构树多糖在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于植物多糖技术领域，尤其涉及一种构树多糖在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用。背景技术：2.对乙酰氨基酚(acetaminophen，apap)是目前全球最常用的解热镇痛药物，具有解热作用缓慢而持久、刺激性小、极少有过敏反应等优点。apap是一种经典的剂量依赖型肝损伤药物，在治疗剂量之内是安全的，但过量服用之后会导致严重的肝脏损伤甚至急性肝功能衰竭。3.近年来，apap诱导的肝损伤发病率在我国不断上升，主要原因有以下两点：(1)单一apap制剂使用广泛：2015版《中国药典》中收录了对乙酰氨基酚的9种剂型、2015版《中国兽药典》收录2种兽用剂型，使用范围广加之个体差异导致apap引起肝损伤的可能性加大；(2)含apap制剂的增加，包括速效感冒胶囊、快克、感康、999感冒灵等常见药物，多种含对乙酰氨基酚成分的药物混合使用导致摄入总量超出正常范围，这也是目前引起apap肝损伤的主要原因，apap引起的药物性肝损伤(简称dili)逐渐引起大家的关注。4.apap导致dili损伤机制十分复杂，主要包括:体内代谢有毒物质的生成、线粒体功能障碍、炎症反应、氧化应激等。当apap过多摄入时，其代谢过程中产生的大量napqi超过了gsh的解毒能力，导致gsh耗竭，napqi持续累积与细胞内和线粒体蛋白质形成共价结合，引起线粒体损伤，进而导致细胞死亡。5.氧化应激是apap致肝毒性的重要原因之一。在napqi被解毒过程中，gsh耗尽造成肝细胞氧化还原失衡，肝细胞中氧化产物累积导致氧化应激，增加了超氧阴离子的产生，同时增加了组织中过氧亚硝酸盐的生成，导致肝细胞的坏死。此外，apap被肝脏代谢后引起氧化应激产生大量自由基和亲电子基团，过量自由基引起生物膜上的不饱和脂肪酸过氧化，改变膜的流动性和通透性，破坏膜的完整性，亲电子基团与内质网膜上的巯基结合，导致细胞内钙失衡，引起细胞内钙超载，导致细胞死亡。6.炎症被认为是引起肝组织损伤的主要原因，apap诱导的肝损伤主要特征是肝细胞坏死，细胞内容物(包括核dna片段，高迁移率族蛋白，线粒体dna，尿酸和atp)释放，这些刺激因子起着与损伤相关的分子模式的作用，可以转录激活促炎细胞因子(tnf-α，il-1β，il-6和il-10)和趋化因子(mcp-1，mip-2和il-8)，导致中性粒细胞和单核巨噬细胞被激活并募集到肝脏的损伤区域，引起炎症反应，造成继发肝脏损伤。7.联苯双酯是我国创制的一种治疗肝炎的降酶药物，作为合成五味子丙素时的中间体，是治疗病毒性肝炎和药物性肝损伤引起转氨酶升高的常用药物，具有保护肝细胞，增加肝脏的解毒功能的药理作用。近些年的研究发现，多种中药及其有效成分可以改善或缓解肝脏损伤程度。技术实现要素：8.本发明要解决的技术问题是提供一种构树多糖在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用。9.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：10.构树多糖在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用。11.预防或治疗肝损伤药物能缓解肝损伤并维持肠道稳态。12.肝损伤为药物性肝损伤。13.药物性肝损伤为对乙酰氨基引起。14.构树多糖由构树叶经水提醇沉后再经纯化而得。15.构树多糖的纯度不低于75％。16.构树多糖包括三种分子量的多糖，它们由七种单糖构成。17.三种分子量分别为2413.725kda、47.590kda、10.283kda。18.七种单糖分别为半乳糖：半乳糖醛酸：岩藻糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：阿拉伯糖，其摩尔比为28.2：27.9：15：12.4：9.3：3.9：3.3。19.预防或治疗肝损伤药物为口服制剂。20.通过研究，发明人发现了构树多糖的新用途，即在制备预防或治疗肝损伤药物中的应用。发明人通过对乙酰氨基酚建立小鼠的肝损伤模型，发现给予构树多糖的小鼠肝脏病理变化明显缓解、显著降低了肝损伤小鼠血清中alt、ast及炎症因子il-6、il-10和tnf-α水平，增加了肝组织中gsh、gsh-px、cat、sod的水平并减少了mda的积累，降低肝脏中cyp2e1的含量，同时提高gst和sult1a1含量从而增强肝脏对apap代谢物的解毒能力。此外，构树多糖可以调节肠道菌群，维持apap肝损伤小鼠的肠道稳态。因此，构树多糖可以有效缓解apap诱导的药物性肝损伤，在保肝药物的开发中具有很大的潜力。附图说明21.图1是构树多糖的结构表征图，图中：a葡萄糖标准曲线；b多糖分子量；c单糖组成；d红外光谱。22.图2是构树多糖对小鼠肝脏组织形态的影响图，图中：con:正常组、apap:模型组、pd：阳性药物对照组(联苯双酯)、l-bpp:低剂量构树多糖组、m-bpp:中剂量构树多糖组、h-bpp:高剂量构树多糖组。23.图3是构树多糖对小鼠肝脏组织结构的影响图，图中：con:正常组、apap:模型组、pd：阳性药物对照组(联苯双酯)、l-bpp:低剂量构树多糖组、m-bpp:中剂量构树多糖组、h-bpp:高剂量构树多糖组。24.图4是构树多糖对小鼠血清生化指标的影响图，图中：a丙氨酸氨基转移酶(alt)、b天门冬氨酸氨基转移酶(ast)；con:正常组、apap:模型组、pd：阳性药物对照组(联苯双酯)、l-bpp:低剂量构树多糖组、m-bpp:中剂量构树多糖组、h-bpp:高剂量构树多糖组。25.图5是构树多糖对小鼠肝脏炎症指标的影响图，图中：a白介素6(il-6)、b肿瘤坏死因子α(tnf-α)、c白介素10(il-10)；con:正常组、apap:模型组、pd：阳性药物对照组(联苯双酯)、l-bpp:低剂量构树多糖组、m-bpp:中剂量构树多糖组、h-bpp:高剂量构树多糖组。26.图6是构树多糖对小鼠肝脏氧化指标的影响图，图中：a丙二醛(mda)；b还原型谷胱甘肽(gsh)；c谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)；d总超氧化物歧化酶(sod)；con:正常组、apap:模型组、pd：阳性药物对照组(联苯双酯)、l-bpp:低剂量构树多糖组、m-bpp:中剂量构树多糖组、h-bpp:高剂量构树多糖组。27.图7是构树多糖对小鼠肝脏主要代谢酶的影响图，图中：a细胞色素p450家族成员2e1(cyp2e1)、b苯酚磺基转移酶(sult1a1)、c小鼠谷胱甘肽s转移酶(gst)；con:正常组、apap:模型组、pd：阳性药物对照组(联苯双酯)、l-bpp:低剂量构树多糖组、m-bpp:中剂量构树多糖组、h-bpp:高剂量构树多糖组。28.图4至图7中，不同的字符的条形图之间有显著性差异，p《0.05)。具体实施方式29.一、材料30.1.1药材31.新鲜构树叶由广西壮族自治区合浦县公馆镇聚和种养农民专业合作社提供，于阴凉处晾干备用。32.1.2实验动物33.4周龄spf级雄性km小鼠70只，购自于长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号scxk(湘)2019-0014。34.1.3主要试剂35.对乙酰氨基酚(ar，99.0％)购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；联苯双酯滴丸(h11020980)购自于北京协和药厂；无水乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、苯酚、浓硫酸购自于成都市科隆化学品有限公司；葡萄糖购自于天津市大茂化学试剂厂；正丁醇、三氯甲烷购自于广东省化学试剂工程技术研究开发中心；丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶测(ast)购自于桂林优利特医疗电子有限公司；白介素6(il-6)、白介素10(il-10)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)、细胞色素p450家族成员2e1(cyp2e1)、小鼠谷胱甘肽s转移酶(gst)、小鼠苯酚磺基转移酶(sult1a1)检测试剂盒购自于江苏酶免实业有限公司；总超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、还原型谷胱甘肽(gsh)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)检测试剂盒购自于南京建成生物工程研究所；d101大孔树脂购自于天津市光复精细化工研究所，透析袋(8000-14000d)购自于美国viskase公司。36.二、方法37.2.1构树多糖提取与纯化38.(1)水提液制备。构树叶：纯水＝1∶10(m/v)，大火煮沸后转为小火保持微沸1h，滤液用纱布过滤，重复上述步骤3次；混合3次提取液用旋转蒸发仪65℃减压浓缩至500ml；3000rpm离心10min，去除下层杂质；39.(2)醇沉。无水乙醇：浓缩液＝4∶1(v/v)，于4℃静置24小时；3000rpm离心10min，得到构树多糖沉淀；40.(3)除蛋白。将构树多糖加适量纯水溶解，采用sevage法(正丁醇∶氯仿＝1:4)，sevage试剂：多糖溶液＝1:4(v/v)，密封后于磁力搅拌器中搅拌20min，3000rpm离心10min，除去上层液体，重复操作8-10次，直至中间蛋白层消失，用旋转蒸发仪减压蒸发至无有机试剂味，重复步骤(2)；41.(4)脱脂肪。沉淀物∶丙酮＝3∶1(m/v)，于磁力搅拌器中搅拌20min，3000rpm离心10min，除去上层液体；重复操作2-3次，按照上述步骤依次加入丙酮、无水乙醇、乙醚；42.(5)脱色素。采用静态吸附法：将预处理好的d101树脂与多糖溶液(5mg/ml)按1∶15(m/v)的比例在500r/min的条件下摇床，常温条件下振荡96h，振荡结束后，过滤使多糖溶液和树脂填料分离，收集多糖溶液。43.(6)透析：将上述洗脱液灌入处理过后的透析袋中(体积不超过透析袋体积的2/3)，两端用夹子夹紧，放入含有5000ml去离子水的烧杯中，置于4℃的冰箱中，透析96h，每12h更换一次去离子水，透析后的多糖溶液减压蒸发至适当体积。44.(7)冻干。浓缩后的多糖溶液在-80℃超低温冰箱冷冻12h后，放置于冻干机内冻干，得到构树多糖。45.2.2多糖理化性质46.2.2.1多糖含量和单糖组成测定47.以葡萄糖为对照品建立标准曲线，通过苯酚-硫酸法测定多糖含量。48.(1)多糖分子量49.采用通过hpgpc测定多糖分子量和纯度：精密称取样品和标准品，样品配制成5mg/ml溶液，12000rpm离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中。采用brt105-104-102串联凝胶柱(8x300mm)；0.05m nacl溶液为流动相、流速：0.6ml/min、柱温：40℃；进样量：20μl采用示差检测器ri-10a进行检测。50.(2)单糖组成51.取17种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、n-乙酰-d氨基葡萄糖、n-乙酰-d氨基半乳糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成标准母液溶液。52.取各单糖标准溶液精密配置浓度标准品作为混标。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。精密称量10mg样品置于安瓿瓶中，加入3m三氟乙酸10ml，120℃水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入10ml水涡旋混匀，吸取100ul加入900ul去离子水，12000rpm离心5min后取上清进离子色谱仪分析。53.(3)多糖红外光谱分析54.精密称取样品2mg和溴化钾200mg，压制成片，空白对照采用溴化钾粉末压片而成。分别置于傅里叶变换红外光谱仪ft-ir650(天津港东科技发展股份有限公司)进行扫描记录。55.2.3实验动物的给药与造模56.将小鼠随机分为正常组、模型组、低剂量(100mg/kg)构树多糖组、中剂量(200mg/kg)构树多糖组、高剂量(400mg/kg)构树多糖组、阳性药物(联苯双酯)对照组分笼饲养。构树多糖组按剂量每日灌胃给药，持续灌14d，对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水，阳性药物对照组按照150mg/kg剂量灌胃联苯双酯；除对照组小鼠外，最后一次给药后禁食16小时，小鼠灌胃apap(200mg/kg)建立肝损伤模型。12小时后，眼眶取血后立即解剖，肝脏称重并记录，取肝左叶于甲醛固定液中，用于he染色；剩余肝脏放入-80℃保存用于后续检测。57.2.4肝组织病理形态学检查58.将固定好的肝组织进行石蜡包埋，并切成厚度4-5μm的切片，按he染色步骤进行操作，显微镜下观察、拍照.59.2.5血液生化指标测定60.采用全自动生化分析仪分析血清中的alt和ast。61.2.6肝脏的抗氧化能力。62.按照试剂盒说明书检测肝脏的gsh、mda、sod和gsh-px水平63.2.7肝脏的炎症因子和主要代谢酶检测64.按照试剂盒说明书检测肝脏il-6、il-10、tnf-α以及主要的代谢酶cyp2e1、sult1a1、gst的含量。65.2.8肠道菌群16s测序66.2.9盲肠内容物的16s rdna测序67.提取盲肠内容物的基因组dna后检测纯度和完整性。选择16s rrna的通用引物338f(5′‑actcctacggagggcagcag-3′)和806r(5′‑ggactachvgggtwtctaat-3′)扩增v3-v4高变区。pcr产物通过axyprep dna凝胶回收试剂盒纯化，并通过quantifluor定量tm-圣彼得堡(美国普罗梅加)。根据上海美吉生物医药科技有限公司的标准方案，使用truseqtm dna样本制备试剂盒建立pe文库，并通过illumina miseq pe300平台测序。观测分类单元(otu)基于uparse软件根据97％的相似性聚类，消除了嵌合序列。采用r软件包进行主坐标分析(pcoa)，以显示样品中微生物组的β多样性。采用wilcoxon秩和检验比较两组基于属水平的细菌分类。采用线性判别分析(lda＝3.5)和lda效应大小(lefse)分析各组细菌群落的优势度。68.三、试验结果与分析69.3.1构树多糖的结构表征。70.以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法测得制备的构树多糖含量为75％(图1-a)。得到的构树多糖由三种分子量的多糖组成，分别为2413.725kda、47.590kda、10.283kda(图1-b)；进一步研究发现该多糖由7种单糖组成，其组成及摩尔比分别是半乳糖：半乳糖醛酸：岩藻糖：鼠李糖：葡萄糖醛酸：葡萄糖：阿拉伯糖＝28.2：27.9：15：12.4：9.3：3.9：3.3(图1-c)。71.红外光谱显示提取的构树多糖具有典型的多糖结构特征(图1-d)：吸收带在3600-3200cm-1是-oh的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：3390cm-1是o-h的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2935cm-1处有一个吸收峰，可能归属于c-h伸缩振动。在1714cm-1处有吸收峰，可能归属于c＝o伸缩振动。在1635m-1处有一个吸收峰，可能归属于结晶水。在1417cm-1处有吸收峰，可能归属于c-o伸缩振动。在1338cm-1处有吸收峰，可能归属于c＝o对称伸缩振动。在1253cm-1处、1058cm-1处有吸收峰，可能归属于o-h变角振动。在912cm-1处有吸收峰，可能归属于吡喃环的非对称环伸缩振动。在890cm-1处有吸收峰，可能归属于吡喃环的β-端基差向异构的c-h变角振动。72.3.2构树多糖对肝损伤小鼠的保护作用。73.(1)构树多糖对肝损伤小鼠肝脏形态的影响。74.肝脏形态变化可以反映肝脏的受损程度，正常组小鼠肝脏呈红褐色，质地柔软；模型组小鼠肝脏充血，肝脏外观不均匀，有斑点出现，用药组小鼠的肝脏呈现不同程度的恢复(图2)。75.(2)构树多糖对肝损伤小鼠的肝脏结构的影响。76.正常的组织结构是保证器官功能的基础，正常组小鼠肝小叶的结构完整，肝索排列整齐，肝细胞圆润、饱满，未见变性和坏死。模型组小鼠肝小叶结构破坏，肝索几乎不可见，肝细胞变性、中央静脉周围肝细胞坏死以及肝细胞核溶解消失并且伴有一定量的出血。不同剂量的构树多糖组对于apap造成的肝脏损伤均有一定的恢复作用，尤其以高剂量组(h-bpp)组肝脏的组织结构基本呈现正常状态(图3)。77.(3)构树多糖对肝损伤小鼠肝脏血液生化的影响。78.apap引起的肝损伤最主要的特点是肝细胞坏死，肝细胞坏死后细胞内容物会释放到血液引起血液相关生化指标的改变，血清中alt、ast、alp、tp、alb水平能直接反映肝功能。与对照组比较，模型组的血清alt、ast和alp水平显著升高表示建模成功，同时tp和alb下降表示肝脏蛋白合成的能力受到影响；与模型组相比，bpp给药组均使得血清ast、alt和alp水平显著下降，能够达到与联苯双酯相当的水平。并且高剂量的构树多糖(h-bpp)在恢复肝脏蛋白合成功能的效果方面更优于联苯双酯(图4)。79.(4)构树多糖对肝损伤小鼠肝脏炎症指标的影响。80.il-6、tnf-α、il-10在apap诱导肝损伤发生发展上有重要作用，apap诱导产生的il-6、tnf-α可导致肝细胞加剧损伤以致死亡；与对照组比较，模型组中il-6、il-10和tnf-α因子显著升高；与模型组比较，l-bpp和h-bpp可以降低肝脏中的il-6含量，但是效果弱于联苯双酯；m-bpp可以降低小鼠肝脏中的tnf-α，使之恢复到正常水平；不同剂量的bpp均可以降低肝损伤小鼠肝脏的il-10水平，其中h-bpp可以使il-10恢复至正常水平(图5)。以上结果表明构树多糖具有一定的抗炎作用。81.(5)构树多糖对小鼠肝脏氧化指标的影响82.机体氧化与抗氧化系统的失调是apap肝损伤的一个重要特征。在氧化应激过程中，酶防御系统中最易发生变化的酶有超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)，过氧化氢酶(cat)在肝脏中也大量存在；在非酶防御系统中，还原型谷胱甘肽(gsh)和丙二醛(mda)的含量变化是最常见的。83.与正常组相比，模型组的mda含量显著升高，同时主要的酶防御体系和非酶防御体系中具有抗氧化功能的各种物质含量均显著下降，表明肝脏已经发生了严重的氧化应激。与模型组相比较，bpp组的mda水平显著下降，并且h-bpp可以使gsh、gsh-px、cat、sod水平恢复到正常组水平(图6)。说明构树多糖具有很好的抗氧化能力。84.(6)构树多糖对小鼠肝脏主要代谢酶的影响85.化学代谢是外源性有毒化合物的重要解毒机制可分为两个连续的阶段，主要依赖ⅰ相代谢酶和ⅱ相代谢酶。在apap第一阶段的代谢中，细胞色素p450(主要是cyp2e1)通过初步氧化激活外源化合物，形成高活性的有毒物质；第二阶段主要是解毒阶段，ⅱ相酶如谷胱甘肽转移酶(gst)和磺基转移酶(sult1a1)，催化ⅰ相反应代谢物与内源底物(如谷胱甘肽)的结合。86.apap在肝脏cyp450系统(主要是cyp2e1)作用下生成有毒物质napqi，与正常组相比，模型组小鼠肝脏的cyp2e1含量增多，sult1a1和gst含量减少，导致有毒的napqi在肝脏内大量蓄积，诱导并加剧小鼠肝损伤。bpp可以降低cyp2e1酶的活力，减少napqi的累积；同时bpp还可以提高sult1a1、gst的含量，增强肝脏对apap的解毒能力(图7)。说明构树多糖可以通过增强肝脏对apap的解毒能力缓解小鼠的肝损伤，具有很好的抗氧化能力。87.(7)构树多糖对小鼠肠道菌群的影响。88.为了评估bpp处理后对apap肝损伤小鼠肠道细菌群落的物种丰富度和多样性的影响，发明人分析了每个样本中观察到的物种和shannon指数。稀释曲线表明测序的数据是合理可靠的。结果表明，apap组肠道微生物群的细菌丰富度和多样性低于con和bpp组。pcoa图显示apap治疗组小鼠粪便中的细菌群落与未治疗组显著不同，而bpp组的细菌群落与未治疗组的细菌群落接近。这些结果表明，apap会导致肠道微生物群失衡，bpp恢复apap诱导的细菌群落改变。89.此外，细菌在门水平上的分布表明，apap处理后deferribacterota的相对丰度显著升高、firmicutes相对丰度显著减少(p《0.05)，而bpp治疗组小鼠粪便微生物群中desulfobacterota、deferribacterota的相对丰度明显低于apap组小鼠，bdellovibrionota丰度显著上升(p《0.01或p《0.05)。90.在属水平上，apap处理的小鼠中的两个主要细菌属表明lactobacillus、odoribacter显著减少，但是enterococcus、bacteroides、norank_f__norank_o__clostridia_ucg-014、erysipelatoclostridium、blautia、colidextribacter、gordonibacter、eubacterium_fissicatena_group、norank_f__eubacterium_coprostanoligenes_group、eubacterium_nodatum_group、family_xiii_ad3011_group、eubacterium_brachy_group oscillibacter的相对丰度显著增加(p《0.01)。与apap组相比，bpp组小鼠肠道的corynebacterium、prevotellaceae_ucg-001、alloprevotella、jeotgalicoccus、paenochrobactrum丰度显著上升。enterorhabdus、norank_f__norank_o__clostridia_ucg-014、erysipelatoclostridium、gordonibacter、norank_f__eubacterium_coprostanoligenes_group、eubacterium_nodatum_group、family_xiii_ad3011_group、eubacterium_brachy_group、candidatus_stoquefichusnorank_f__eggerthellaceae显著降低(p《0.01或p《0.05)。然而，bpp可以逆转这种变化。









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