20～80mm的氯化钠与浓度约110-170mm的甘露醇的组合；或上述稳定剂为浓度约20～80mm的氯化钠与浓度约110-170mm的蔗糖的组合；在一些方案中，上述稳定剂为浓度约200～260mm的甘露醇；或上述稳定剂为浓度约200～260mm的蔗糖；或上述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的甘露醇的组合；或上述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的蔗糖的组合。50.在一些方案中，上述稳定剂为甘露醇。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100～300mm的甘露醇，上述甘露醇的浓度优选为约130～280mm，优选为约200～260mm，上述甘露醇浓度的非限制性实施例为约200mm，210mm，220mm，230mm，240mm，250mm，260mm或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约240mm。51.在一些方案中，上述稳定剂为蔗糖。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100～300mm的蔗糖，上述蔗糖的浓度优选为约130～280mm，优选为约200～260mm，上述蔗糖浓度的非限制性实施例为约200mm，210mm，220mm，228mm，230mm，240mm，250mm或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约220mm或约228mm。52.在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠与甘露醇的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30～200mm的氯化钠与约30～200mm的甘露醇的组合，优选约20～80mm的氯化钠与约110～170mm的甘露醇的组合，优选约30～70mm的氯化钠与约120～160mm的甘露醇的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mm的氯化钠与约140mm的甘露醇的组合，或约50mm的氯化钠与约150mm的甘露醇的组合。53.在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠与蔗糖的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30～200mm的氯化钠与约30～200mm的蔗糖的组合，优选约20～80mm的氯化钠与约110～170mm的蔗糖的组合，优选约30～70mm的氯化钠与约120～160mm的蔗糖的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mm的氯化钠与约140mm的蔗糖的组合，或约50mm的氯化钠与约160mm的蔗糖的组合。54.在一些方案中，上述药物组合物还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188中的一种或多种。55.在一些方案中，上述表面活性剂选自聚山梨醇酯80。56.在一些方案中，上述表面活性剂选自聚山梨醇酯20。57.在一些方案中，以w/v计算，上述表面活性剂浓度为约0.001％～0.1％，优选为约0.01％～0.1％，优选为约0.01％～0.05％；作为非限制性实施例，上述表面活性剂的浓度为约0.01％，0.02％，0.03％，0.04％，0.08％或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约0.02％。58.在一些方案中，药物组合物包含如下(1)～(13)中任一项所示的组分，或分别由(1)～(13)任一项所示的组分组成：59.(1)(a)约1～50mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)130～280mm的甘露醇；以及(d)约0.01％～0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80；或60.(2)(a)约1～50mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)130～280mm的蔗糖；以及(d)约0.01％～0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80；或61.(3)(a)约1～50mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约20～80mm的氯化钠与浓度约110-170mm的甘露醇的组合；以及(d)约0.01％～0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80；或62.(4)(a)约1～50mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约20～80mm的氯化钠与浓度约110-170mm的蔗糖的组合；以及(d)约0.01％～0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80；或63.(5)(a)约5～30mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)200～260mm的甘露醇；以及(d)约0.01％～0.05％(w/v)的聚山梨醇酯80；或64.(6)(a)约5～30mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)200～260mm的蔗糖；以及(d)约0.01％～0.05％(w/v)的聚山梨醇酯80；或65.(7)(a)约5～30mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的甘露醇的组合；以及(d)约0.01％～0.05％(w/v)的聚山梨醇酯80；或66.(8)(a)约5～30mg/ml的上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mm醋酸缓冲液，ph为约5.0～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的蔗糖的组合；以及(d)约0.01％～0.05％(w/v)的聚山梨醇酯80；或67.(9)(a)约10mg/ml的抗ctla-4抗体，所述抗ctla-4抗体包含如seq idno:16所示的轻链氨基酸序列和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列；(b)约20mm醋酸缓冲液，ph为约5.5；(c)约240mm的甘露醇；以及(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80；或68.(10)(a)约10mg/ml的抗ctla-4抗体，所述抗ctla-4抗体包含如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列；(b)约20mm醋酸缓冲液，ph为约5.5；(c)约220mm的蔗糖；以及(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80；或69.(11)(a)约10mg/ml的抗ctla-4抗体，所述抗ctla-4抗体包含如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列；(b)约20mm醋酸缓冲液，ph为约5.5；(c)约228mm的蔗糖；以及(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80；或70.(12)(a)约10mg/ml的抗ctla-4抗体，所述抗ctla-4抗体包含如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列；(b)约20mm醋酸缓冲液，ph为约5.5；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约50mm的氯化钠与浓度约140mm的甘露醇的组合；以及(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80；或71.(13)(a)约10mg/ml的抗ctla-4抗体，所述抗ctla-4抗体包含如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列；(b)约20mm醋酸缓冲液，ph为约5.5；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约50mm的氯化钠与浓度约140mm的蔗糖的组合；以及(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80。72.在一些方案中，本文任一项方案中所述的药物组合物为液体制剂或冻干制剂。73.在一些方案中，上述药物组合物为液体制剂。74.在一些方案中，上述液体制剂或冻干制剂于2～8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。75.在一些方案中，上述液体制剂或冻干制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。76.本发明还提供了一种注射剂，其含有本文任一项方案中所述的药物组合物与氯化钠溶液或葡萄糖溶液；优选地，所述氯化钠溶液浓度为约0.85～0.9％(w/v)；优选地，所述葡萄糖溶液浓度为约5～25％(w/v)，更优选为约5～10％(w/v)；优选地，所述注射剂中，所述抗ctla-4抗体的浓度为约0.05～10.5mg/ml，更优选为约0.1～5mg/ml或约1～5mg/ml；所述注射剂的ph为约4.5～6.5，优选为约5.0～6.0，更优选为约5.3～5.7。77.在一些方案中，上述药物组合物或注射剂，其经静脉注射施用。78.本发明还提供了本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂在制备用于治疗和/或预防ctla-4介导的疾病或病症的药物中的用途。79.本发明还提供了本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂，其用于治疗和/或预防ctla-4介导的疾病或病症。80.本发明还提供了一种治疗和/或预防ctla-4介导的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂。81.在一些方案中，上述疾病或病症为癌症。附图说明82.图1：抗ctla-4药物组合物与重组人ctla-4蛋白的亲和力测试结果。83.图2：抗ctla-4药物组合物对hctla4人源化小鼠移植emt6肿瘤生长的抑制作用测试结果。84.图3：elisa法检测人源化抗ctla-4抗体与huctla-4的结合。85.图4：elisa法检测人源化抗ctla-4抗体阻断huctla-4与cd80结合的能力。86.图5：荧光素酶法检测人源抗ctla-4化抗体的生物学活性。87.图6：人源化抗ctla-4抗体的adcc活性。88.图7：人源化抗ctla-4抗体的cdc活性。89.图8：人源化抗ctla-4抗体对小鼠肿瘤生长的抑制。90.图9：fortebio结合实验鉴定抗原表位。91.图10：hujs007-47对hctla4人源化小鼠移植mc38肿瘤生长的抑制作用。92.图11：hujs007-47对hctla4人源化小鼠移植h22肿瘤生长的抑制作用。具体实施方式93.定义和说明94.为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。应理解本发明不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然可以对以上进行变化。还应理解本技术所用术语仅为了描述具体的实施方式，并不旨在进行限制。本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书诸如此类，以及其中所引用的参考文献，就其尚未被引用的程度而言，在此其全文通过引用并入。如果所并入的文献和类似材料中的一个或多个与本技术不同或矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术诸如此类，则以本技术为准。95.除非该内容被另外明确说明，否则本说明书以及所附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种多肽”包括了两种或更多种多肽等的组合。96.术语“药物组合物”或“制剂”表示含有一种或多种本文所述抗体与其他组分的混合物，所述其他组分例如生理学可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。97.术语“液体制剂”是指处于液体状态下的制剂，且不意图指称重悬浮的冻干制剂。本发明的液体制剂在储存时稳定，并且其稳定性不依赖于冻干(或其他状态改变方法，例如喷雾干燥)。98.术语“水性液体制剂”是指使用水作为溶剂的液体制剂。在一些方案中，水性液体制剂是不需冻干、喷雾干燥和/或冷冻来维持稳定性(例如化学和/或物理稳定性和/或生物活性)的制剂。99.术语“赋形剂”是指可以向制剂添加以提供所需特性(例如稠度、提高的稳定性)和/或调节渗透压的试剂。常用赋形剂的实例包括但不限于糖类、多元醇、氨基酸、表面活性剂和聚合物。100.本技术所用的“约”在指代可测量数值(如量、持续时间等)时意在涵盖相对于具体数值±20％或±10％的变化，包括±5％、±1％和±0.1％，因为这些变化适于进行所公开的方法。101.术语“缓冲液ph为约4.5～6.5”是指这样的试剂，通过其酸/碱共轭组分的作用使得包含该试剂的溶液能抵抗ph变化。本发明的制剂中使用的缓冲液可具有约5.0至约6.5范围内的ph、或约5.5至约6.5范围内的ph、或约5.0至约6.0范围内的ph。102.在本文中，将ph控制在该范围内的“缓冲液”实例包括醋酸、醋酸盐(例如醋酸钠)、琥珀酸、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡萄糖酸、组氨酸、组胺酸盐(例如组氨酸盐酸盐)、甲硫氨酸、柠檬酸(枸橼酸)、柠檬酸盐(枸橼酸盐)、磷酸盐、柠檬酸盐/磷酸盐、咪唑、其组合和其他有机酸缓冲剂。[0103]“组氨酸缓冲液”为包含组氨酸离子的缓冲液。组氨酸缓冲液的实例包括组氨酸和组氨酸的盐，如组氨酸盐酸盐、组氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐和组氨酸硫酸盐等，如含有组氨酸与组氨酸盐酸盐的组氨酸缓冲液；本发明的组氨酸缓冲液也包括含有组氨酸和醋酸盐(如钠盐或钾盐)的组氨酸缓冲液。[0104]“柠檬酸缓冲液”，又称“枸橼酸缓冲液”，是包括柠檬酸根离子的缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的实例包括柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-柠檬酸钾、柠檬酸-柠檬酸钙、柠檬酸-柠檬酸镁等。优选的柠檬酸盐缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。[0105]“醋酸缓冲液”是包括醋酸根离子的缓冲液。醋酸盐缓冲液的实例包括醋酸-醋酸钠、醋酸-醋酸钾、醋酸-醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。优选的醋酸盐缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。[0106]“琥珀酸缓冲液”是包括琥珀酸根离子的缓冲液。琥珀酸缓冲液的实例包括琥珀酸-琥珀酸钠、琥珀酸-琥珀酸钾、琥珀酸-琥珀酸钙、琥珀酸-琥珀酸镁等。优选的琥珀酸盐缓冲液为琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液。[0107]“磷酸盐缓冲液”是包括磷酸根离子的缓冲液。磷酸盐缓冲液的实例包括磷酸二氢钠-磷酸氢二钠、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾等。优选的磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。[0108]术语“稳定剂”表示药学上可接受的赋形剂，其在制造，储存和应用过程中保护活性药物成分和/或制剂免受化学和/或物理降解。稳定剂包括但不限于如以下定义的糖，氨基酸，盐，多元醇和他们的代谢产物，例如氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、精氨酸或其盐(如盐酸精氨酸)、甘氨酸、丙氨酸(α-丙氨酸、β-丙氨酸)、甜菜碱、亮氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸(gaba)、奥品类(opines)、丙氨奥品、章鱼碱、甘氨奥品(strombine)和三甲胺的n-氧化物(tmao)、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、α-酪蛋白、球蛋白、α-乳白蛋白、ldh、溶菌酶、肌红蛋白、卵清蛋白和rnaase a。部分稳定剂，如氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘露醇、山梨醇、蔗糖等也可起到控制渗透压的作用。在本发明中具体地使用的稳定剂选自多元醇、氨基酸、盐、糖中的一种或一种以上。优选的盐为氯化钠，优选的糖为蔗糖和海藻糖，优选的多元醇为山梨醇和甘露醇。优选的氨基酸为精氨酸、甘氨酸、脯氨酸，氨基酸可以以其d-和/或l-型存在，但典型是l-型，氨基酸可以任何合适的盐存在，例如盐酸盐，如盐酸精氨酸。优选的稳定剂为氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、盐酸精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、氯化钠-山梨醇、氯化钠-甘露醇、氯化钠-蔗糖、氯化钠-海藻糖、盐酸精氨酸-甘露醇、盐酸精氨酸-蔗糖。[0109]术语“表面活性剂”一般包括保护蛋白质例如抗体免受空气/溶液界面诱导的应力、溶液/表面诱导的应力的影响以减少抗体的聚集或使制剂中颗粒物的形成最小化的试剂。示例性的表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂例如聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)、聚乙烯-聚丙烯共聚物、聚乙烯-聚丙烯二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚、例如聚氧乙烯单月桂基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚(triton-x)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，pluronic)、十二烷基硫酸钠(sds)。本文中，如无特别说明，术语“聚山梨醇酯20的浓度”和“聚山梨醇酯80的浓度”均是指质量体积浓度(w/v)，如“约0.02％聚山梨醇酯80”中“0.02％”即指“100ml液体中含有0.02g的聚山梨醇酯80”。[0110]术语“等渗”是指该制剂具有与人血液基本相同的渗透压。等渗制剂一般具有约250至350mosm的渗透压。可使用蒸汽压或冰点下降式的渗透压计测量等渗性。[0111]术语“稳定的”制剂是其中的抗体在制造过程期间和/或储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。即使所含的抗体在经过一定时间储存之后未能保持其100％的化学结构或生物功能，医药制剂也可以是稳定的。在某些情况下，在经过一定时间储存之后，能维持约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的抗体结构或功能，也可被认为是“稳定的”。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本技术领域中是可得的，并综述在《肽和蛋白质药物递送》(peptide and protein drug delivery)247～301，vincent lee主编，marcel dekker，inc.，new york，n.y.，pubs.(1991)，和jones，a.(1993)adv.drug delivery rev.10：29～90中(二者引入作为参考)。[0112]制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，通过测定其中剩余的天然抗体的百分比(及其它方法)，可以测量其稳定性。除其它方法外，天然抗体的百分比可以通过尺寸排阻色谱法(例如尺寸排阻高效液相色谱法[sec-hplc])来测量，“天然的”指未聚集的和未降解的。在一些方案中，蛋白质的稳定性按照具有低百分比的降解(例如片段化)和/或聚集蛋白质的溶液中单体蛋白质的百分数来确定。在一些方案中，制剂可以在室温、约25～30℃或40℃下稳定储存至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，或更长，最多不超过约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％，或0.1％聚集形式的抗体。[0113]通过测定在离子交换期间在此抗体主馏分(“主要荷电形式”)较为酸性的馏分中迁移的抗体(“酸性形式”)的百分比(及其它方法)，可以测量稳定性，其中稳定性与酸性形式抗体的百分比成反比。除其它方法外，“酸化”抗体的百分比可以通过离子交换色谱法(例如阳离子交换高效液相色谱法[cex-hplc])来测量。在一些实施方式中，可接受程度的稳定性意为当制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，其中可检测出的酸性形式的抗体最多不超过约49％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。在测量稳定性之前储存的一定时间可以是至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，或更长。当评估稳定性时，容许储存医药制剂的一定温度可以是约-80℃至约45℃范围内的任何温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约2～8℃、约5℃、约25℃，或约40℃。[0114]如果抗体在颜色和/或澄清度目测检查时或通过uv光散射或通过孔径排阻层析测量时基本上不显示出例如聚集、沉淀和/或变性的迹象，则所述抗体在该药物组合物中“保持其物理稳定性”。聚集是单个分子或复合物共价或非共价缔合以形成聚集体的过程。聚集可以进行到形成可见沉淀物的程度。[0115]制剂的稳定性例如物理稳定性可以通过本技术领域中公知的方法来评估，包括测量样品的表观消光度(吸光度或光密度)。这样的消光测量与制剂的浊度相关。制剂的浊度部分地是溶解在溶液中的蛋白质的固有性质，并且通常通过比浊法来测量，并用比浊法浊度单位(ntu)来量度。[0116]随着例如溶液中一种或多种组分的浓度(例如蛋白质和/或盐浓度)而变化的浊度水平也被称为制剂的“乳浊”或“乳浊外观”。浊度水平可以参照使用已知浊度的悬液产生的标准曲线来计算。用于测定药物组合物的浊度水平的参比标准品可以基于《欧洲药典》标准(《欧洲药典》(european pharmacopoeia)，第四版，“欧洲药品质量委员会指令”(directorate for the quality of medicine of the council of europe)(edqm)，strasbourg，france)。根据《欧洲药典》标准，澄清溶液被定义为浊度低于或等于按照《欧洲药典》标准具有约3的参比悬液的浊度的溶液。比浊法的浊度测量可以检测在不存在缔合或非理想效应的情况下的瑞利散射，其通常随浓度线性变化。用于评估物理稳定性的其他方法在本技术领域中是公知的。[0117]如果抗体在给定时间点的化学稳定性使得抗体被认为仍保持如下文中所定义的其生物活性，则所述抗体在药物组合物中“保持其化学稳定性”。可以通过例如检测或定量抗体的化学改变的形式来评估化学稳定性。化学改变可以包括尺寸改变(例如剪短)，其可以使用例如孔径排阻层析、sds-page和/或基质辅助的激光解吸电离/飞行时间质谱(maldi/tof ms)来评估。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如作为脱酰胺或氧化的结果而发生)，其可以通过例如离子交换层析来评估。[0118]如果药物组合物中的抗体对于其预期目的来说是生物活性的，则所述抗体在药物组合物中“保持其生物活性”。例如，如果制剂于例如5℃、25℃、45℃等温度下储存一定时间(例如1至12个月)之后，该制剂所含抗ctla-4抗体与ctla-4结合的亲和力为所述储存之前抗体结合亲和力的至少90％、95％或以上，则可认为本发明之制剂是稳定的。结合亲和力也可用例如elisa或等离子共振技术测定。[0119]在本发明的情形中，在药理学意义上，抗体的“治疗有效量”或“有效量”是指在抗体可以有效治疗的障碍的症状的预防或治疗或减轻方面有效的量。本发明中，药物的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时保护受试者免于疾病发作或促进疾病消退的任何量的药物，所述疾病消退通过疾病症状的严重性的降低，疾病无症状期的频率和持续时间的增加，或由疾病痛苦引起的损伤或失能的预防来证明。药物促进疾病消退的能力可以使用本领域技术人员已知的多种方法来评价，比如在临床试验期间的人受试者中，在预测人类功效的动物模型系统中，或通过在体外测定法中测定所述药剂的活性。药物治疗有效量包括“预防有效量”，即当单独或如与其它治疗药物组合给与处于患病风险的受试者或患病复发的受试者时，抑制疾病的发展或复发的任何量的药物。[0120]术语“受试者”或“患者”意图包括哺乳动物生物体。受试者/患者的实例包括人类和非人类哺乳动物，例如非人类灵长动物、狗、奶牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人类动物。在本发明的特定实施方式中，受试者是人类。[0121]术语“施用”、“给与”及“处理”是指采用本领域技术人员已知的各种方法或递送系统中的任意一种将包含治疗剂的组合物引入受试者。抗ctla-4抗体的给药途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜、脊髓或其他胃肠外给药途径，比如注射或输注。“胃肠外给药”是指除了肠内或局部给药以外的通常通过注射的给药方式，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、损伤内、囊内、框内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜内和胸骨内注射和输注以及经体内电穿孔。[0122]抗ctla-4抗体[0123]本文所用的术语“抗体”应被理解为包括完整抗体分子及其抗原结合片段。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“抗体片段”)是指抗体中保持了与人ctla-4或其表位特异性结合能力的一个或多个片段。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体。[0124]术语“分离的抗体”是指结合化合物的纯化状态，且在这种情况下意指该分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质例如细胞碎片和生长培养基。术语“分离(的)”并非意指完全不存在这类物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以明显干扰本文所述结合化合物的实验或治疗应用的量存在。[0125]术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征，且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。[0126]术语“鼠源抗体”或“杂交瘤抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的抗人ctla-4的单克隆抗体。制备时用ctla-4抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。[0127]术语“嵌合抗体”是具有第一抗体的可变结构域和第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种。通常，可变结构域获自啮齿动物等的抗体(“亲代抗体”)，而恒定结构域序列获自人抗体，使得与亲代啮齿动物抗体相比，所得嵌合抗体在人受试者中诱导不良免疫应答的可能性较低。[0128]术语“人源化抗体”是指含有来自人和非人(例如小鼠、大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，人源化抗体包含基本所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本所有的超变环相当于非人免疫球蛋白的超变环，而所有或基本所有的构架(fr)区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体任选可包含至少一部分的人免疫球蛋白恒定区(fc)。[0129]术语“全长抗体”或“完整抗体分子”指包含四条肽链的免疫球蛋白分子，两条重(h)链(全长时约50～70kda)和两条轻(l)链(全长时约25kda)通过二硫键互相连接。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为vh)和重链恒定区(在本文中缩写为ch)组成。重链恒定区由3个结构域ch1、ch2和ch3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区可被进一步细分为具有高可变性的互补决定区(cdr)和其间隔以更保守的称为框架区(fr)的区域。每一个vh或vl区由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq)的结合。[0130]术语“cdr”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的各个可变区中存在3个cdr，其对于各个重链和轻链可变区被命名为hcdr1、hcdr2和hcdr3或lcdr1、lcdr2和lcdr3。这些cdr的准确边界按照不同的系统有不同的定义。[0131]本发明的所述抗体的可变区cdr的精确氨基酸序列边界可使用许多公知的方案的任何方案来确定，包括基于抗体的三维结构和cdr环的拓扑学的chothia(chothia等人.(1989)nature 342:877-883，al-lazikani等人,“standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,journal of molecular biology,273,927-948(1997)基于抗体序列可变性的kabat(kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第4版,u.s.department of health and human services,national institutes of health(1987),abm(university of bath)，contact(university college london)，国际immunogenetics database(imgt)(1999nucleic acids research,27,209-212)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的north cdr定义。本发明抗体的cdr可以由本领域的技术人员根据本领域的任何方案(例如不同的指派系统或组合)确定边界。[0132]本文所使用的“抗原结合片段”包括抗体的片段或其衍生物，通常包括亲代抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个cdr)的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗原结合片段的实例包括但不限于fab，fab'，f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如scfv；由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体。当抗体的结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或其衍生物通常保持亲代抗体抗原结合活性的至少10％。优选结合片段或其衍生物保持亲代抗体的抗原结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。还预期抗体的抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。[0133]本发明所述的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包括申请号为cn202010708105.8和pct/cn2021/107707的专利申请中描述的任意一个抗ctla-4抗体或其抗原结合片段，本文将申请号为cn 202010708105.8和pct/cn2021/107707的专利申请所公开的全部内容以引入的方式纳入本文。在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗体的cdr序列包括来自于cn202010708105.8中描述的人源化抗ctla-4抗体hujs007-47、hujs007-48、hujs007-79和hujs007-106，其氨基酸序列如表a所示。[0134]表a：4种人源化抗ctla-4抗体的各部分的氨基酸序列(kabat方案)[0135][0136][0137]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含的lcdr1、lcdr2、lcdr3、hcdr1、hcdr2和hcdr3分别为：[0138]lcdr1：rasqnvgtyva(seq id no:1)；[0139]lcdr2：stsyrys(seq id no:2)；[0140]lcdr3：hqydtyplt(seq id no:3)；[0141]hcdr1：sgyywn(seq id no:4)；[0142]hcdr2：yigydgsnx1ynpslkx2，其中，x1为n或y，x2为s或n；[0143]hcdr3：x3yysgyfds，x3为d或n。[0144]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含：[0145]氨基酸序列如seq id no:1所示的lcdr1；[0146]氨基酸序列如seq id no:2所示的lcdr2；[0147]氨基酸序列如seq id no:3所示的lcdr3；[0148]氨基酸序列如seq id no:4所示的hcdr1；[0149]氨基酸序列如seq id no:5或7或9所示的hcdr2；[0150]氨基酸序列如seq id no:6或8所示的hcdr3。[0151]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。[0152]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:7和seq id no:8所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。[0153]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:9和seq id no:6所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。[0154]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段，优选为人源化抗体或其抗原结合片段。[0155]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:10所示的轻链可变区，和如seq id no:11所示的重链可变区。[0156]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:12所示的轻链可变区，和如seq id no:11所示的重链可变区。[0157]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:13所示的轻链可变区，和如seq id no:14所示的重链可变区。[0158]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:13所示的轻链可变区，和如seq id no:15所示的重链可变区。[0159]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体包含如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列，和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列。[0160]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体包含如seq id no:18所示的轻链氨基酸序列，和如seq id no:19所示的重链氨基酸序列。[0161]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体包含如seq id no:20所示的轻链氨基酸序列，和如seq id no:21所示的重链氨基酸序列。[0162]在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体包含如seq id no:22所示的轻链氨基酸序列，和如seq id no:23所示的重链氨基酸序列。[0163]在一些实施方式中，在本发明的方法和组合物中使用的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或嵌合抗体，且可包括人恒定区。在一些实施方式中，恒定区是选自人igg1、igg2、igg3及igg4恒定区组成的组；优选地，适用于本发明所述的方法和组合物的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含人igg1或igg4同种型的重链恒定区。[0164]在一些实施方式中，本发明提供了一种用于制备如本文所述的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适合于所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下在本文所述的宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞回收所表达的抗体或其抗原结合片段。[0165]本发明提供用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞，包括可获自美国典型培养物保藏中心(atcc)的许多永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ns0、sp2/0细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝细胞癌细胞、a549细胞、293t细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过测定哪种细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。[0166]在一个实施方式中，本发明提供制备抗ctla-4抗体的方法，其中所述方法包括，将表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足够的一段时间，以允许抗体在宿主细胞中表达，或者更优选抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中,来产生抗体。可采用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。[0167]很可能由不同细胞系表达或在转基因动物中表达的抗体彼此具有不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸分子编码的或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体是本发明的组成部分，而不论抗体的糖基化如何。同样，在某些实施方式中，非岩藻糖基化抗体是有利的，因为它们通常在体外和体内具有比其岩藻糖基化对应物更强力的功效，并且不可能是免疫原性的，因为它们的糖结构是天然人血清igg的正常组分。[0168]医药制剂[0169]本发明提供了一种药物组合物，包含：(1)缓冲液；(2)抗ctla-4抗体或其抗原结合片段。[0170]本发明所述药物组合物中的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段如本技术“抗ctla-4抗体”部分任一实施方式所述。[0171]例如，本发明所述药物组合物中的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，和氨基酸序列分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。优选地，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段，优选为人源化抗体或其抗原结合片段。优选地，上述抗ctla-4抗体或其抗原结合片段包含如seq id no:10所示的轻链可变区，和如seq idno:11所示的重链可变区。更优选地，上述抗ctla-4抗体包含如seq id no:16所示的轻链氨基酸序列，和如seq id no:17所示的重链氨基酸序列。[0172]本发明所述药物组合物中的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段的浓度为约1～100mg/ml，优选为约1～50mg/ml，更优选为约5～30mg/ml。[0173]本发明所述药物组合物的ph为约4.5～6.5，优选为约5.0～6.0，更优选为约5.3～5.7。[0174]本发明所述药物组合物中的缓冲液选自醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液和组氨酸缓冲液中的一种或多种；优选地，所述缓冲液为醋酸缓冲液。优选地，所述醋酸缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钾缓冲液，优选为醋酸-醋酸钠缓冲液。[0175]优选地，缓冲液的浓度为约5～100mm，优选为约10～50mm，优选为约10～30mm；优选为约15～25mm。优选地，缓冲液的ph为约4.5～6.5，优选为约5.0～6.0，优选为约5.3～5.7。[0176]因此，本发明的药物组合物可含有：ph约为5.0～6.0的醋酸缓冲液，其在药物组合物中的浓度约为10～30mm；和约1～50mg/ml的前文任一实施方式所述的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段，尤其是本文所述的人源化抗体hujs007-47或其抗原结合片段。[0177]在一些方案中，本发明所述药物组合物还包括稳定剂，所述稳定剂选自精氨酸、精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖和海藻糖中的一种或多种；优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。优选地，上述稳定剂的浓度为约10～400mm，优选为约100～300mm，优选为约130～280mm，优选为约200～260mm。优选地，上述稳定剂为浓度约130～280mm的甘露醇；或上述稳定剂为浓度约130～280mm的蔗糖；或上述稳定剂为浓度约20～80mm的氯化钠与浓度约110-170mm的甘露醇的组合；或上述稳定剂为浓度约20～80mm的氯化钠与浓度约110-170mm的蔗糖的组合；在一些方案中，上述稳定剂为浓度约200～260mm的甘露醇；或上述稳定剂为浓度约200～260mm的蔗糖；或上述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的甘露醇的组合；或上述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的蔗糖的组合。[0178]因此，本发明的药物组合物可含有：ph约为5.0～6.0的醋酸缓冲液，其在药物组合物中的浓度约为10～30mm；和约1～50mg/ml的前文任一实施方式所述的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段，尤其是本文所述的人源化抗体hujs007-47或其抗原结合片段；以及约130～280mm的稳定剂，优选地，所述稳定剂选自精氨酸、精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖和海藻糖中的一种或多种，优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。优选地，上述稳定剂为浓度约200～260mm的蔗糖；或上述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的甘露醇的组合；或上述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的蔗糖的组合。[0179]在一些方案中，上述药物组合物还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188中的一种或多种。优选地，以w/v计算，上述表面活性剂浓度为约0.001％～0.1％，优选为约0.01％～0.1％，优选为约0.01％～0.05％。[0180]因此，本发明的药物组合物可含有：ph约为5.0～6.0的醋酸缓冲液，其在药物组合物中的浓度约为10～30mm；和约1～50mg/ml的前文任一实施方式所述的抗ctla-4抗体或其抗原结合片段，尤其是本文所述的人源化抗体hujs007-47或其抗原结合片段；以及约130～280mm的稳定剂，优选地，所述稳定剂选自精氨酸、精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖和海藻糖中的一种或多种，优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。优选地，上述稳定剂为浓度约200～260mm的蔗糖；或上述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的甘露醇的组合；或上述稳定剂为浓度约30～70mm的氯化钠与浓度约120-160mm的蔗糖的组合；以及以w/v计，约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80。[0181]本发明的药物组合物为液体制剂或冻干制剂。[0182]本发明还提供了一种注射剂，其含有本文任一项方案中所述的药物组合物与氯化钠溶液或葡萄糖溶液；优选地，所述氯化钠溶液浓度为约0.85～0.9％(w/v)；优选地，所述葡萄糖溶液浓度为约5～25％(w/v)，更优选为约5～10％(w/v)；优选地，所述注射剂中，所述抗ctla-4抗体的浓度为约0.05～10.5mg/ml，更优选为约0.1～5mg/ml或约1～5mg/ml；所述注射剂的ph为约4.5～6.5，优选为约5.0～6.0，更优选为约5.3～5.7。[0183]在一些方案中，上述药物组合物或注射剂，其经静脉注射施用。[0184]医药用途和方法[0185]本发明还提供了本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂在制备用于治疗和/或预防ctla-4介导的疾病或病症的药物中的用途。[0186]本发明还提供了本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂，其用于治疗和/或预防ctla-4介导的疾病或病症。[0187]本发明还提供了一种治疗和/或预防ctla-4介导的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂。[0188]本发明中，ctla-4介导的疾病指在ctla-4参与了疾病的发生和发展的疾病，包括但不限于癌症。[0189]“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。此定义中包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症的例子包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌，肺癌(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺的腺癌，和肺的鳞癌)，腹膜癌，肝细胞癌，胃的癌或胃癌(包括胃肠癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝瘤(hepatoma)，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌或肾的癌，鼻咽癌，食管鳞状细胞癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝的癌，及各种类型的头颈癌，以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(nhl)，小淋巴细胞性(sl)nhl，中级/滤泡性nhl，中级弥漫性nhl，高级成免疫细胞性nhl，高级成淋巴细胞性nhl，高级小无核裂细胞性nhl，贮积病(bulky disease)nhl，套细胞淋巴瘤，aids相关淋巴瘤，和瓦尔登斯特伦氏(waldenstrom)巨球蛋白血症)，慢性淋巴细胞性白血病(cll)，急性成淋巴细胞性白血病(all)，毛细胞性白血病，慢性成髓细胞性白血病，和移植后淋巴增殖性病症(ptld)，以及与瘢痣病(phakomatoses)，水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯氏(meigs)综合征有关的异常血管增殖。[0190]实施例[0191]下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。本文已经详细描述了本发明，其中也公开了其具体实施方式。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下，针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则为本领域的常规方法和材料。[0192]实施例中所用的检测方法[0193](1)外观[0194]采用目检法来检测外观。确保澄明度检测仪的光照强度保持在1000lx～1500lx之间。将样品保持在眼睛的同一水平面，轻轻摇晃或颠倒以避免产生气泡。分别在黑色背景和白色背景前进行目检。从颜色，乳光和可见异物三个方面记录结果。[0195](2)蛋白含量[0196]蛋白浓度使用紫外分光光度计(thermofisher，bio mate 3s)来检测。将百分比消光系数(e1％)设定在1.5367(mg/ml)-1cm-1。使用bio mate 3s仪器，用超纯水清洗比色皿三次再向皿中加入150μl超纯水，点击测量，以超纯水做空白校正，空白样品吸光度不超出±0.003。使用超纯水稀释至0.3mg/ml～0.7mg/ml，每份终体积不得低于900μl，单次稀释倍数不得超过10倍。每个样品平行测定2份溶液，每份溶液重复测定3次；每份溶液测定之前均需先用150μl溶液润洗比色皿2次，然后取150μl溶液进行测定。通过消光系数及od值计算出对应检品的浓度。[0197](3)sec-hplc纯度[0198]sec-hplc纯度采用安装了sec色谱柱(tosoh g4000sxl sec 7.8mm id×30cm,8μm)的hplc(waters e2695仪器)进行检测。流动相组成为50mm三羟甲基氨基甲烷(tris)，150mm nacl，ph 7.4。采用峰面积归一化对结果进行定量分析。分别计算单体、聚体和片段的峰面积百分比，以单体的峰面积百分比作为样品的纯度，聚体和片段的峰面积百分比作为聚体和片段的含量。色谱参数见下表1。[0199]表1：sec-hplc色谱参数[0200]色谱条件色谱参数检测器波长280nm自动进样器温度25±3℃柱温5±3℃流速0.50ml/min进样体积25μl运行模式等度洗脱洗脱时间30.00min[0201](4)r-ce-sds纯度[0202]抗体制剂还原ce-sds电泳法纯度检测以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道。预先填充的凝胶会在毛细管内形成分子筛，十二烷基硫酸钠可消除不同蛋白质分子的电荷效应，还原剂β-巯基乙醇可切除样品中的二硫键，分子大小不同的样品在毛细管内移动速度不同，因而可进行分离。用上样缓冲液(sds-mw sample buffer)将样品稀释至1mg/ml；取上样缓冲液(sds-mw sample buffer)95μl，加入β-巯基乙醇5μl，涡旋混匀后作为空白对照。取供试品(1mg/ml)95μl，加入β-巯基乙醇5μl，3000rpm室温离心30sec，70±2℃孵育15±2min，冷却至室温，6000rpm室温离心1min，分离时间40min，使用安装了ce-sds卡盒的毛细管电泳仪(maurice仪器)检测。计算重链(hc)，非糖基化重链(nghc)和轻链(lc)的纯度，三者之和即为样品的纯度。[0203](5)nr-ce-sds纯度[0204]抗体制剂非还原ce-sds电泳法纯度检测以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道。预先填充的凝胶会在毛细管内形成分子筛，用十二烷基硫酸钠处理样品以消除不同蛋白质分子的电荷效应，使分子大小不同而在毛细管内移动速度不同的样品进行分离。供试品溶液中加入烷基化试剂，能够有效减小组分扩散，使所得峰型尖锐，分离效率高，且可以保证样品保持非还原状态。用上样缓冲液(sds-mw sample buffer)将样品稀释至1mg/ml；取上样缓冲液(sds-mw sample buffer)95μl，加入0.8m碘乙酰胺溶液5μl，涡旋混匀后作为空白对照；取供试品(1mg/ml)95μl，加入0.8m碘乙酰胺溶液5μl，3000rpm室温离心30sec，70±2℃孵育5±1min，冷却至室温，6000rpm室温离心1min，使用安装了ce-sds卡盒的毛细管电泳仪(maurice仪器)检测。[0205](6)cex-hplc纯度[0206]电荷异质性采用阳离子交换色谱法(cex-hplc)进行检测。样品经流动相a混合液稀释处理后，使用hplc检测。检测方法参数具体见下表。采用峰面积归一化法计算主峰、酸性峰、碱性峰百分比，如果采用自动积分无法获得合理的积分结果，则采用手动积分。详细色谱参数见下表2。[0207]表2：cex-hplc色谱参数[0208][0209](7)细胞活性[0210]实验第一天用hujs007-47分析缓冲液(rpmi 1640medium+1％fbs)稀释hujs007-47抗体至80μg/ml(4×分析浓度)，1.8倍梯度稀释，10个浓度。ctla-4fc protein浓度稀释至8μg/ml(4×分析浓度)备用。将gs-j1/cd28细胞密度调整为2.0×106cells/ml，再加入pha使其浓度为20μg/ml(4×分析浓度)备用。gs-c1/cd80细胞密度调整为1.0×106cells/ml备用。将hujs007-47抗体、ctla-4fc protein、gs-j1/cd28细胞和gs-c1/cd80细胞分别按照50μl/well加入到96孔圆底板中，置于37.0℃，5.0％二氧化碳培养箱中孵育24h。第二天每孔吸取16μl培养上清到htrf 96well low volume plate中，再加入4μl混合抗体(cisbio human il2 kits)，室温避光孵育18±2h，最后用多功能酶标仪读板(tecan，m1000 pro)和graphpad prism软件进行数据分析处理。计算公式为：ratio 665/620＝od 665nm/od620nm*10000。[0211](8)结合活性[0212]结合elisa(binding elisa)实验：使用酶标仪(thermo scientific，multiskan go)，用固定浓度的his标签ctla4抗原(1.0μg/ml)包板，2％ bsa封闭后，加入梯度稀释的抗体(1μg/ml起始，2.5倍梯度稀释共12个浓度)，将anti-human igg(fc specific)-peroxidase antibody produced in goat(sigma，a0170)稀释5000作为检测抗体进行检测，然后用0.1mg/ml tmb显色，最后用2m hcl终止反应，在450nm/620nm下读板。使用四参数对数回归(4pl)模型拟合ec50。[0213](9)亚可见颗粒检测[0214]亚可见颗粒检测采用微粒检测仪(mfi5100)进行检测。由于样品为高浓度样品，上样前需将进行一定稀释，稀释后轻轻充分混匀避免气泡后于超净台中用无热原枪头取样1.3ml至上样板中，上样板以洁净的锡箔纸覆盖严密，从超净台移至仪器对应工作板块后，将上样位置输入仪器，运行检测序列，样品流经流通池时，其中亚可见颗粒由微型摄像头拍照并进行计数。[0215]以下实施例中的缩写说明：“h”表示小时，“w”表示周，“m”表示月，“c”表示冻融循环的次数，“ft”表示冻融循环，“sh”表示振摇，“st”表示搅拌，“rt”表示室温，“rpm”表示转/分钟，“t0”表示处方样品经放样处理前的起始测试。[0216]实施例1：缓冲液体系和稳定剂初步筛选实验[0217]液体型药物组合物中，缓冲液体系密切影响抗体的稳定性，每种具有独特理化性质的抗体都具有最适宜的缓冲液的种类。本实施例旨在初步筛选出最佳缓冲液体系和稳定剂，使本发明公开的抗ctla-4抗体具有最佳的稳定性以适宜临床应用。[0218]1.1实验步骤[0219]本实施例以抗体hujs007-47进行。样品使用millipore pellicon3 88cm2膜进行uf/df超滤浓缩至浓度约21mg/ml，再将样品透析至对应的如表3所示的处方中，将最终浓度调至约20mg/ml，再加入对应浓度的聚山梨醇酯80。在超净台无菌灌装到2r西林瓶，2.0ml/瓶，进行稳定性放样和检测。[0220]表3：第一轮处方筛选-缓冲液体系和稳定剂初步筛选实验中的处方信息[0221][0222]1.2实验结果[0223]1.2.1外观和浓度结果[0224]根据表4的结果，经加速条件或长期条件，所有样品的蛋白含量均未出现显著变化。[0225]根据表5中的结果，所有样品在t0时均未发现明显可见异物，无明显乳光。经加速条件下放置4周，所有样品的外观均无显著变化；经长期条件下放置8周，除fs1-4出现蛋白沉淀外，其它所有样品的外观均未出现显著变化。[0226]表4：第一轮处方筛选—蛋白含量数据[0227][0228]表5：第一轮处方筛选—外观数据[0229][0230]1.2.2sec纯度结果[0231]根据表6中的sec纯度结果，经加速条件下放置4周，7个处方聚体和片段均增加，处方fs1-7纯度下降明显，处方fs1-1、fs1-3和fs1-5表现相对较优；经长期条件放置下放置12周，所有处方均未出现sec纯度的显著降低。[0232]表6：第一轮处方筛选—sec-hplc数据[0233][0234][0235]1.2.3r-ce-sds纯度结果[0236]根据表7中的r-ce-sds纯度结果，经加速条件放置4周处方fs1-7纯度下降明显其他组间差异不大，经长期条件放置4周，所有样品均未出现显著变化。[0237]表7：第一轮处方筛选—r-ce-sds数据[0238][0239]1.2.4nr-ce-sds纯度结果[0240]根据表8中的nr-ce-sds纯度结果，经加速条件放置4周所有样品纯度均出现下降，且处方fs1-7下降明显，其他组间差异不大，经长期条件放置4周，处方fs1-4、fs1-5、fs1-6和fs1-7纯度下降。[0241]表8：第一轮处方筛选—nr-ce-sds数据[0242][0243][0244]注：hhl是指具有两条重链和一条轻链的抗体碎片。[0245]1.2.5cex-hplc纯度结果[0246]根据表9中的cex-hplc纯度结果，经加速条件下放置4周，所有样品均出现酸碱峰增加主峰纯度降低，其中fs1-1、fs1-3、fs1-5和fs1-6四个处方主峰纯度降低较慢，处方fs1-7稳定性表现最差；经长期条件下放置放置8周，所有样品均未出现纯度显著降低。[0247]表9：第一轮处方筛选—cex-hplc数据[0248][0249]1.2.6结合活性结果[0250]根据表10中的结合活性结果，经加速或长期条件下放置4周，所有处方均未出现活性降低。[0251]表10：第一轮处方筛选—结合活性数据[0252][0253]1.2.7细胞活性结果[0254]根据表11中的细胞活性结果，经加速或长期条件下放置4周，所有处方均未出现活性降低。[0255]表11：第一轮处方筛选—细胞活性数据[0256][0257]1.2.8亚可见颗粒结果[0258]根据表12中的亚可见颗粒结果，经加速条件下放置4周，所有处方样品的颗粒数没有显著增加；经长期条件下放置8w，处方fs1-4颗粒明显增多与外观出现蛋白沉淀一致，其他所有处方样品的颗粒数没有显著增加。[0259]表12：第一轮处方筛选—亚可见颗粒数据[0260][0261]1.3第一轮处方筛选结论[0262]从蛋白含量、结合活性结果来看，所有处方未出现显著差异。从外观来看，处方fs1-4外观长期8周出现蛋白沉淀；从sec-hplc结果来看，处方fs1-7聚体增加明显；从cex-hplc结果来看处方fs1-2、fs1-4和fs1-7主峰纯度下降明显；从nr-ce-sds和r-ce-sds结果来看，处方fs1-7纯度下降明显。[0263]综上所述，醋酸缓冲液(fs1-3)和枸橼酸缓冲液(fs1-5)表现相对较优。因此选择20mm醋酸缓冲液(ph5.5)和20mm枸橼酸缓冲液(ph6.0)作为缓冲体系进入下一轮筛选实验。[0264]实施例2：稳定剂和表面活性剂筛选实验[0265]为了进一步探究不同辅料对抗体稳定性影响，我们选取不同的稳定剂和表面活性剂进行了比较测试。考察ph5.5、20mm醋酸缓冲体系和ph6.0、20mm柠檬酸缓冲体系，抗体hujs007-47浓度10mg/ml条件下，上述不同辅料对稳定性的影响。[0266]2.1实验步骤[0267]本实施例以抗体hujs007-47进行。样品使用millipore pellicon3 0.11m2膜进行uf/df超滤浓缩至浓度约10mg/ml，再将样品透析至对应的如表13所示的处方中，将最终浓度调至约10mg/ml，再加入对应浓度的聚山梨醇酯80。在超净台无菌灌装到2r西林瓶，2.0ml/瓶，进行稳定性放样和检测。[0268]表13：第二轮处方筛选-稳定剂和表面活性剂筛选实验中的处方信息[0269][0270]注“/”表示无。[0271]2.2实验结果[0272]2.2.1外观和浓度结果[0273]根据表14中的结果，经加速条件和长期条件下放置4周，所有样品的蛋白含量均未出现显著变化。[0274]根据表15中的结果，所有样品在t0时均未发现明显可见异物，无明显乳光。经加速条件放置4周，fs2-5、fs2-12两组处方外观上出现蛋白沉淀，其余处方外观正常。经长期条件下放置3个月均未发现明显可见异物。[0275]表14：第二轮处方筛选—蛋白含量数据[0276][0277]表15：第二轮处方筛选—外观数据[0278][0279][0280]2.2.2sec-hplc纯度结果[0281]根据表16中的sec纯度结果，所有样品经加速条件放置4w均出现聚集体和片段的增加，处方fs2-3和fs2-4下降速率较慢表现较优，长期条件下放置3m，所有样品单体纯度未出现明显下降。[0282]表16：第二轮处方筛选—sec-hplc数据[0283][0284][0285][0286]2.2.3r-ce-sds纯度结果[0287]根据表17中的r-ce-sds纯度结果，经加速条件下放置4周，所有样品均出现纯度下降，组间纯度差异不大。[0288]表17：第二轮处方筛选—r-ce-sds数据[0289][0290][0291]2.2.4nr-ce-sds纯度结果[0292]根据表18中的nr-ce-sds纯度结果，经加速条件下放置4周，所有样品均出现纯度下降，组间纯度差异不大。[0293]表18：第二轮处方筛选—nr-ce-sds数据[0294][0295]2.2.5cex-hplc纯度结果[0296]根据表19中的cex-hplc纯度结果，经长期条件下放置4周，所有样品均未出现纯度的显著变化。经加速条件下放置4周，所有样品均出现主峰纯度下降，处方fs2-2、fs2-5、fs2-6和fs2-10酸碱峰增加明显，但未表现出显著的组间差异。[0297]表19：第二轮处方筛选—cex-hplc数据[0298][0299][0300]2.2.6 细胞活性结果[0301]根据表20中的细胞活性结果， 经加速条件或长期条件下放置4周， 所有样品细胞活性结果均未出现显著变化。[0302]表20： 第二轮处方筛选—细胞活性数据[0303][0304][0305]2.2.7结合活性结果[0306]根据表21中的结合，经加速条件或长期条件下放置4周，所有样品结合活性结果均未出现显著变化。[0307]表21：第二轮处方筛选—结合活性数据[0308][0309][0310]2.2.8亚可见颗粒结果[0311]根据表22中的亚可见颗粒结果，经加速条件条件下放置4周，所有样品均出现大小颗粒增多，fs2-4表现最佳；经长期条件下放置4周无明显颗粒变化。[0312]表22：第二轮处方筛选—亚可见颗粒数据[0313][0314][0315]2.3第二轮处方筛选结论[0316]从蛋白含量、nr-ce-sds、r-ce-sds纯度、细胞活性和结合活性结果来看，所有处方未出现显著差异。从外观结果，可以得出处方中含辅料二水海藻糖的样品稳定性较差，吐温20和吐温80含量增高能提高溶解性。从sec-hplc和亚可见颗粒结果来看，可以得出醋酸缓冲体系中，含辅料蔗糖有较好稳定性。综上所述，20mm醋酸缓冲液(fs2-4)ph5.5含220mm蔗糖表现最优。[0317]实施例3：影响因素实验[0318]3.1实验步骤[0319]根据第二轮加速实验结果处方显示处方fs2-3、fs2-4、fs2-7和fs2-8四个处方稳定性较好，选择候选四个处方进行影响因素实验，本实施例以抗体hujs007-47进行。具体方案见表23。[0320]表23：影响因素实验方案[0321][0322][0323]3.2实验结果[0324]表24：影响因素检测结果汇总[0325][0326]影响因素实验结论：在四个处方中，经搅拌、冻融和震荡等影响因素考察后，sec-hplc、外观和亚可见颗粒结果均无明显差异，均表现出较好稳定性。[0327]实施例4：配伍稳定性实验[0328]实验步骤[0329]选取处方fs2-4考察0.9％氯化钠注射液和5％葡萄糖注射液两种介质稀释后的稳定性，本实施例以抗体hujs007-47进行。按如下方案稀释至相应介质不同浓度(表25)，放置于25℃恒温箱24h后检测。[0330]表25：相容性方案[0331][0332]表26：相容性检测结果汇总[0333][0334]注：样品编号“fs2-4-glu”表示用5％葡萄糖注射液稀释，样品编号“fs2-4-nacl”表示用0.9％氯化钠注射液稀释。[0335]相容性实验结论：以0.9％氯化钠注射液作为稀释溶媒时，在0.1mg/ml～5mg/ml的浓度范围都有良好的稳定性。以5％葡萄糖注射液作为溶媒时，稀释样品在低浓度0.1mg/ml时，sec-hplc结果出现片段增加，在1.0mg/ml～5.0mg/ml浓度范围表现良好稳定性。[0336]综上所述，我们通过对不同缓冲体系，不同ph条件、不同抗体浓度和不同辅料组成进行考察，目标ph范围控制在5.0～6.0，渗透压范围在250～350mosm/kg，选择了最优制剂配方：约20mm醋酸钠缓冲液(ph约为5.5)，约220mm蔗糖和约0.02％聚山梨醇酯80；为使渗透压处于300mosm/kg左右，蔗糖的浓度可以为约228mm。[0337]实施例5：抗ctla-4药物组合物的抗原亲和力[0338]使用ge医疗生命科学公司的t200型分子相互作用分析仪biacore，利用表面等离子共振技术，将40μg/ml羊抗人fc片断抗体(jackson immunoresearch)偶联在cm5芯片(ge医疗生命科学，货号：br100530)表面，然后捕获抗ctla-4药物组合物(按处方fs2-4的配方配制，抗体hujs007-47浓度0.5μg/ml)，再进样梯度稀释的his标签的重组人ctla-4抗原蛋白(君盟自制)，检测结合信号。ctla-4抗原蛋白梯度稀释浓度为24nm、12nm、6nm、3nm、1.5nm、0.75nm，其中24nm为重复。使用biacore分析软件biacore t200 evaluation software 3.0的动力学模型分析，拟合得到亲和力kd值。[0339]实验结果如表27和图1所示，抗ctla-4药物组合物与人ctla-4蛋白有较高的亲和力，kd数值为2.06e-10m。[0340]表27：抗ctla-4药物组合物与重组人ctla-4蛋白亲和力结果表[0341]抗原名称ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)重组人ctla-4蛋白8.18e+051.69e-042.06e-10[0342]实施例6：抗ctla-4药物组合物对hctla4人源化小鼠移植emt6肿瘤生长的抑制作用[0343]将小鼠乳腺癌emt6细胞(0.5×106)(atcc crl-2755)接种到hctla-4人源化小鼠(上海南方模式生物科技有限公司)右后背皮下。当肿瘤大小约为99mm3时，将小鼠随机分为5组，每组6只小鼠。小鼠腹腔注射10mg/kg的anti-klh higg1、1、3或10mg/kg抗ctla-4药物组合物(按处方fs2-4的配方配制，抗体为抗体hujs007-47)，每周给药两次，共5次。实验结果如图2所示，接种肿瘤后第24天，与anti-klh higg1相比，10mg/kg的抗ctla-4药物组合物显著性抑制肿瘤生长，tgi值为96.4％(p《0.05)。此外，动物对抗ctla-4药物组合物的耐受性良好，研究期间小鼠体重逐渐增加。其中，肿瘤抑制率tgi％(tgi％＝[1-(ti-t0)/(vi-v0)]×100％)，(ti：治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值，t0：治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值；vi：阴性对照组在给药第i天的肿瘤体积均值，v0：阴性对照组在给药第0天的肿瘤体积均值)。[0344]实施例7：抗ctla-4抗体的药物组合物的生物学活性[0345]检测人源化抗ctla-4抗体与huctla-4的结合、阻断huctla-4与cd80/cd86结合的能力以及拮抗huctla-4的生物学活性。本实施例人源化抗ctla-4抗体按处方fs2-4的配方配制，实验方法和结果如下所示。[0346]7.1elisa法检测人源化抗ctla-4抗体与huctla-4的结合[0347]使用pbs(hyclone)稀释hx1 hctla4 his至1.0μg/ml，以100μl/孔加入酶标板，37℃恒温培养箱中静置包被90min；洗板；加入200μl/孔2％bsa至板内，置37℃恒温培养箱内孵育90min；洗板。将人源化抗ctla-4抗体及对照抗体ipilimumab(君实自制，参见专利wo2001014424a2和cn1371416a)用稀释液(2％bsa)稀释至1000ng/ml，每次稀释倍数不高于10倍。然后，在样品稀释板上以2.5倍梯度依次稀释人源化抗体及对照抗体。所有人源化抗体及对照抗体溶液以100μl/孔加入酶标板中，置37℃恒温培养箱内孵育60min；洗板；将hrp偶联的羊抗人抗体igg(fc特异性)(sigma，货号：a0170)用2％bsa稀释5000倍，以100μl/孔加入酶标板，置37℃恒温培养箱内孵育60min；洗板；加入显色液tmb，100μl/孔，避免气泡，37℃避光显色15min；最后加2m的盐酸溶液终止反应，100μl/孔，避免气泡，10min内完成酶标仪读数(波长：450/620nm)。图3为人源化抗ctla-4抗体对比对照抗体的相对结合活性。[0348]如图3所示，人源化抗ctla-4抗体具有与huctla-4良好的结合，与对照抗体相当或优于对照抗体ipilimumab。[0349]7.2elisa法检测人源化抗ctla-4抗体阻断huctla-4与cd80结合的能力[0350]使用pbs(hyclone)稀释hx1 hctla4-his至1.0μg/ml，以100μl/孔加入酶标板，37℃恒温培养箱中静置孵育90min；洗板；加入200μl/孔2％bsa至板内，置37℃恒温培养箱内孵育90min；洗板；取mx2 hcd80 fc(君盟自制)用2％bsa稀释至5.0μg/ml，并以此浓度的mx2 hcd80 fc来稀释抗体。将人源化抗ctla-4抗体及对照抗体ipilimumab(君实自制，参见专利wo2001014424a2和cn1371416a)稀释至100μg/ml，每次稀释倍数不高于10倍。然后，在样品稀释板上以2.5倍梯度依次稀释人源化抗体及对照抗体。所有人源化抗体及对照抗体溶液以100μl/孔加入酶标板中，置37℃恒温培养箱内孵育90min；洗板；将hrp偶联的羊抗鼠抗体igg(fc特异性)用2％bsa稀释5000倍，以100μl/孔加入酶标板，置37℃恒温培养箱内孵育60min；洗板；加入显色液tmb，100μl/孔，避免气泡，37℃避光显色15min；最后加2m的盐酸溶液终止反应，100μl/孔，避免气泡，10min内完成酶标仪读数(波长：450/620nm)。图4为人源化抗ctla-4抗体对比对照抗体的相对抑制活性。[0351]如图4所示，人源化抗ctla-4抗体具有良好的阻断huctla-4与cd80结合的能力，与对照抗体相当或优于对照抗体ipilimumab。[0352]7.3荧光素酶法检测人源化抗ctla-4抗体拮抗huctla-4的生物学活性t0)/(vi-v0))×100％。ti：治疗组和阳性对照组在给药第i天的肿瘤体积均值；t0：治疗组和阳性对照组在给药第0天的肿瘤体积均值；vi：阴性对照组在给药第i天的肿瘤体积均值；v0：阴性对照组在给药第0天的肿瘤体积均值。[0371]如图8所示，在小鼠接种肿瘤细胞后第25天，klh igg1阴性对照组平均肿瘤体积为975±115mm3，ipilimumab(君实自制，参见专利wo2001014424a2和cn1371416a)阳性对照组平均肿瘤体积为824±267mm3，与klh igg1相比，相对肿瘤抑制率为18.1％；hujs007-47治疗组、hujs007-48治疗组、hujs007-79治疗组和hujs007-106治疗组平均肿瘤体积分别为229±85mm3、313±197mm3、550±229mm3和472±125mm3，与klh igg1相比，相对肿瘤抑制率分别为89.2％、79.1％、50.9％和60.1％，表明上述人源化抗ctla-4抗体能够体内抑制b-hctla4人源化小鼠mc38-wt细胞皮下移植瘤的生长，且明显优于对照抗体ipilimumab。[0372]实施例11：fortebio结合实验鉴定抗原表位[0373]使用protein a探针(fortebio)先分别捕获全长抗体，即2.7μg/ml的人源化抗ctla-4抗体hujs007-47与2μg/ml的对照抗体(ipilimumab，君实自制，参见专利wo2001014424a2和cn1371416a)。再将探针浸入55nm的人源ctla(huctla)抗原溶液中，使全长抗体与抗原结合。最后将探针浸入600nm fab溶液中，包括人源化fab hujs00-47与对照fab(ipilimumab)，检测抗原与fab是否发生结合。[0374]如图9所示，全长抗体hujs007-47与抗原huctla-4结合后，huctla-4可以继续与对照fab(ipilimumab)结合，但按照fortebio结合实验检测结果，hujs007-47与ipilimumab结合于huctla-4的不同表位。[0375]实施例12：hujs007-47药物组合物对hctla4人源化小鼠移植mc38肿瘤生长的抑制作用[0376]取6-8周龄雌性hctla4人源化小鼠(百奥赛图江苏基因生物技术有限公司)，于右侧背部皮下接种1×106小鼠结肠癌细胞mc38细胞(上海舜冉生物科技有限公司)(0.1ml/只(含细胞的培养基rmpi1640(gibco)))。待平均肿瘤体积约为119mm3时，挑选40只动物，根据肿瘤体积随机分为5组，每组8只动物。分别为[0377]anti-klh higg1阴性对照组，1mg/kg；[0378]ipilimumab阳性对照组，1mg/kg；[0379]hujs007-47治疗组，0.1mg/kg；[0380]hujs007-47治疗组，0.3mg/kg；[0381]hujs007-47治疗组，1mg/kg；[0382]本实施例人源化抗ctla-4抗体按处方fs2-4的配方配制。[0383]分组当天给药，所有组给药途径均为腹腔注射，每周给药2次，连续给药6次，末次给药3天后结束实验。每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。实验结束时，将小鼠安乐死，计算肿瘤抑制率tgi％(tgi％＝[1-(ti-t0)/(vi-v0)]×100％)。(ti：治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值，t0：治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值；vi：阴性对照组在给药第i天的肿瘤体积均值，v0：阴性对照组在给药第0天的肿瘤体积均值)。[0384]如图10所示，在开始给药后第21天，anti-klh higg1阴性对照组在1mg/kg的剂量下的平均肿瘤体积为1116±106mm3。ipilimumab(君实自制，参见专利wo2001014424a2和cn1371416a)阳性对照组在1mg/kg的剂量下的平均肿瘤体积为255±88mm3，tgi％为86.36％。hujs007-47在0.1，0.3和1mg/kg的剂量下，平均肿瘤体积分别为736±203mm3，47±12mm3，33±15mm3，tgi％分别为38.11％、107.22％和108.63％。表明hujs007-47在0.1，0.3和1mg/kg的剂量下，显著抑制hctla4人源化小鼠移植mc38肿瘤体积增长，并呈现良好的剂量效应，且在等剂量条件下(1mg/kg)，hujs007-47抑瘤作用显著优于ipilimumab。[0385]实施例13：hujs007-47药物组合物对hctla4人源化小鼠移植h22肿瘤生长的抑制作用[0386]取6-8周龄雌性hctla4人源化小鼠(上海南方模式生物科技股份有限公司)，于右侧背部皮下接种1×106小鼠肝癌细胞h22细胞(上海诺百生物科技有限公司，货号c01-fv)(0.1ml/只(含细胞的培养基rmpi1640(gibco)))。待平均肿瘤体积约为119mm3时，挑选35只动物，根据肿瘤体积随机分为5组，每组7只动物。分别为[0387]anti-klh higg1阴性对照组，0.3mg/kg；[0388]ipilimumab阳性对照组，0.1mg/kg；[0389]hujs007-47治疗组，0.03mg/kg；[0390]hujs007-47治疗组，0.1mg/kg；[0391]hujs007-47治疗组，0.3mg/kg；[0392]本实施例人源化抗ctla-4抗体按处方fs2-4的配方配制。[0393]分组当天给药，所有组给药途径均为腹腔注射，每周给药2次，连续给药6次，末次给药3天后结束实验。每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。实验结束时，将小鼠安乐死，计算肿瘤抑制率tgi％，计算方式与实施例15相同。[0394]如图11所示，在开始给药后第21天，anti-klh higg1阴性对照组在0.3mg/kg的剂量下的平均肿瘤体积为2304±402mm3。ipilimumab(君实自制，参见专利wo2001014424a2和cn1371416a)阳性对照组在0.1mg/kg的剂量下的平均肿瘤体积为837±397mm3，tgi％为67.14％。hujs007-47在0.03，0.1和0.3mg/kg的剂量下，平均肿瘤体积分别为1674±508mm3，466±171mm3，271±155mm3，tgi％分别为28.83％、84.12％和93.04％。表明hujs007-47在0.1和0.3mg/kg的剂量下，显著抑制hctla4人源化小鼠移植h22肿瘤体积增长，并呈现良好的剂量效应，且在等剂量条件下(0.1mg/kg)，hujs007-47抑瘤作用显著优于ipilimumab。[0395]序列表[0396]seq id no:1 rasqnvgtyva[0397]seq id no:2 stsyrys[0398]seq id no:3 hqydtyplt[0399]seq id no:4 sgyywn[0400]seq id no:5 yigydgsnnynpslks[0401]seq id no:6 dyysgyfds[0402]seq id no:7 yigydgsnyynpslks[0403]seq id no:8 nyysgyfds[0404]seq id no:9 yigydgsnnynpslkn[0405]seq id no:10[0406]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqnvgtyvawyqqkpgkvpkpliystsyrysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyfchqydtypltfgagtklelk[0407]seq id no:11[0408]qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsaysitsgyywnwirqhpgkglewigyigydgsnnynpslksrvtisrdtsknqfslklssvtaadtavyycardyysgyfdswgqgttltvss[0409]seq id no:12[0410]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqnvgtyvawyqqkpgkapkpliystsyrysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyfchqydtypltfgagtklelk[0411]seq id no:13[0412]eivmtqspatlsvspgeratlscrasqnvgtyvawyqqkpgqaprpliystsyrysgiparfsgsgsgteftltisslqsedfavyychqydtypltfgqgtkleik[0413]seq id no:14[0414]qvqlqesgpglvkpsqtlsltcavsgysissgyywnwirqppgkglewigyigydgsnyynpslksrvtmsvdtsknqfslklssvtavdtavyycarnyysgyfdswgqgttvtvss[0415]seq id no:15[0416]qvqlqesgpglvkpsqtlsltcavsgysitsgyywnwirqppgkglewigyigydgsnnynpslknrvtmsvdtsknqfslklssvtavdtavyycardyysgyfdswgqgttvtvss[0417]seq id no:16[0418]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqnvgtyvawyqqkpgkvpkpliystsyrysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyfchqydtypltfgagtklelkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec[0419]seq id no:17[0420]qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsaysitsgyywnwirqhpgkglewigyigydgsnnynpslksrvtisrdtsknqfslklssvtaadtavyycardyysgyfdswgqgttltvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk[0421]seq id no:18[0422]diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqnvgtyvawyqqkpgkapkpliystsyrysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyfchqydtypltfgagtklelkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec[0423]seq id no:19[0424]qvqlqesgpglvkpsqtlsltctvsaysitsgyywnwirqhpgkglewigyigydgsnnynpslksrvtisrdtsknqfslklssvtaadtavyycardyysgyfdswgqgttltvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk[0425]seq id no:20[0426]eivmtqspatlsvspgeratlscrasqnvgtyvawyqqkpgqaprpliystsyrysgiparfsgsgsgteftltisslqsedfavyychqydtypltfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec[0427]seq id 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