基于ABC转运蛋白基因表达量的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测方法及试剂盒 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术基于abc转运蛋白基因表达量的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测方法及试剂盒技术领域1.本发明属于生物技术领域，具体涉及基于abc转运蛋白基因表达量的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测方法及试剂盒。背景技术：2.二斑叶螨tetranychusurticaekoch，又名二点叶螨，属于节肢动物门蛛形纲蜱螨亚纲(acari)、真螨目叶螨科叶螨属(tetranychus)，是一种在世界范围内分布的重大农业害螨(grbic et al.,2011)。二斑叶螨食性繁杂，其寄主作物多达50多科1100余种，其中包括草莓、茄子、豆类、西瓜、甜瓜、苹果等蔬菜和瓜类、果树等(dermauw et al.,a link between host plant adaptation and pesticide resistance in the polyphagous spider mite tetranychus urticae.proceedings of the national academy of sciences,2013,110(2):113-122)，给农业生产的健康发展带来严重阻碍。二斑叶螨个体微小，成螨仅0.5mm，为害隐蔽性强，在其为害初期很难被发现；繁殖力强且世代周期短，孤雌生殖，田间种群数量呈现指数生长态势。该螨通常在成螨、幼螨和若螨阶段以口针在寄主植株叶背刺穿表皮吸取营养物质进行为害，刺吸处周边逐渐泛白，降低植物的正常光合作用，为害严重时可致叶片枯萎、甚至脱落，甚至导致植物整株枯死，影响农产品的产量和质量(gorman et al.,new developments in insecticide resistance in the glasshouse whitefly(trialeurodes vaporariorum)and the two-spotted spider mite(tetranychus urticae)in the uk.pest management science,2002,58(2):123-130)。在我国，化学防控是二斑叶螨最重要也是最主要的防治手段，但随着化学药剂大量频繁的施用，加上二斑叶螨自身的生物学特性，加速其抗药性的形成和发展(zhang et al.,frequencies and mechanisms of pesticide resistance in tetranychus urticae field populations in china.insect science,2022,29(3):827-839)。目前，二斑叶螨对多种杀虫杀螨剂、至少96种活性成分已产生了不同程度的抗药性，使得该螨的化学防控面临更严重挑战。3.阿维菌素abamectin是由日本北里大学大村智等和美国merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，由链霉菌中灰色链霉菌streptomyces avermitilis发酵产生。该药剂具有触杀、胃毒活性，对昆虫和螨类具有触杀和胃毒作用并有微弱的熏蒸作用，无内吸作用。但它对叶片有很强的渗透作用，可杀死表皮下的害虫，且残效期长。自1991年在我国获得登记以来，由于其广谱杀虫活性而被广泛用于田间害虫防治。多年来，它在害虫防治中发挥了重要作用。由于阿维菌素的长期大量及不科学不合理的使用最终造成了害虫对其产生抗性。在实验室内，许多害虫已经汰选出了阿维菌素抗性，更为可怕的是，田间多种害虫已被报道阿维菌素产生抗性，包括小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、稻纵卷叶螟、二斑叶螨、西花蓟马等(xu et al.,status of pesticide resistance and associated mutations in thetwo-spotted spider mite,tetranychus urticae,in china.pesticide biochemistry and physiology,2018,150:89-96)，这其中二斑叶螨对阿维菌素的抗性最强，引起的关注也最多。1998年，美国太平洋西北部地区的田间二斑叶螨对阿维菌素产生了低至中等水平抗性(beers et al.,resistance to aabamectin and reversion to susceptibility to ffenbutatin oxide in spider mite(acari:tetranychidae)populations in the pacific northwest.journal of economic entomology,1998,91(2):352-360)。近年来在埃塞俄比亚、土耳其、希腊、美国、加拿大、澳大利亚等地区二斑叶螨对阿维菌素产生高水平抗药性案例均有报道(papapostolou et al.,identification and characterization of striking multiple-insecticide resistance in a tetranychus urticae field population from greece.pest management science,2021,77(2):666-676；herron et al.,development of abamectin resistance in tetranychus urticae in australian cotton and the establishment of discriminating doses for t.lambi.experimental and applied acarology,2021,83(3):325-341)。在我国，刘庆娟等人(刘庆娟等，四个二斑叶螨地理种群卵对10种杀螨剂的敏感性差异.植物保护,2012,38(4):178-180)发现山东昌乐和沂源地区二斑叶螨种群中卵期对阿维菌素表现为敏感度下降，随后在2014-2021年陆续报道我国黑龙江、陕西、山东、浙江、海南等地区的二斑叶螨也对阿维菌素表现出高抗性(tang et al.,stage-specific expression of resistance to different acaricides in four field populations of tetranychus urticae(acari:tetranychidae).journal of economic entomology,2014,107(5):1900-1907；zhang et al.,frequencies and mechanisms of pesticide resistance in tetranychus urticae field populations in china.insect science,2022,29(3):827-839)。由此可见，国内外二斑叶螨对阿维菌素的抗性问题都已日趋严重。4.二斑叶螨对阿维菌素抗性已非常突出，因此为了更有效指导阿维菌素的使用并进行抗性治理，开发有效的二斑叶螨对阿维菌素抗性早期快速分子诊断技术就显得尤为重要。目前，尽管一些基于pcr方法的分子标记技术如rapd(random amplified polymorphic dna，随机扩增多态性dna)、aflp(amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)已经用于一些害虫抗性相关基因的研究，但这些技术受限于引物扩增的重复性差、适宜的酶切位点难找、酶切结果的不稳定性等问题，因此，目前针对二斑叶螨对阿维菌素的抗性监测依旧采用传统的生物测定方法。然而，传统的生物测定方法有一些明显缺点：(1)灵敏度低：生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性；(2)周期长：二斑叶螨的生物测定结果需要耗时超过24小时；(3)对试虫数量要求很大：测定一个标准曲线完成一次生物测定需要500-600头生理状态一致的试虫。(4)操作繁琐且标准性不强：传统的生测方法(玻片浸渍法、叶片浸渍法等)比较繁琐，加上叶螨体型微小，操作起来比较复杂，而且从虫源、饲养到测定难以做到真正的标准化，尤其要求试虫生理状态一致，不仅导致生测的工作量加大，而且诸多人为因素也会影响生测结果；(5)传统的方法从软件绘出的标准曲线求出的lc50和lc90值的重复性和精确性较低；(6)传统的生物测定方法对供试叶螨测得的抗性水平往往具有滞后性，对于指导用药和抗性治理极其不利。5.随着分子生物学技术进一步的飞速发展，人们已经将实时荧光定量pcr技术(real time-quantitative polymerase chain reaction,rt-qpcr)广泛应用于多种病毒、细菌的抗药性检测，并开始应用于转录水平上昆虫抗药性靶标基因的表达量检测。实时荧光定量pcr就是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr扩增进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。相对于生物测定等常规抗性检测手段，实时荧光定量pcr具有操作简单，灵敏度高，重复性好等优点，因而已开始成为害虫抗药性靶标基因转录水平表达量检测的首选方法，在抗药性检测上日益显示出强大的优势。6.已有研究报道，谷氨酸门控氯离子通道(glutamate-gated chloride channel，glucl)中glucl1基因的g314d位点与glucl3基因中的g326e位点突变导致了二斑叶螨对阿维菌素形成抗性(kwon et al.,a point mutation in a glutamate-gated chloride channel confers abamectin resistance in the two-spotted spider mite,tetranychus urticae koch.insect mol.biol.,2010,19(4):583-591)；xue等又揭示了glucl3基因上的i321t位点可能与阿维菌素抗性相关(xue et al.,untangling a gordian knot:the role of a glucl3 i321t mutation in abamectin resistance in tetranychus urticae.pest management science,2021,77(4):1581-1593)，目前仅在欧洲抗阿维菌素的二斑叶螨红色型种群中检测到了该基因的突变(simma etal.,acaricide resistance status and identification of resistance mutations in populations of the two-spotted spider mite tetranychus urticae from ethiopia.experimental and applied acarology,2020,82(4):475-491)，但上述点突变的检测应用于田间种群的效果并不理想，因为突变频率与抗性倍数并不呈现线性关系，例如有些种群的g326e位点的突变频率极低，但种群对阿维菌素的抗性倍数依然很高(xu et al.,status of pesticide resistance and associated mutations in the two-spotted spider mite,tetranychus urticae,in china.pesticide biochemistry and physiology,2018,150:89-96)。同时，希腊二斑叶螨田间抗性种群中，研究发现细胞色素p450基因cyp392a16的过表达导致了二斑叶螨对阿维菌素的抗性(riga et al.,abamectin is metabolized by cyp392a16,a cytochrome p450 associated with high levels of acaricide resistance in tetranychus urticae.insect biochemistry and molecular biology,2014,46:43-53)，但该基因在中国二斑叶螨种群中未呈现高表达。7.abc(atp binding cassette)转运蛋白超家族是一大类跨膜蛋白，主要功能是利用atp水解产生的能量将与其结合的底物转出质膜，同时也参与多种有毒物质的吸收、积累和排泄等，在机体组织防御中起到重要作用。最近研究表明，二化螟chilo suppressalis的abc转运蛋白abcc8、csabce1和csabch1可能参与该虫对阿维菌素的抗性(guan et al.,identification and validation of atp-binding cassette transporters involved in the detoxification of abamectin in rice stem borer,chilo suppressalis.j.agric.food chem.,2022,70(15):4611-4619)，高表达的cpom08323可能参与苹果蠹蛾cydia pomonella对阿维菌素的抗性(ju et al.,genome-wide identification,characterization,and expression profiling of atp-binding cassette(abc)transporter genes potentially associated with abamectin detoxification in cydia pomonella.ecotoxicol.environ.saf.,2022,230:113152)。8.毫无疑问，二斑叶螨早期抗药性分子检测与诊断技术的开发将为其抗性治理措施的评价以及抗药性风险预警提供技术手段，在减少害虫为害损失、促进合理选药用药、保障蔬菜、果品等农产品的质量安全和保障人民身体健康等方面具有重要的意义。因此，建立一种准确、简便、快速、可靠的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测手段极为重要，也是具有极大可行性的。技术实现要素：9.本发明针对目前传统的二斑叶螨对阿维菌素抗药性监测技术中存在的灵敏度低、检测周期长、重复性差及材料要求高等问题，拟通过特异性荧光定量pcr引物筛选及其反应体系的优化等步骤，建立一种快速准确的实时荧光定量pcr分子检测方法及快速、简便、准确、高效的检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的检测试剂盒，为二斑叶螨对阿维菌素的快速检测提供有效工具。10.本发明的一个目的是提供二斑叶螨abcc1基因在检测或监测二斑叶螨对阿维菌素抗性中的应用。具体地，检测基因的表达量下调则表明二斑叶螨对阿维菌素产生了抗药性。11.更优选地，其通过用于检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的pcr检测试剂盒来进行检测，优选地以二斑叶螨abcc1基因的非保守片段区(跨膜区)为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对，具体地，所述二斑叶螨靶标基因abcc1的保守片段区的核苷酸序列如序列表中序列1所示；更优选地，所述试剂盒包含以下叶螨靶标基因abcc1特异性引物序列：12.正向引物：5′‑agctatcggagtgatgtcgtg-3′，13.反向引物：5′‑gctcctgaaaatcccaagcc-3′。14.本发明的另一个目的是提供了一种用于检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的pcr检测试剂盒。15.本发明所提供的用于检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的pcr检测试剂盒，其包含以下叶螨靶标基因abcc1特异性引物序列：16.正向引物：5′‑agctatcggagtgatgtcgtg-3′，17.反向引物：5′‑gctcctgaaaatcccaagcc-3′。18.任选地，还包括以二斑叶螨持家基因actin的保守片段区为靶目标序列设计得到的内参基因actin特异性引物序列(正向引物：5′‑accttcaacaccccagccat-3′；反向引物：5′‑gatggcatgaggtaaggcgtaac-3′)，用于校正样品间实验误差。19.进一步地，试剂盒中还含有逆转录酶，dnase，rnase抑制剂，dntp混合物，基因特异性扩增引物，mgcl2溶液，热启动taq dna聚合酶，荧光定量反应液，buffer缓冲液，rnase-free水等实验组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据自身需要选用。此外，试剂盒还包括符合该试剂盒要求的阳性对照及阴性对照样品。20.本发明的再一个目的是提供一种检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的pcr检测方法。21.本发明所提供的检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的pcr检测方法，包括以下步骤：22.(1)提取待测二斑叶螨群体的rna样品，并反转录为cdna模板；23.(2)将所述cdna模板加入到含有特异性引物对的pcr反应液中得到pcr反应体系；24.(3)进行实时荧光定量pcr检测；25.其特征在于：所述特异性引物对包括以二斑叶螨abc转运蛋白超家族中abcc亚家族abcc1基因的非保守片段区(跨膜区)为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对以及二斑叶螨持家基因核糖体蛋白actin基因的保守片段区为靶目标序列设计得到的内参基因actin特异性引物序列。26.所述二斑叶螨靶标基因abcc1的保守片段区的核苷酸序列如序列表中序列1所示。27.所述靶标基因abcc1特异性引物对的序列如下：28.正向引物qc1-f：5′‑agctatcggagtgatgtcgtg-3′，29.反向引物qc1-r：5′‑gctcctgaaaatcccaagcc-3′。30.所述实时荧光定量pcr检测的扩增程序为：95℃预变性10min，95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸32sec，进行40个循环。31.pcr过程完成后，按0.l℃/s的升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证，具体过程为：95℃进行15s，然后60℃进行1min，接着95℃进行30s，最后再在60℃进行15s。32.本发明使用abi prism 7500实时荧光定量pcr仪进行检测。33.abi prism 7500实时荧光定量pcr仪进行结果分析时，基线设置取3-15个循环的荧光信号。为便于比较，样品、阴性及阳性对照的所有扩增曲线的阈值均设定为0.249562(位于扩增曲线对数期中间位置，其它仪器基线和阈值设定可根据仪器作相应调整)。34.对上述步骤中荧光定量pcr反应产物进行荧光定量检测，在特定的波长条件下，根据荧光检测的二斑叶螨抗性和敏感样品间各自靶标基因abcc1与内参基因actin之间的ct值差值(即△ct值)判断结果，若所述待测二斑叶螨样品产生典型的“s”型扩增曲线及单峰融解曲线，且△ct值≥6.5，则说明所述二斑叶螨待测样品对阿维菌素产生抗性；35.若△ct值《6，则说明待测二斑叶螨样品未对阿维菌素产生抗性。若△ct值位于两者中间，则建议重做，样品对阿维菌素抗性产生与否视重做结果而定。36.所述待测二斑叶螨的rna样品为二斑叶螨成螨阶段的rna样品。37.本发明还一个目的是提供一种制备对阿维菌素产生抗性二斑叶螨的方法，其特征在，通过基因工程方法将二斑叶螨体内的abcc1基因表达进行下调或敲除，具体通过基因编辑方法实现。由此得到的对阿维菌素产生抗性二斑叶螨可以作为研究抗性的对照等用途。38.本发明系选择二斑叶螨abcc1基因的非保守片段区(跨膜区)为靶目标序列，根据该基因特点和实时荧光定量pcr引物的设计原则，设计了一对特异性引物，再配合已发表的内参基因actin特异性引物，建立了一种用于二斑叶螨对阿维菌素抗性检测的实时荧光定量pcr试剂盒及其检测方法。较之现有生物测定技术而言，本发明所提供的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测的实时荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法，具有如下效果及优点：39.(1)特异性更强。本发明是利用二斑叶螨abcc1基因的非保守片段区(跨膜区)为靶目标序列，设计了一对特异性引物，从而在pcr过程中可以对靶目标序列进行特异性扩增。40.(2)灵敏度和准确度更高。本发明涉及的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测方法，相对于传统生物测定的误判率及重复性、稳定性较差等问题，检测的灵敏度和准确度大大提高。41.(3)检测周期短。传统生物测定过程至少需要24小时的时间，本发明方法仅需3小时即可完成判断，且一次可以同时检测多个样品，特别适合于大批量样品的快速检测。42.(4)材料要求少。二斑叶螨生物测定中测定一个标准曲线至少需要约500-600头标准试虫，这些试虫的饲养及挑取需要花费一定的人力、物力和财力。而本发明对一个种群的检测只需要150-200头左右的成螨。resistance in tetranychus urticae field populations in china.insect science,2022,29(3):827-839.56.(2)二斑叶螨抗性种群fs-gd，原采集自广东佛山的茄子寄主上，采集回来后再干净无虫的自育菜豆上进行继代饲养，每隔3代测定其阿维菌素的抗性水平，该种群对阿维菌素的抗性倍数为高抗且抗性较为稳定。该种群作为实施例1和实施例2中的阿维菌素抗性种群使用。57.(3)二斑叶螨对阿维菌素的近等基因系抗性种群nil-aba：该种群在中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内继代饲养，每隔2-3代采用阿维菌素进行抗性汰选；记载过该二斑叶螨对阿维菌素抗性种群(nil-aba)的非专利文献是：zhang y,tian t,zhang k,xie w,wu qj,zhang yj,wang sl.lack of fitness cost and inheritance of resistance to abamectin based on the establishment of a near-isogenic strain of tetranychus urticae.journal of integrative agriculture,2022,doi://10.1016/j.jia.2022.10.058.(4)二斑田间抗性种群wh-hb，采集自湖北武汉的水芹上，田间采集方法为随机取样，每间隔1000m采样一次，每个地区至少取三个点的样本，将每个点采集的约1000头成螨混合在一起，代表该地区的二斑叶螨种群。59.(5)二斑叶螨田间抗性种群cp-bj，采集自北京昌平的草莓上，田间采集方法为随机取样，每间隔1000m采样一次，每个地区至少取三个点的样本，将每个点采集的约1000头成螨混合在一起，代表该地区的二斑叶螨种群。60.(6)二斑叶螨田间抗性种群sg-sd，采集自山东寿光的茄子上，田间采集方法为随机取样，每间隔1000m采样一次，每个地区至少取三个点的样本，将每个点采集的约1000头成螨混合在一起，代表该地区的二斑叶螨种群。61.(7)二斑叶螨田间抗性种群qp-sh，采集自上海青浦的草莓园内，田间采集方法为随机取样，每间隔1000m采样一次，每个地区至少取三个点的样本，将每个点采集的约1000头成螨混合在一起，代表该地区的二斑叶螨种群。62.以上所用的7个种群：二斑叶螨敏感种群(ipp-ss)、二斑叶螨抗性种群fs-gd、二斑叶螨对阿维菌素抗性种群(nil-aba)、田间采集种群hb-wh、cp-bj、sg-sd、qp-sh。本实验室均有保存，可向公众发放用于实验研究。上述二斑叶螨种群均在26±1℃室内人工气候箱中采用水隔离台法进行饲养，种群繁育时人工转入干净无虫的菜豆植株上饲养。饲养温度是26±1℃，相对湿度为60％-70％，光周期为光照：黑暗＝16h：8h。63.实施例164.本发明最近研究发现二斑叶螨中abc转运蛋白c亚家族中的abcc1基因的表达量在抗性和敏感种群中存在显著差异，且在二斑叶螨抗性种群中下调表达，该基因序列在二斑叶螨阿维菌素抗性和敏感种群中不存在有义突变，且该基因被沉默后二斑叶螨对阿维菌素抗性增强，说明该abcc1基因表达量下调与阿维菌素抗性密切相关，因此，该基因可以作为研究抗性的靶标基因，并且利用实时荧光定量pcr技术检测abcc1表达量的下降水平是一种有效检测田间害虫对阿维菌素抗性的好方法。65.1.二斑叶螨种群及其对阿维菌素抗性测定66.本试验采用二斑叶螨种群包括长期饲养在室内的阿维菌素敏感种群ipp-ss和三个抗性种群(nil-aba、qp-sh和fs-gd)。室内采用农业农村部颁布的行业标准(ny/t3539-2020)—琼脂浸叶法，测定其对阿维菌素的抗性，具体方法为：将阿维菌素梯度稀释成6-7个浓度，将圆形菜豆叶碟浸入不同浓度药液中10秒，取出在室温下风干，将叶片背面朝上置于略大于叶碟直径的铺有0.2％琼脂的塑料培养皿内。再将活跃的二斑叶螨雌成螨20-30头小心挑到叶碟上，盖上带小孔的盖子(利于水汽蒸发)。每个浓度设置3次重复，以蒸馏水处理为对照组。药剂处理组与对照组均置于温度26±1℃、湿度为60±5％、光照周期是l:d＝16h:8h的培养箱中。24h后，显微镜下检查记录测试叶螨的死亡和存活数量；当用毛笔尖端轻触螨体时叶螨完全不动或仅有一只足活动判定为叶螨死亡。生测数据采用polo plus 2.0软件进行分析。67.由表1中数据可知，二斑叶螨敏感种群对阿维菌素的lc50值很低，为0.046mg/l，与此lc50值相比，其他三个种群分别表现出4297倍、8343倍和27334倍的抗性倍数，均为高抗性种群。68.表1二斑叶螨不同种群对阿维菌素的抗性测定[0069][0070]2.二斑叶螨abcc1基因克隆与表达[0071](1)rna提取与反转录[0072]采用trizol试剂(invitrogen)提取二斑叶螨敏感种群和抗性种群(分别为二斑叶螨个体100-150头)的总rna，操作步骤参考其说明书，全程在超净工作台中进行。总rna的完整性通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，其纯度和浓度采用nanodrop微量分光光度计进行测定。随后将rna通过反转录试剂盒primescripttm reagent kit反转录为cdna模板，操作过程参考试剂盒说明书步骤，合成的cdna立即置于-20℃下备存，用于下一步的abcc1基因克隆。[0073](2)抗性与敏感种群abcc1基因克隆[0074]以二斑叶螨cdna为模板进行abcc1基因全长扩增，采用的上游引物(5’‑agtctacaaattgtgacgcaaaa-3’)和下游引物(5’‑actcaattcgcaaagttaaattgtga-3’)均为特异性引物。扩增体系(20μl)：1.0μl的cdna模板，上游引物和下游引物分别为1.25μl，0.5μl的dntps，5μl的1×q5反应缓冲液，5μl的1×q5高gc增强剂，0.25μl q5高保真聚合酶(new england biolabs,usa)，5.75μl的纯净水。pcr反应在伯乐s1000扩增仪上进行，扩增程序为：首先在98℃下预变性30sec；然后进行35个循环，包括98℃变性10sec，53-58℃退火30s，72℃延伸2min；最后在72℃延伸5min。pcr产物在琼脂糖凝胶电泳上检测。[0075]pcr扩增产物回收纯化后交由北京擎科生物科技有限公司进行测序，该abcc1基因的cdna全长序列为3984bp。[0076](3)抗性与敏感种群abcc1基因表达量比较[0077]基于上述基因克隆中扩增获得的abcc1基因序列，采用primer5设计其特异性荧光定量引物，正向引物(qc1-f)为：5′‑agctatcggagtgatgtcgtg-3′，反向引物(qc1-r)为：5′‑gctcctgaaaatcccaagcc-3′。[0078]荧光定量pcr反应体系(20μl)：cdna模板1μl，2×super real pre mix plus 10μl，50×rox reference dye 0.4μl，正向引物和反向引物(10μmol/l)分别为0.6μl，加水至20μl。荧光定量pcr扩增条件为：95℃预变性10min，95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环。[0079]二斑叶螨敏感种群和抗性种群的abcc1基因的荧光定量pcr结果采用2-δδct法进行分析比较，结果表明，所有测试的阿维菌素抗性种群中abcc1基因的表达量均显著低于敏感种群(p《0.05)(图1)。[0080]3.靶标基因abcc1基因的rnai干扰[0081](1)abcc1基因dsrna合成[0082]根据克隆获得的abcc1基因的全长序列，利用primer5软件设计基因特异性的上游引物(5’‑gaaccaatttttccgagcaa-3’)和下游引物(5’‑gctgcaagattggggaaata-3’)，并在其5’端分别添加t7启动子序列，通过pcr获得候选基因片段，进行回收测序等，随后采用promega双链rna合成试剂盒来合成靶标基因的dsrna，具体步骤参照试剂盒说明书，最后使用分光光度计和琼脂糖电泳检测dsrna浓度及完整度。[0083](2)rnai干扰及药剂处理[0084]首先挑取二斑叶螨雌成螨(3～5日龄)置于2ml离心管中饥饿24h；同时将菜豆叶片裁剪成边长为1.5cm方形大小，置于60℃烘干3min，再浸泡于dsrna溶液中(500ng/μl，abcc1或egfp)3h，待其充分吸收，同时设置水处理为空白对照、增强绿色荧光蛋白egfp为阴性对照。挑取饥饿处理24h后的健康雌成螨于dsrna处理后的菜豆叶片上进行持续取食48h。然后，分别挑取三个处理中存活的雌成螨，采用标准的琼脂糖浸叶法(ny/t 3539-2020)测定其在不同阿维菌素浓度(0.03ppm、0.05ppm和0.08ppm，分别对应测试种群30％、50％和70％的死亡率)处理24h后的死亡率。[0085]与对照处理相比，靶标基因干扰后二斑叶螨abcc1表达量降低，干扰试验中存活的二斑叶螨置于阿维菌素的不同浓度中，各浓度中其死亡率分别为15％、24％和36％，均显著低于对照处理(图2)，说明该基因的表达量下调与二斑叶螨对阿维菌素的抗药性相关。[0086]实施例2[0087]利用实时荧光定量pcr技术对二斑叶螨ipp-ss及fs-gd的成螨cdna样品的检测及本检测试剂盒和其使用方法的建立。[0088]1.二斑叶螨靶标基因扩增引物设计[0089]二斑叶螨中已发现103个abc蛋白，其中abc超家族中的c亚家族包含了39个基因，而基因功能存在差异，基因之间存在着不同程度的序列相似性。为了实现对靶标基因abcc1的精准干扰和沉默，而不会同时干扰到其他c亚家族基因，故以二斑叶螨abcc1基因的非保守片段区为靶标序列(序列表中序列1)，根据实时荧光定量pcr引物设计原则，设计特异性荧光定量引物，序列如下：[0090]正向引物(qc1-f)：5′‑agctatcggagtgatgtcgtg-3′，反向引物(qc1-r)：5′‑gctcctgaaaatcccaagcc-3′。[0091]该特异性引物扩增片段序列如图3所示，其扩增特异性如图4(其中，1：目的基因abcc1的pcr扩增片段；2：内参基因actin的pcr扩增片段；m：markerⅰ)所示，从图中可看出该引物扩增特异性高，扩增条带单一，大小为186bp，符合实时荧光定量pcr反应要求。此外，从图中也可看出本试验中使用的内参基因actin的引物扩增特异性也很高，扩增条带单一，大小为150bp，也符合实时荧光定量pcr反应要求。[0092]2.二斑叶螨rna提取、反转录及荧光定量pcr[0093]提取二斑叶螨敏感种群和抗性种群的rna，反转录为cdna模板，在包括步骤1所述特异性引物的实时荧光定量pcr反应体系中进行反应；[0094](1)二斑叶螨总rna的提取步骤如下：[0095]①取70-100头生长状态一致的雌成螨，放入1.5ml无rnase的离心管中，使用液氮进行速冻，在离心管中加入两个直径为2mm的钢珠和1000μl rna抽提试剂trizol，将其放在研磨仪中进行研磨，每次30s，频率为70hz，一共研磨6次至二斑叶螨被完全研磨，在室温下放置5min。[0096]②加入200μl氯仿，涡旋震荡1min，使溶液充分混匀，在冰上静置5min。[0097]③4℃、13000rpm离心15min，使用移液枪轻轻吸取300μl的上清液转移到新的1.5ml无rnase的离心管中，并做好标记。[0098]④加入300μl异丙醇溶液，轻轻的上下颠倒离心管，使溶液充分混匀，在冰上静置30min，4℃、13000rpm离心15min，倒掉上清液。[0099]⑤加入1000μl配制好的75％乙醇溶液，用移液枪吸打至底部沉淀浮起，4℃、8000rpm离心5min。[0100]⑥重复步骤⑤。[0101]⑦倒掉上清液，在室温下放置5-10min，之后加入10μl无rnase水进行溶解，冰上放置。[0102]⑧用nanodrop 2000测定rna的浓度和质量，根据qrt-pcr的要求将rna定量到1μg。[0103](2)反转录合成cdna模板：[0104]采用takara公司的去基因组的rt试剂盒进行反转录，实验过程如下：[0105]①使用前将试剂盒各组分解冻并离心混匀；[0106]②基因组dna的去除反应：[0107][0108]③反转录反应将下列各组分混匀，在pcr仪中反应37℃温育15min，85℃反应5s，将pcr产物放置在-20℃保存。[0109][0110](3)实时荧光定量pcr标准曲线的建立：[0111]对样品cdna进行6个梯度稀释(稀释倍数分别为a：1×、b：2×、c：4×、d：8×、e：16×、f：32×)，然后采用sybr greenⅰ嵌合荧光法(北京天根生物科技有限公司产品)进行实时荧光定量pcr：[0112]①荧光定量pcr反应体系20μl组成如下：[0113][0114]②荧光定量pcr反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec，40个循环。[0115]pcr过程完成后，按0.l℃/s的升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证，具体过程为：95℃进行15s，然后60℃进行1min，接着95℃进行30s，最后再在60℃进行15s。[0116]最终得到的标准扩增曲线如图5所示；其中，横坐标代表循环数，纵坐标代表第n次pcr循环时的荧光信号强度，图中平行且远离横坐标的直线代表荧光阈值，a、b、c、d、e、f字母代表样品cdna的6个稀释浓度。[0117]最终得到的标准曲线如图6所示；其中，横坐标代表标准样品cdna浓度的对数值，纵坐标代表循环阈值即ct值。[0118](4)实时荧光定量pcr反应过程：[0119]实时荧光定量pcr反应过程的体系及条件如上面步骤(3)所述。[0120]3.扩增产物检测[0121]本发明使用abi prism 7500实时荧光定量pcr仪进行检测。[0122]4.扩增结果分析[0123]abi prism 7500实时荧光定量pcr仪进行结果分析时，基线设置取3-15个循环的荧光信号。为便于比较，样品(供试二斑叶螨成螨cdna样品)、阴性对照(对阿维菌素敏感的二斑叶螨种群ipp-ss的cdna为阴性对照)及阳性对照(对阿维菌素产生抗性的二斑叶螨fs-gd种群的cdna为阳性对照)的所有扩增曲线的阈值均设定为0.249562(位于扩增曲线对数期中间位置，其它仪器基线和阈值设定可根据仪器作相应调整)。[0124]对上述步骤中荧光定量pcr反应产物进行荧光定量检测，如图7中所示，在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗敏样品间各自靶标基因abcc1与内参基因actin之间的ct值差值(即△ct值)判断结果，可知两样品产生了典型的“s”型扩增曲线，且敏感种群ipp-ss的样品的△ct值为5.859±0.161(sem)，抗性种群fs-gd的样品的△ct值为6.783±0.086(sem)，通过统计学分析，两者之间的表达量差异达到了极显著水平，由此，通过阿维菌素抗性和敏感样品间该基因的表达量差异可知，可以很明显的区分出两者，那么区分标准可初步设定为：△ct值≥6.5，则说明待测样品已对阿维菌素产生抗性；若△ct值＜6，则说明待测样品为敏感种群，尚未对阿维菌素产生抗性；若△ct值位于两者中间，则建议重做，待测样品对阿维菌素抗性产生与否视重做结果而定。[0125]实施例3[0126]通过其他4个阿维菌素抗性二斑叶螨种群nil-aba、wh-hb、cp-bj、sg-sd验证实施例1中的试剂盒及检测方法的可靠性，具体实验过程如实施例1所示。[0127]最终的荧光定量pcr反应检测结果如图8所示，其中，a:实施例1中对阿维菌素敏感的二斑叶螨种群ipp-ss的cdna阴性对照样品，b:实施例1中对阿维菌素产生抗性的二斑叶螨抗性种群fs-sd的cdna阳性对照样品；c：对阿维菌素产生抗性的二斑叶螨wh-hb种群的cdna待测样品；d：对阿维菌素产生抗性的近等基因系二斑叶螨nil-aba的cdna待测样品；e：对阿维菌素产生抗性的二斑叶螨sg-sd种群的cdna待测样品；f：对阿维菌素产生抗性的二斑叶螨cp-bj种群的cdna待测样品。在特定的波长条件下，根据荧光检测的抗性和敏感种群的样品间各自△ct值判断结果，可知wh-hb种群样品的△ct值为6.758±0.037(sem)；nil-aba样品的△ct值为7.109±0.041(sem)；sg-sd种群样品的△ct值为7.242±0.051(sem)；cp-bj种群样品的△ct值为8.563±0.017(sem)。[0128]通过分析，相对于ipp-ss阴性对照，基因表达量均达到了极显著水平，与阳性对照的fs-gd种群水平相当，由此可知，实施例1中设置的区分标准设定合理，通过该实时荧光定量pcr检测试剂盒，可以很明显的区分出阿维菌素抗性及敏感二斑叶螨种群。









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