经修饰的可溶性T细胞受体的制作方法 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术经修饰的可溶性t细胞受体技术领域1.本发明一般涉及工程化的嵌合可溶性t细胞受体及其组合物，以及治疗疾病的疗法。背景技术：2.t淋巴细胞通过对多种外来抗原的应答在适应性免疫中发挥核心作用，这些抗原在主要组织相容性分子(mhc)的背景中以肽的形式呈递。肽-mhc(pmhc)复合物的特异性识别是通过一种称为t细胞受体(tcr)的膜结合的多组分细胞表面糖蛋白实现的。天然tcr是免疫球蛋白超家族的异二聚体细胞表面蛋白，与参与介导信号转导的cd3复合物的不变蛋白缔合。tcr以αβ和γδ的形式存在，它们在结构上相似，但具有截然不同的结构性位置和可能的功能。特别是，αβ-tcr出现在超过95％的t淋巴细胞上，并由几乎无限的储库多样性组装，为人类抵御外源性和内源性疾病提供了关键保护。3.抗体和tcr是仅有的两种类型的以特异性方式识别抗原的分子，而tcr是mhc中呈递的特定肽抗原的唯一受体，其中外来肽通常是细胞内异常的唯一迹象。与抗体一样，人们也对开发可溶性的抗原特异性tcr及其衍生物作为候选药物以将治疗靶点扩展到细胞内表位产生了兴趣。此外，特异性tcr:pmhc相互作用可以作为强大的诊断工具来检测感染、疾病标志物和表达相应pmhc复合物的特定细胞。然而，与抗体不同的是，tcr在作为可溶性分子表达时通常非常不稳定，并且经常遇到低表达产率、聚集和错误折叠等问题。可能的解释可包括广泛的糖基化、不稳定的恒定结构域和低效的链配对。4.许多论文描述了利用铰链区中连接相应亚基的天然二硫键桥生产tcr异二聚体(garboczi等人,(1996),nature 384(6605):134-141；garboczi等人,(1996),pnas usa 91:11408-11412；davodeau等人,(1993),j.biol.chem.268(21):15455-15460；golden等人,(1997),j.imm.meth.206:163-169)。然而，尽管这种tcr可以被tcr特异性抗体识别，但没有一种显示能识别其天然配体，这表明存在错误折叠的互补决定区(cdr)。最近，在wo2004/074322中，描述了一种可溶性tcr，其被正确折叠从而能够识别其天然配体并在一段时间内稳定，并且可以以合理的量生产。该tcr包括与tcrβ链胞外结构域二聚化的tcrα链胞外结构域，两者由恒定结构域残基cαs48-cβt57之间的人工二硫键连接。基于这种可溶性tcr形式，开发了首创性的双特异性tcr药物tebentafusp，其对转移性黑色素瘤患者显示出益处。类似地，在us2018/021682中，还描述了恒定结构域残基(cαr53、p89、y10和cβs54、a19和e20)与恒定结构域/可变结构域残基(vα46、47(imgt编号)和cβ60、61)之间的另外几个人工二硫键。最近，karen等人描述了可溶性tcr的计算机辅助设计。使用rosetta计算和实验筛选，他们在cα和cβ中鉴定了7种突变，这些突变显著改善了全长tcr的组装和表达(karen等人，(2020),nat.comm.,11:2330)。特别是，这些基于用人工二硫键或突变修饰天然tcr而设计的可溶性tcr通常高度糖基化(尤其在恒定结构域中)，可能导致作为候选药物的性能不确定。为了避免这样的缺点，在某些情况下，这些可溶性tcr是在大肠杆菌中生产的并通过蛋白质再折叠过程组装，这导致了相对复杂的制备过程。5.tcr和抗体的可变(v)和恒定(c)结构域之间的高度序列同一性(30％至70％)表明，tcr折叠成β层三明治结构，其以类似于抗体fab片段的重(h)链和轻(l)链的方式配对。考虑到tcr和抗体fab的相似的总体结构和异二聚体缔合，已经尝试产生tcr-抗体嵌合蛋白作为获得可溶性tcr的替代方式。先前描述的嵌合tcr形式主要包括：a)将tcr的全部或部分直接融合于片段可结晶(fc)结构域以制备免疫球蛋白样组装体，以及b)将tcr v结构域融合于抗体fab c结构域，有或没有额外的稳定结构域(例如fc区、亮氨酸拉链)，以制备fab样组装体(jack等人,(1994),proc.natl.acad.sci.usa 91:12654-12658,mark等人,(1987),proc.natl.acad.sci.usa 84:2936-2940,greg等人,(1988)j.biol.chem.264(13):7310-7316,bernard等人,(1991),proc.natl.acad.sci.usa 88:8077-8081,jonathan等人,(1997)j.exp.med.186(8):1333-1345,jonathan等人,(1999)cell.immunol.192:175-184,au729,406,us6,911,204)。然而，尽管在少数情况下这些嵌合蛋白具有正确功能，但极低的表达水平(30ng/ml至1μg/ml)阻碍了其作为治疗蛋白的进一步应用。事实上，对tcr和抗体结构的仔细检查揭示了许多差异，为之前tcr-抗体嵌合物的简单融合的不满意结果提供了解释。因为cβ结构域中的环的突出(这似乎是所有β链的普遍特征)，tcr在中间比fab宽(相比于)。tcr也比fab更不对称和粗矮，这是因为β层进入cα/cβ界面的交叉角更平行，并且在与cα/cβ相关的假2倍位置上大约偏离中心与cβ相比cα结构域的尺寸更小加剧了这种不对称性。因此，不是简单地融合野生型tcr和抗体，而是需要基于结构特征的综合设计来增强相容性，从而产生稳定和功能性的嵌合体。6.鉴于可溶性tcr的重要性，期望提供一种生产具有天然功能和极大可开发性的此类分子的备选方法。在本发明中，在真核表达系统中稳定地、可溶性和功能性地产生tcr(etcr)和tcr衍生物(双特异性etcr)。此外，使用双特异性tcr观察到强烈的体外抗肿瘤活性。技术实现要素：7.在一个方面，本公开提供了一种多肽复合物，所述多肽复合物包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽从n末端到c末端包含可操作地连接到第一抗体恒定结构域(c1)的第一tcr的第一tcrα链可变结构域，所述第二多肽从n末端到c末端包含可操作地连接到第二抗体恒定结构域(c2)的第一tcr的第一tcrβ链可变结构域，其中c1和c2能够通过其天然链间键和相互作用形成二聚体。在某些实施方案中，第一tcr具有第一抗原特异性。8.在某些实施方案中，c1和c2包含选自下组的抗体重链(ch1结构域)：igg1(imgt登录号j00228、z17370、al122127、mg920252、mg92025、mg920246、mg920247、mg920248、mg920249、mg920250、mg920251、mg920253)、igg2(imgt登录号j00230、aj250170、af449616、af449618、af928742、mh025828、mh025829、mh025830、mh025832、mh025833、mh025834、mh025835、mh025836)、igg3(imgt登录号x03604、k01313、x16110、x99549、aj390236、aj390237、aj390238、aj390241、aj390242、al122127、aj390247、aj390252、aj390254、aj390260、aj390262、aj390272、aj390276、mg920256、mg920255、mg920254、mh025837、mg920257、mg920258、mg920259、mg920260、mg786813、mg920261)、igg4(imgt登录号k01316、al928742)、igm(imgt登录号x14940、k01307、x57331、ac254827)、iga1(imgt登录号j00220、imgt000035)、iga2(imgt登录号j00221、m60192、s71043)、igd(imgt登录号k02875、x57331)和ige(imgt登录号j00222、l00022、imgt000025、al928742)，或选自下组的轻链恒定结构域(cλ结构域或cκ结构域)：cλ1(imgt登录号j00252、x51755)、cλ2(imgt登录号j00253、x06875、aj491317)、cλ3(imgt登录号j00254、k01326、x06876、d87017)、cλ6(imgt登录号j03011)、cλ7(imgt登录号x51755、m61771、x51755、m61771、km455557)、cκ1(imgt登录号j00241)、cκ2(imgt登录号m11736)、cκ3(imgt登录号m11737)、cκ4(imgt登录号af017732)和cκ5(imgt登录号af113887)。9.在某些实施方案中，c1包含工程化的ch1结构域，其选自igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igd和ige的ch1结构域；并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化的λ或κ轻链恒定结构域(cλ结构域或cκ结构域)，cλ结构区选自cλ1、cλ2、cλ3、cλ6和cλ7。10.在某些实施方案中，c1包含来自人免疫球蛋白的工程化λ或κ轻链恒定结构域(cλ结构域或cκ结构域)，cλ结构区选自cλ1、cλ2、cλ3、cλ6和cλ7，并且c2包含工程化ch1结构域，其选自igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igd和ige。11.在某些实施方案中，a)c1包含来自人免疫球蛋白g1(igg1)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ1结构域；b)c1包含来自人免疫球蛋白g2(igg2)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ1结构域；c)c1包含来自人免疫球蛋白g3(igg3)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ1结构域；d)c1包含来自人免疫球蛋白g4(igg4)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ1结构域；e)c1包含来自人免疫球蛋白g1(igg1)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ2结构域；f)c1包含来自人免疫球蛋白g2(igg2)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ2结构域；g)c1包含来自人免疫球蛋白g3(igg3)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ2结构域；h)c1包含来自人免疫球蛋白g4(igg4)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ2结构域；i)c1包含来自人免疫球蛋白g1(igg1)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ3结构域；j)c1包含来自人免疫球蛋白g2(igg2)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ3结构域；k)c1包含来自人免疫球蛋白g3(igg3)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ3结构域；l)c1包含来自人免疫球蛋白g4(igg4)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ3结构域；m)c1包含来自人免疫球蛋白g1(igg1)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ6结构域；n)c1包含来自人免疫球蛋白g2(igg2)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ6结构域；o)c1包含来自人免疫球蛋白g3(igg3)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ6结构域；p)c1包含来自人免疫球蛋白g4(igg4)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ6结构域；q)c1包含来自人免疫球蛋白g1(igg1)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ7结构域；r)c1包含来自人免疫球蛋白g2(igg2)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ7结构域；s)c1包含来自人免疫球蛋白g3(igg3)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ7结构域；t)c1包含来自人免疫球蛋白g4(igg4)的工程化ch1结构域，并且c2包含来自人免疫球蛋白的工程化cλ7结构域。12.在某些实施方案中，c1包含来自seq id no:11、13、15和17中任何一个的工程化ch1，和/或c2包含来自seq id no:1、3、5、7和9中任何一个的工程化cλ。13.在某些实施方案中，第一vα通过第一连接结构域可操作地连接到c1，并且第一vβ通过第二连接结构域可操作地连接到c2。14.在某些实施方案中，c1包括工程化的ch1，c2包括工程化的cλ；并且其中所述第一连接结构域包含seq id no:19、21和23中的任一个，和/或所述第二连接结构域包括seq id no:25、27、29、31、33和35中的任一个，优选地，所述第二连接结构域包含edlxnvxp，其中x是任何氨基酸。15.在某些实施方案中，tcr vβ包括在框架区中选自10、13、19、24、48、54、77、90、91、123和125(imgt编号)的一个或多个位置处的突变，优选地，tcr vβ包括在位置13处的至少一个突变，或包括在位置90和91处的至少两个突变。16.在某些实施方案中，cλ或ch1包括在选自30、31和33的一个或多个位置处的突变。17.在另一个方面，本公开提供了一种多特异性抗原结合复合物，其包括包含上述多肽复合物的第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中第一抗原结合部分具有第一抗原特异性。18.在某些实施方案中，第二抗原结合部分结合第一抗原上的不同表位，或具有优选不同于第一抗原特异性的第二抗原特异性，所述第二抗原结合部分缀合于第一抗原结合部分的第一多肽或第一抗原结合部分的第二多肽的n末端或c末端。19.在某些实施方案中，第一抗原特异性和第二抗原特异性针对两种不同的抗原或针对一种抗原上的两种不同表位。20.在某些实施方案中，所述多特异性抗原结合复合物包含第一抗原结合部分和第二抗原结合部分，其中所述第一抗原结合部分包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽从n末端到c末端包含可操作地连接到第一抗体恒定结构域(c1)的第一tcr的第一tcrα链可变结构域，所述第二多肽从n末端到c末端包含可操作地连接到第二抗体恒定结构域(c2)的第一tcr的第一tcrβ链可变结构域，其中c1和c2能够通过其天然链间键和相互作用形成二聚体。第一tcr具有第一抗原特异性。21.在某些实施方案中，第二抗原结合部分对第一抗原上的不同表位具有特异性。22.在某些实施方案中，第二抗原结合部分具有不同于第一抗原特异性的第二抗原特异性，其缀合在第一抗原结合部分的第一多肽或第一抗原结合部分的第二多肽的n末端或c末端。23.在某些实施方案中，第一抗原特异性和第二抗原特异性之一针对t细胞特异性受体分子和/或自然杀伤细胞(nk细胞)特异性受体分子，而另一种针对肿瘤相关抗原和/或肿瘤新抗原。24.在某些实施方案中，第一抗原结合部分包含tcr vα和tcr vβ，vα包含选自seq id no：37、41和45的氨基酸序列，vβ包含选自seq id no：39、43和47的氨基酸序列；优选地，第二抗原结合部分包含选自seq id no:49的scfv。25.在某些实施方案中，第一抗原结合部分结合hla*a*02:01-ny-eso-1肽(sllmwitqc)(seq id no：37-40，45-48)，第二抗原结合部分结合分化簇3(cd3)(seq id no：49-50)。26.在某些实施方案中，第一抗原结合部分结合hla*a*02:01-gp100肽(ylepgpvtv)(seq id no：41-44)，第二抗原结合部分结合cd3(seq idno：49-50)。27.在某些实施方案中，第二抗原结合部分包含单链可变片段(scfv)，其包含通过柔性接头共价缀合的重链可变结构域和轻链可变结构域。28.在另一个方面，本公开在本文中提供了分离的多核苷酸，其编码本文提供的多肽复合物或本文提供的多特异性抗原结合复合物。29.在一个方面，本公开提供了一种分离的载体，其包含本文提供的多核苷酸。30.在一个方面，本公开提供了包含本文提供的分离的多核苷酸或本文提供的分离的载体的宿主细胞。31.在一个方面，本公开提供了包含本文提供的多肽复合物或多特异性抗原结合复合物的缀合物。32.在一个方面，本公开在本文中提供了表达本文提供的多肽复合物或本文提供的多特异性抗原结合复合物的方法，其包括在表达所述多肽复合物或多特异性抗体结合复合物的条件下培养本文提供的宿主细胞。33.在一个方面，本公开提供了一种生产本文提供的多肽复合物的方法，包括：a)将编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸引入宿主细胞，所述第一多肽从n末端到c末端包含可操作地连接到第一抗体恒定结构域(c1)的第一tcr的第一tcrα链可变结构域，所述第二多肽从n末端到c末端包含可操作地连接到第二抗体恒定结构域(c2)的第一tcr的第一tcrβ链可变结构域，其中c1和c2能够通过其天然链间键和相互作用形成二聚体，第一tcr具有第一抗原特异性；b)允许宿主细胞表达所述多肽复合物。34.在一个方面，本公开提供了一种生产本文提供的多特异性抗原结合复合物的方法，其包括：a)将编码第一多肽的第一多核苷酸和编码第二多肽的第二多核苷酸引入宿主细胞，所述第一多肽从n末端到c末端包括可操作地连接到第一抗体恒定结构域(c1)的第一tcr的第一tcrα链可变结构域，所述第二多肽从n末端到c末端包含可操作地连接到第二抗体恒定结构域(c2)的第一tcr的第一tcrβ链可变结构域，其中c1和c2能够通过其天然链间键和相互作用形成二聚体。第一tcr具有第一抗原特异性。第二抗原结合部分具有不同于第一抗原特异性的第二抗原特异性，其缀合在第一抗原结合部分的第一多肽或第二多肽的n末端或c末端。b)允许宿主细胞表达所述多特异性抗原结合复合物。35.在某些实施方案中，本文提供的生产多特异性抗原结合复合物的方法进一步包括分离多肽复合物。36.在一个方面，本公开提供了包含本文提供的多肽复合物或本文提供的多特异性抗原结合复合物的组合物。37.在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文提供的多肽复合物或本文提供的多特异性抗原结合复合物和药学上可接受的载剂。38.在一个方面，本公开在本文中提供了治疗有需要的受试者中的病况或疾病(例如癌症)的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的多肽复合物或本文提供的多特异性抗原结合复合物。在某些实施方案中，当第一抗原和第二抗原都被调节时，可以减轻、消除、治疗或预防所述病况。39.在另一个方面，本公开提供了包含本文提供的多肽复合物的试剂盒，用于检测、诊断、预后或治疗疾病或病况。附图说明40.图1显示实施例1的步骤1中，抗体恒定区中截短及突变的氨基酸位置的示意图。41.图2显示实施例1的步骤2中，筛选获得的可噬菌体展示的嵌合tcr中间体的展示及结合活性测定结果。42.图3显示实施例1的步骤2中，筛选获得的嵌合tcr中间体与dstcr和sctcr的亲和力比较的结果。43.图4显示实施例1的步骤3中，vtcr与c igg1、igg4、iga1及vtcr与cκ，λ之间接头加入位置的示意图。44.图5显示实施例1的步骤4中嵌合tcr噬菌体接头的比较结果。45.图6显示实施例1步骤5中，1g4亲和力成熟过程中克隆的噬菌体的噬菌体展示及结合活性测定的结果。46.图7a显示了代表性的ctcr的模型结构，人工二硫键表示为球形。图7b显示了代表性的etcr的模型结构。有助于稳定ctcr中的vβ的长fg环在etcr中不存在，导致不太稳定的β链结构。47.图8a显示了ctcr的连接结构域结构，黑色箭头表示从结构分析的连接结构域的末端，红色短划线箭头表示连接结构域和fg环之间形成的潜在的极性接触。图8b显示了etcr的连接结构域结构(ssas)，黑色箭头表示从ctcr和etcr的叠加分析的连接结构域的末端。48.图9显示了代表性的ctcr的模型结构，可变结构域和恒定结构域结合界面中涉及的残基显示为被灰色网格覆盖的棒。49.图10a显示了代表性的ctcr的vβ-cβ结合界面的详细结构，参与结合的残基显示为棒状，红色箭头和黄色虚线表示极性接触，橙色圆圈表示非极性接触。图10b显示了代表性的etcr的vβ-cλ结合界面的详细结构，参与结合的残基显示为棒状，红色箭头表示没有极性接触。50.图11a显示了代表性的etcr的sds-page结果。图11b显示了代表性的etcr的kd elisa结果。51.图12a显示了etcr1(青色)和etcr2(洋红色)的叠加结果，fr1中的残基显示为棒状。图12b显示了代表性的etcr2突变体的sds-page结果。52.图13a-e显示了代表性的etcr和ctcr的spr分析的传感图。53.图14显示了代表性的etcr1和ctcr1的facs结果。54.图15显示了所研究的双特异性etcr的示意图。扩增抗cd3 scfv的基因产物，并将其分别插入tcr vβ结构域的n末端、抗体cλ结构域的c末端、tcr vα结构域的n末端和抗体ch1结构域的c末端，产生双特异性etcr1-e1.1、etcr1-e1.2、etcr1-e1.3和etcr1-e1.4(图15a-d)。对于ctcr，扩增抗cd3 scfv的基因产物并将其插入tcr vβ结构域的n末端，产生ctcr1-e1.1(图15e)。55.图16显示了etcr1双特异性蛋白的sds-page结果，泳道1-4：etcr1双特异性蛋白的上清液，泳道5-8，相应的纯化etcr1双特异性蛋白。56.图17a显示了在18小时时将t细胞杀伤重定向于t2细胞的剂量依赖性结果。图17b显示了在24小时时将t细胞杀伤重定向于t2细胞的剂量依赖性结果。57.图18显示了在72小时时将t细胞杀伤重定向于a375细胞的剂量依赖性结果。58.图19显示了etcr的形式。59.发明详述60.尽管以下详细描述了本发明，但应理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些方法、方案或试剂可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。61.本文中使用的术语“分离的”是指通过人工手段从天然状态中获得的状态。某种“分离的”的物质或成分可能存在于自然界中，可能因为其自然环境发生了变化，或者该物质与自然环境分离，或者两者兼而有之，而被分离。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某种活动物体内，从这种天然状态中分离出的具有高纯度的相同多核苷酸或肽称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”不排除混合的人工或合成物质，也不排除不影响分离物质活性的其他不纯物质。62.本文中使用的术语“载体”是指可以插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质表达时，该载体被称为表达载体。载体可以通过转化、转导或转染到宿主细胞中而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于质粒、噬菌体、粘粒、人工染色体如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac)、噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(如sv40)。载体可以包含用于控制表达的多种元件，包括但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。此外，载体可以包括复制起点。63.本文使用的术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生感兴趣的蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于培养细胞，例如来源于啮齿类动物(大鼠、小鼠、豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如cho、bhk、nso、sp2/0、yb2/0；或人类组织或杂交瘤细胞、酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养的组织内的细胞。该术语不仅包括特定的受试细胞，还包括这种细胞的后代。由于突变或环境影响，后续代中可能会发生某些修饰，因此这类后代可能与亲本细胞不相同，但仍包含在“宿主细胞”一词的范围内。64.本文中使用的术语“spr”或“表面等离子体共振”是指并包括一种光学现象，该现象允许通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时生物特异性相互作用，例如使用biacore系统(pharmacia biosensor ab,uppsala,sweden and piscataway,n.j.)。关于进一步的描述，参见实施例5和u.等人(1993)ann.biol.clin.51:19-26；u.等人(1991)biotechniques 11:620-627；johnsson,b.等人(1995)j.mol.recognit.8:125-131；and johnnson,b.等人(1991)anal.biochem.198:268-277。65.本文使用的术语“癌症”是指肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体肿瘤和非实体肿瘤(如白血病)中的任何一种，并引发医学病况。66.本文中在治疗病况的背景中使用的术语“治疗”、“处理”或“经治疗的”通常涉及治疗和疗法，无论是对人还是动物，其中实现了一些期望的治疗效果例如抑制病况的进展，并包括进展速度的降低、进展速度的停止、病况的消退、病况的改善和病况的治愈。作为预防措施的治疗(即防护、预防)也包括在内。对于癌症，“治疗”可能指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞的生长、增殖或转移，或其一些组合。对于肿瘤，“治疗”包括切除全部或部分肿瘤，抑制或减缓肿瘤生长和转移，预防或延缓肿瘤的发展，或其一些组合。67.本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”涉及活性化合物的量，或包含活性化合物的材料、组合物或剂量，当根据所需治疗方案给药时，该活性化合物有效地产生与合理的收益/风险比相称的一些所需治疗效果。例如，当用于治疗靶抗原相关疾病或病况时，“有效量”是指有效治疗所述疾病或病况的抗体或其抗原结合部分的量或浓度。68.本文使用的术语“药学上可接受的”是指媒介物、稀释剂、赋形剂和/或其盐与制剂中的其他成分在化学和/或物理上相容，并且在生理上与接受体相容。69.本文使用的术语“药学上可接受的载剂和/或赋形剂”是指与受试者和活性剂在药理学和/或生理学上相容的载剂和/或赋形剂，其在本领域是众所周知的(参见，例如remington's pharmaceutical sciences.edited by gennaro ar,19th ed.pennsylvania:mack publishing company,1995)，并且包括但不限于ph调节剂、表面活性剂、佐剂和离子强度增强剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如吐温-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。70.如本文所用，术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”可交换使用。71.除非另有说明，否则以下实施例中的实验方法均为常规方法。实施例72.实施例1.tcr可变结构域的基因与抗体恒定区的基因连接并进一步与噬菌体的giii基因组装，用于筛选出可在噬菌体表面展示的tcr异二聚体。73.步骤1.将两个不同的tcr ctcr1和ctcr2的v结构域的基因与抗体恒定区的基因连接。74.抗体的重链恒定区包括igg1、igg2、igg4、igm、iga1、iga2、igd、ige的ch1结构域，轻链恒定区包括抗体的cκ、cλ。具体地，设计、测试了抗体恒定结构域中的两个另外突变并与野生型进行比较，1).链间二硫键突变：半胱氨酸到丝氨酸(如果抗体恒定区中的链间二硫键位置的c突变为s，那么恒定区ch1将标记为κg1s、κg1s-reverse)；2).n糖基化突变：天冬酰胺到谷氨酰胺。截短及突变位置如图1所示。连接产生了vtcrcigg1,igg2,igg4,iga1,iga2,igm,igd,ige及vtcrcκ，λ基因产物(vtcr包括vα和vβ)。将这些基因产物插入到噬菌粒载体pcom3xx-dt中，其中vtcrcigg1,igg2,igg4,iga1,iga2,igm,igd,igevtcrcκ，λ缀合于表达c-myc.6his标签的giii基因，并且vtcrcκ，λ表达flag标签。由于噬菌体可自我装配，两条表达的多肽自发组合，并在噬菌体上展示为功能性异二聚体。相应的ctcr也插入到同样的噬菌粒载体中，其中vβcβ缀合于表达c-myc.6his标签的giii基因，并且vαcα表达flag标签。相应的单链tcr组装为vα-(g4s)-vβ并插入到噬菌粒载体pfl249中，与表达6his.c-myc标签的giii基因融合。75.步骤2.噬菌体培养条件的优化。76.为了筛选展示不同tcr异二聚体形式的噬菌体，将克隆接种到600μl2yt培养基(10g/l酵母提取物，16g/l胰蛋白酶，5g/ml含有0.1mg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖，ph 7.0)中。使培养物在37℃摇动下生长至od600＝0.3至0.5，并添加7.5e9 pfu的辅助噬菌体m13k07(invitrogen)，并进一步在37℃培养箱中孵育45分钟。通过以4,000g离心10分钟沉淀细胞，重悬于600μl含0.1mg/ml氨苄青霉素和0.05mg/ml卡那霉素、5mm mgso4的2yt培养基中，并在25℃摇动下培养36小时。通过离心可以获得展示有tcr异二聚体的噬菌体上清液。77.步骤3.噬菌体elisa对tcr异二聚体的噬菌体展示及结合活性进行检测。78.通过夹心elisa法对噬菌体上tcr异二聚体的展示水平进行检测。在elisa板上包被抗flag(2μg/ml)以捕获etcr或者ctcr异二聚体的噬菌体，并用抗c-myc(1μg/ml)包被以捕获sctcr。用封闭液(3％ bsa)封闭板1个小时。加入1:1稀释的噬菌体上清，并在室温(20-25℃)孵育2小时。用1xpbst洗6次之后，用抗噬菌体m13碱性磷酸酶偶联的抗体检测tcr在噬菌体表面的展示水平。通过直接elisa方法检测噬菌体上tcr异二聚体的结合性能。将elisa板用4μg/ml的sa过夜包被，并用封闭液(3％ bsa)封闭1小时。加入2μg/ml的生物素化的pmhci单体，在室温孵育1小时。用1xpbst清洗6次后，加入1:1稀释的噬菌体上清并在室温孵育1小时，然后用抗噬菌体m13碱性磷酸酶偶联的抗体检测tcr展示噬菌体的结合活性。最终，筛选了64种etcr形式并获得6种最佳形式：λg1，λg1s，κg1s，λg1s-reverse，λg4s-reverse，λa1s-reverse，这些形式表现出更好的展示水平和结合性能，如图2所示。79.图2a和图2b分别显示tcr1和tcr2在不同的tcr形式中的展示水平。对于每种展示的tcr，随机选择了4个克隆用于测试。结果表明所有etcr、ctcr和sctcr都能较好地被噬菌体展示出来。80.图2c和图2d分别显示tcr1和tcr2在不同的tcr形式中的结合性能。对于不同的tcr形式观察到与特异性pmhci有不同程度的结合，没有观察到与pmhci的非特异性结合。81.进一步测定了最佳etcr形式的展示水平和结合活性，并通过噬菌体相对定量elisa与ctcr和sctcr进行了比较。起始孔中的噬菌体数量为5e10pfu，1:3进行稀释。结果显示最佳etcr形式的展示水平好于sctcr以及dstcr。而且，如图3所示，我们的tcrλg4s-reverse形式的结合亲和力比dstcr的好2～6倍。为了进一步优化etcr形式，随后设计了接头结构域。82.步骤4.嵌合tcr结构的接头优化。83.为了提升etcr的展示水平和结合活性，截短了tcr vα或者vβ的fr4部分，然后直接与抗体的恒定结构域连接。结果显示tcr的稳定性受到影响，并且结合活性降低。84.另一方面，将不同长度的接头，包括ss、ssa、ssas、ssass、ssasss，插入etcr可变结构域的c末端与抗体恒定结构域的n末端之间，具体位置如图4所示。随机选择4个克隆进行噬菌体展示水平以及结合活性的检测。在所有接头中，ssas接头显示出比其他接头更优越的性能(图5)。因此，选取λg4s-reverse-ssas作为用于tcr亲和力成熟的最终etcr形式。85.步骤5.tcr亲和力成熟库的构建及筛选。86.选取了天然tcr 1g4进行亲和力成熟作为概念验证研究。合成了1g4的vα及vβ基因并克隆到包含λg4s-reverse-ssas etcr骨架的噬菌粒载体中，产生1g4 etcr(用于亲和力成熟的模板，野生型，wt)。天然tcr的亲和力很低，以至于使用elisa检测不到结合信号。随后，我们对1g4 etcr的cdr2及cdr3根据文献进行定向突变，如图6所示，检测到结合信号，这证明使用etcr异二聚体形式进行tcr亲和力成熟是可行的。87.实施例2：将tcr可变结构域与抗体恒定结构域重排用于产生tcr-抗体嵌合蛋白(etcr)88.1.tcr序列89.选择一种hla*a*02:01ny-eso-1(sllmwitqc)特异性tcr，在cαs48-cβt57之间具有非天然二硫键，命名为ctcr1(seq id no:37-40和63-66，vα的氨基酸序列如seq id no:37所示，vβ的氨基酸序列如seq id no:39所示，cα的氨基酸序列如seq id no:63所示，cβ的氨基酸序列如seq id no:65所示)，和一种hla*a*02:01gp100(ylepgpvtv)特异性tcr，在cαs48-cβt57之间具有非天然二硫键，命名为ctcr2(seq id no:41-44和63-66，vα的氨基酸序列如seq id no:41所示，vβ的氨基酸序列如seq id no:43所示，cα的氨基酸序列如seq id no:63所示，cβ的氨基酸序列如seq id no:65所示)，进行概念验证研究。对于所有tcr可变结构域使用imgt编号规则。90.另一种hla*a*02:01ny-eso-1(sllmwitqc)特异性tcr，在cαs48-cβt57之间具有非天然二硫键，命名为ctcr3(seq id no:45-48和63-66，vα的氨基酸序列如seq id no:45所示，vβ的氨基酸序列如seq idno:47所示，cα的氨基酸序列如seq id no:63所示，cβ的氨基酸序列如seq id no:65所示)，也被选中进行进一步的研究。对于所有tcr可变结构域使用imgt编号规则。91.seq id no:37,cab1-ny-eso-1_vαaa:92.aqsvaqpedqvnvaegnpltvkctysvsgnpylfwyvqypnrglqfllkylgdsalvkgsygfeaefnksqtsfhlkkpsalvsdsalyfcavrdirsgagsyqltfgkgtklsvip93.seq id no:38,cab1-ny-eso-1_vαdna:94.gcccagtccgtggctcagcccgaggaccaagtgaacgtggccgagggcaaccctctgaccgtgaagtgcacctattccgtgagcggcaacccctatctgttttggtacgtgcagtaccccaacagaggactgcagtttctgctgaagtatctgggagacagcgctctggtgaagggaagctacggcttcgaagccgagttcaacaagagccagacctccttccatctgaagaagcctagcgctctggtgagcgactccgctctgtacttctgcgccgtcagagacatcagaagcggcgccggaagctaccagctgaccttcggcaagggcaccaagctgagcgtgatccct95.seq id no:39,cab1-ny-eso-1_vβaa:96.savisqkpsrdikqrgtsltiqcqvdkrlalmfwyrqqpgqsptliatawtggeatyesgfvidkfpisrpnltfstltvsnmspedssiylcsvggsgaadtqyfgpgtrltvl97.seq id no:40,cab1-ny-eso-1_vβdna:98.agcgccgtgatcagccagaagcctagcagagacatcaaacagaggggcacatctctgaccatccagtgccaagtggacaagagactcgctctgatgttctggtatagacagcagcccggacagtcccccacactgatcgccaccgcttggaccggcggagaagccacctacgagtccggcttcgtgatcgacaagttccccatctctagacccaatctgaccttttccacactgaccgtgtccaacatgagccccgaggactccagcatttatctgtgtagcgtgggaggcagcggagctgccgatacccagtacttcggccccggaaccagactgaccgtgctg99.seq id 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no:47,cab3-ny-eso-1_vβaa:112.gvtqtpkfqvlktgqsmtlqcaqdmnheymswyrqdpgmglrlihysvaiqttdrgevpngynvsrstiedfplrllsaapsqtsvyfcassylgntgelffgegsrltvl113.seq id no:48,cab3-ny-eso-1_vβdna:114.ggagttacacagacccctaagttccaggtgctgaaaaccggccagagcatgaccctgcagtgcgcccaggatatgaaccacgagtacatgagctggtacaggcaggatccaggcatgggcctgagactgatccactactctgtggccatccagaccaccgacagaggcgaagtgcccaacggctacaacgtgtccagatccaccatcgaggacttcccactgagactgctgtctgctgcccctagccagacctccgtgtacttttgtgccagcagctacctgggcaacaccggcgagctgttttttggcgagggctccagactgaccgtgctg115.seq id no:49,抗cd3-scfv aa:116.aiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdirnylnwyqqkpgkapklliyytsrlesgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyycqqgntlpwtfgqgtkveikggggsggggsggggsggggsgggsevqlvesggglvqpggslrlscaasgysftgytmnwvrqapgkglewvalinpykgvstynqkfkdrftisvdkskntaylqmnslraedtavyycarsgyygdsdwyfdvwgqgtlvtvss117.seq id no:50,抗cd3-scfv dna:118.gccatccagatgacgcaaagtccatcaagtctgagcgccagcgtgggcgacagagtgaccatcacctgcagagccagccaggacatcagaaattacctgaattggtaccagcagaagcctggcaaggctccaaagctcctcatatattatacatcgagattagaatctggtgttccaagcagattcagcggcagcggcagcggcaccgactacaccctgaccatcagcagcctgcagcctgaggacttcgccacctactactgccagcagggcaataccctgccttggacatttggacagggtaccaaggtggaaattaaaggcggcggcggaagcggaggcggagggtcgggtggcggaggttcaggtggaggagggtctggtggaggctcagaggtacaacttgtggagtcaggcggtggactagtccaaccaggaggatctttacgcttatcttgtgccgccagcggctacagcttcaccggctacaccatgaattgggtgagacaggctcccggtaagggcctggagtgggtggccctgatcaatccttacaagggcgtgagcacctacaatcagaagttcaaggacagattcaccatcagcgtggacaagagcaagaataccgcctacctgcagatgaatagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaagcggctactacggcgacagcgactggtactttgatgtttgggggcaaggtacacttgtcactgtaagctcc119.seq id no:51,cab1-ny-eso-1_αfl aa:120.aqsvaqpedqvnvaegnpltvkctysvsgnpylfwyvqypnrglqfllkylgdsalvkgsygfeaefnksqtsfhlkkpsalvsdsalyfcavrdirsgagsyqltfgkgtklsvipniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdkcvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedt121.seq id no:52,cab1-ny-eso-1_αfl dna:122.gcccagtccgtggctcagcccgaggaccaagtgaacgtggccgagggcaaccctctgaccgtgaagtgcacctattccgtgagcggcaacccctatctgttttggtacgtgcagtaccccaacagaggactgcagtttctgctgaagtatctgggagacagcgctctggtgaagggaagctacggcttcgaagccgagttcaacaagagccagacctccttccatctgaagaagcctagcgctctggtgagcgactccgctctgtacttctgcgccgtcagagacatcagaagcggcgccggaagctaccagctgaccttcggcaagggcaccaagctgagcgtgatccctaacatccagaaccccgatcccgccgtgtaccagctgagggacagcaagtccagcgacaagtccgtgtgtctgttcaccgacttcgactcccagaccaacgtgtcccagagcaaggatagcgacgtgtacatcaccgacaagtgcgtcctcgacatgaggtccatggacttcaagagcaacagcgccgtggcttggagcaacaagagcgacttcgcttgcgccaacgccttcaacaacagcatcatccccgaggacacc123.seq id no:53,cab1-ny-eso-1_βfl 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no:56,cab2-gp100_αfl dna:130.gctcagcaaggcgaagaggatccccaagctctgagcattcaagagggcgagaacgccaccatgaactgctcctacaagaccagcatcaacaacctccagtggtatagacagaacagcggcagaggactggtgcatctgattctgattagaagcaacgagagagagaagcactccggaaggctgagggtgacactggatacaagcaagaagagcagctctctgctgatcaccgcttccagagccgctgacaccgccagctacttctgcgccaccgacggcagcacccctatgcagttcggcaagggcacaagactcagcgtgatcgccaacatccagaagcccgaccccgccgtgtaccagctgagagactccaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgactcccagaccaacgtgagccagtccaaggacagcgacgtgtacatcaccgacaagtgcgtgctggacatgaggagcatggacttcaagtccaacagcgccgtggcttggtccaacaaatccgatttcgcttgcgccaatgccttcaacaactccatcatccccgaggacaca131.seq id no:57,cab2-gp100_βfl aa:132.dggitqspkylfrkegqnvtlsceqnlnhdamywyrqdpgqglrliyyswaqgdfqkgdiaegysvsrekkesfpltvtsaqknptafylcasswgapyeqyfgpgtrltvtedlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvctdpqplkeqpalndsryalssrlrvsatfwqdprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgrad133.seq id no:58,cab2-gp100_βfl 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no:60,cab3-ny-eso-1_vαdna:138.caagaagtgacacagatccctgccgctctgtctgtgcctgagggcgaaaacctggtgctgaactgcagcttcaccgacagcgccatctacaacctgcagtggttcagacaggaccccggcaagggactgacaagcctgctgctgattaccccttggcagagagagcagaccagcggcagactgaatgccagcctggataagtcctccggcagaagcaccctgtatatcgccgcttctcagcctggcgatagcgccacatatctgtgtgccgtcagacccctgctggacggcacatatatccccacctttggcagaggcaccagcctgatcgtgcaccct139.seq id no:61,cab3-ny-eso-1_vβaa:140.gvtqtpkfqvlktgqsmtlqcaqdmnheymswyrqdpgmglrlihysvaiqttdrgevpngynvsrstiedfplrllsaapsqtsvyfcassylgntgelffgegsrltvl141.seq id no:62,cab3-ny-eso-1_vβdna:142.ggagttacacagacccctaagttccaggtgctgaaaaccggccagagcatgaccctgcagtgcgcccaggatatgaaccacgagtacatgagctggtacaggcaggatccaggcatgggcctgagactgatccactactctgtggccatccagaccaccgacagaggcgaagtgcccaacggctacaacgtgtccagatccaccatcgaggacttcccactgagactgctgtctgctgcccctagccagacctccgtgtacttttgtgccagcagctacctgggcaacaccggcgagctgttttttggcgagggctccagactgaccgtgctg143.seq id no:63,cαaa:144.niqkpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdkcvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedt145.seq id no:64,cαdna:146.aacatccagaagcccgaccccgccgtgtaccagctgagagactccaagagcagcgacaagagcgtgtgtctgttcaccgacttcgactcccagaccaacgtgagccagtccaaggacagcgacgtgtacatcaccgacaagtgcgtgctggacatgaggagcatggacttcaagtccaacagcgccgtggcttggtccaacaaatccgatttcgcttgcgccaatgccttcaacaactccatcatccccgaggacaca147.seq id no:65,cβaa:148.edlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvctdpqplkeqpalndsryalssrlrvsatfwqdprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgrad149.seq id no:66,cβdna:150.gaggatctgaagaacgtcttccctcccgaggtggctgtgttcgagccctccgaggccgagatctcccacacccagaaggccaccctcgtgtgtctggctaccggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaacggcaaagaggtgcatagcggcgtgtgtaccgacccccagcctctgaaagagcaacccgctctgaacgactccagatacgctctgtcctccagactgagggtctccgccacattttggcaagaccctagaaaccactttagatgtcaagtgcagttctacggactgagcgagaatgatgagtggacacaagacagagccaagcccgtgacacagattgtcagcgccgaggcttggggaagagctgat151.2.产生tcr-抗体嵌合蛋白(etcr)152.ctcr1和ctcr2的恒定结构域cα和cβ被iga、igd、ige、igg和igm抗体的恒定结构域ch1和cλ/cκ替换，并且与或不与fc结构域融合，从而产生数十种etcr供进一步分析。153.seq id no:1，工程化的cλ1aa:154.ptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs155.seq id no:2，工程化的cλ1dna:156.cccacggtcactctgttcccgccctcctctgaggagctccaagccaacaaggccacactagtgtgtctgatcagtgacttctacccgggagctgtgacagtggcttggaaggcagatggcagccccgtcaaggcgggagtggagacgaccaaaccctccaaacagagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcccgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca157.seq id no:3，工程化的cλ2aa:158.ptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs159.seq id no:4，工程化的cλ2dna:160.ccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcttggaaagcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca161.seq id no:5，工程化的cλ3aa:162.psvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshksyscqvthegstvektvaptecs163.seq id no:6，工程化的cλ3dna:164.ccctcggtcactctgttcccaccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagttgcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggggtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacaaaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagttgcccctacggaatgttca165.seq id no:7，工程化的cλ6aa:166.psvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavkvawkadgspvntgvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvapaecs167.seq id no:8，工程化的cλ6dna:168.ccatcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgcctgatcagtgacttctacccgggagctgtgaaagtggcctggaaggcagatggcagccccgtcaacacgggagtggagaccaccacaccctccaaacagagcaacaacaagtacgcggccagcagctacctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctgcagaatgttca169.seq id no:9，工程化的cλ7aa:170.psvtlfppsseelqankatlvclvsdfypgavtvawkadgspvkvgvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscrvthegstvektvapaecs171.seq id no:10，工程化的cλ7dna:172.ccctcggtcactctgttcccaccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcgtaagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatggcagccccgtcaaggtgggagtggagaccaccaaaccctccaaacaaagcaacaacaagtatgcggccagcagctacctgagcctgacgcccgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccgggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctgcagaatgctct173.seq id no:11，工程化的igg1 ch1 aa:174.tkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkv175.seq id no:12，工程化的igg1 ch1 dna:176.accaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttg177.seq id no:13，工程化的igg2 ch1 aa:178.tkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktv179.seq id no:14，工程化的igg2 ch1:180.accaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagtt181.seq id no:15，工程化的igg3 ch1 aa:182.tkgpsvfplapcsrstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtytcnvnhkpsntkvdkrv183.seq id no:16，工程化的igg3 ch1 dna:184.accaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacacctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtt185.seq id no:17，工程化的igg4 ch1 aa:186.tkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrv187.seq id no:18，工程化的igg4 ch1 dna:188.accaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccgg189.tgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgc190.cctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagtt191.3.材料和方法192.3.1·抗体和tcr同源性建模193.使用modeller基于其氨基酸序列建立抗体和tcr结构模型。然后组装所有建模的区段，构建α嵌合链和β嵌合链结构模型。通过取总体序列最相似的tcr结构的角度来预测两个建模链之间的相对方向。所有的分子可视化和分析工作都是使用pymol软件(schrodinger)进行的。194.3.2dna操作195.ctcr1和ctcr2基因由genewiz inc.合成。ch1和cλ/cκ基因通过pcr从实验室dna模板扩增。对于那些与fc结构域融合的嵌合体(igg样etcr)，将轻链重排的基因产物插入含有cmv启动子、κ信号肽和wpre调节因子的线性化载体中，而将重链重排的基因产物插入含有人相应恒定区ch2-ch3、cmv启动子和人抗体重链信号肽的线性化载体中。对于那些未与fc结构域融合的嵌合体(fab样etcr)，将轻链重排和重链重排各自分别插入含有cmv启动子、κ信号肽和wpre调节因子的线性化载体中。使用标准分子生物学方案进行质粒连接、转化、dna制备。196.3.3蛋白质表达197.将构建的重链和轻链载体共转染到expi293细胞(thermofisher scientific)中。根据etcr的预期结构以及sds-page和western印迹显示的初始表达结果，优化了用于共转染的不同载体的比例。转染程序遵循供应商提供的手册。简言之，使用2.5μg的每种质粒和13.6expifectamine转染5ml体积的2.94*106个细胞。在转染后20小时加入增强剂1和增强剂2。转染细胞在37℃、8％ co2、85％湿度的轨道振荡器上培养，以120rpm(烧瓶)或200rpm(50ml管)旋转。转染后5天，通过离心收集上清液，并通过0.22μm过滤去除细胞片段。在进行进一步测试之前，如有必要，将处理过的上清液浓缩。198.3.4通过elisa测量etcr浓度199.对于igg样etcr，将elisa板在包被缓冲液(200mm na2co3/nahco3，ph 9.2)中用1μg/ml抗人fc抗体包被。在4℃孵育过夜后，使用深孔清洗机(biotek elx405)用pbst洗涤缓冲液洗涤板一次。然后用1％酪蛋白封闭平板，并在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板3次，并加入100μl阳性对照(如果有)、阴性对照(如果有)和稀释的样品，在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤板3次，并加入100μl缀合有hrp的抗λ抗体或抗κ抗体，在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板6次，加入100μl tmb并孵育10分钟，然后加入100μl停止溶液(2m hcl，100μl/孔)，并使用平板读取器(molecular device spectramax mv5e)读取450nm处的吸光度。200.对于fab样etcr，将elisa板在包被缓冲液(200mm na2co3/nahco3，ph 9.2)中用0.5μg/ml抗his抗体包被。在4℃孵育过夜后，使用深孔清洗机(biotek elx405)用pbst洗涤缓冲液洗涤板一次。然后用1％酪蛋白封闭平板，并在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板3次，并加入100μl阳性对照(如果有)、阴性对照(如果有)和稀释的样品，在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤板3次，并加入100μl缀合有hrp的抗λ抗体或抗κ抗体，在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板6次，加入100μl tmb并孵育10分钟，然后加入100μl停止溶液(2m hcl，100μl/孔)，并使用平板读取器(molecular device spectramax mv5e)读取450nm处的吸光度。201.3.5通过elisa测量靶标结合202.将elisa板在包被缓冲液(200mm na2co3/nahco3，ph 9.2)中用2μg/ml链霉亲和素(sa)包被。在4℃孵育过夜后，使用深孔清洗机(biotek elx405)用pbst洗涤缓冲液洗涤板一次。然后用1％酪蛋白封闭平板，并在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板3次，加入2.5μg/ml抗原hla*a*02:01ny-eso-1(sllmwitqc)、hla*a*02:01gp100(ylepgpvtv)(phla，由kactus bio提供)，并在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板3次，并加入阳性对照(如果有)、阴性对照(如果有)和稀释的样品，在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板3次，并加入100μl缀合有hrp的抗c-myc抗体，在室温孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤平板6次，加入100μl tmb并孵育10分钟，然后加入100μl停止溶液(2m hcl，100μl/孔)，并使用平板读取器(molecular device spectramax mv5e)读取450nm处的吸光度。203.4.结果204.由于tcr是天然的膜蛋白，将其转变为可溶性形式并不总是能产生良好的药物样特性。然而，正如数十年前报道的那样，通过将人工二硫键cαs48-cβt57引入非共价天然tcr cα-cβ中，产生了稳定性增强的可溶性tcr形式(图7a，us7666604b2)。与天然tcr不同，天然二硫键存在于抗体恒定结构域中(图7b)，可能有助于嵌合体的稳定性。205.我们首先评估了ch1和cλ/cκ代替cα和cβ的能力。将ctcr1和ctcr2可变结构域的任一种与igg抗体的恒定结构域重排，并与fc结构域融合，产生igg样etcr。通过elisa进一步测定这些etcr的表达和结合。表1和表2列出了igg样etcr的构建、表达和结合结果，将收获的上清液浓缩10倍用于elisa分析。一般来说，大多数构建体成功表达但是结合信号相对较低，这表明嵌合的igg样etcr的etcr部分可能没有正确折叠或组装。显然，预期能进一步增强嵌合tcr的性能的fc结构域未能稳定etcr部分。然而，通过分析结果，我们发现“相反(reverse)”融合模式优于“正常”融合模式：对于几乎所有测试样品，vα与ch1融合和vβ与cl融合产生了比其他情况更好的结合性能。206.表1：使用来自ctcr1的可变结构域的igg样etcr的构建、表达和结合结果[0207][0208]表2：使用来自ctcr2的可变结构域的igg样etcr的构建、表达和结合结果[0209][0210]此外，将来自iga、igd、ige和igm的更多恒定结构域也与ctcr1和ctcr2可变结构域重排，产生fab样etcr(基于先前的结果，fc结构域在进一步的筛选和工程化中不会与etcr融合)，用于广泛筛选。通过elisa进一步测定这些etcr的表达和结合。表3和表4列出了fab样etcr的构建、表达和结合结果，收获的上清液浓缩10倍用于elisa分析。通常，当tcr可变结构域与来自iga、igd、ige和igm的恒定结构域融合时，观察到较低的表达水平和结合性能。[0211]基于这些结果，进一步的工程化将集中于以“相反”模式融合的具有包括igg ch1和cλ/cκ的恒定结构域的fab样etcr。[0212]表3：使用来自ctcr1的可变结构域的fab样etcr的构建、表达和结合结果[0213][0214]表4：使用来自ctcr2的可变结构域的fab样etcr的构建、表达和结合结果[0215][0216]实施例3：etcr的连接结构域的设计和工程化[0217]通常，tcr和抗体两者中的可变结构域和恒定结构域之间的连接结构域对其稳定和功能是重要的。然而，igg和tcr的接头有所不同。因此，在每条链的可变结构域和恒定结构域之间插入了不同类型和长度的接头。产生了多种etcr，并测试了它们的表达水平和结合性能。[0218]结果[0219]首先将不同长度的包含丝氨酸和丙氨酸的常规柔性接头作为接头插入tcr可变结构域和抗体恒定结构域之间(对于tcr vα-ch1融合为seq idno:19-24，对于tcr vβ-cλ/cκ融合为seq id no:25-30)。[0220]表5列出了可变结构域和恒定结构域之间插入柔性接头的fab样etcr的示例性构建、表达和结合结果，收获的上清液浓缩10倍用于elisa分析。连接结构域包含ssas作为接头(对于α链为seq id no:19，对于β链为seq id no:25)在所有测试的嵌合组装体中显示出最佳的表达水平和结合信号(表5)，表明可变结构域和恒定结构域的空间位阻没有被消除，并且尽管在结构域之间引入了一些柔性，但原始的tcr功能没有完全恢复。[0221]seq id no:19，连接结构域1aa:ssas[0222]seq id no:20，连接结构域1dna:tcgtcggcttca[0223]seq id no:21，连接结构域2aa:ssass[0224]seq id no:22，连接结构域2dna:tcgtcggcttcatcg[0225]seq id no:23，连接结构域3aa:ssasss[0226]seq id no:24，连接结构域3dna:tcgtcggcttcatcgtca[0227]seq id no:25，连接结构域4aa:ssaskaa[0228]seq id no:26，连接结构域4dna:agttcggcctcaaaggctgcc[0229]seq id no:27，连接结构域5aa:ssasskaa[0230]seq id no:28，连接结构域5dna:tcgtcggcttcatcgaaggctgcc[0231]seq id no:29，连接结构域6aa:ssassskaa[0232]seq id no:30，连接结构域6dna:tcgtcggcttcatcgtcaaaggctgcc[0233]表5：可变结构域和恒定结构域之间插入柔性接头的fab样etcr的构建、表达和结合结果[0234][0235]接下来，我们基于结构比对仔细比对了抗体和tcr的序列，发现种系序列中定义的连接位置并不总是与结构域一致。我们检查了抗体和tcr中的连接位置在叠加的结构上是如何重叠的，并估计了使用tcr连接位置到抗体恒定结构域的n末端的可能的替换(图8，如黑色箭头所示)。特别地，将tcr恒定结构域的结构与抗体恒定结构域的结构比对显示，tcrβ链的fg和de环明显长于抗体恒定结构域中的相应区域，并与tcr连接结构域形成强相互作用(图8a，用红色箭头表示)。由于目前的嵌合etcr中不存在长fg和de环，因此需要对原始tcr连接结构域中呈现为不饱和带电氨基酸的关键位置进行合理突变，以提高稳定性。[0236]基于这种概念，使用λg4-reverse恒定结构域为例示性骨架，首先设计并测试了β链的两个连接结构域(l1和l2)(位于tcr vβ结构域和cλ之间)(seq id no：33-36，l1的氨基酸序列如seq id no:33所示，l2的氨基酸序列如seq id no:35所示，链α的连接结构域仍然是柔性接头，柔性接头的氨基酸序列如seq id no:19所示)。表6列出了可变结构域和恒定结构域之间插入设计接头的fab样etcr的示例性构建、表达和结合结果，收获的上清液浓缩10倍用于elisa分析。插入设计的接头的β链克隆显示出更好的结合信号，尽管与使用ctcr1和ctcr1可变结构域的λg4-reverse骨架相比保持相似的表达，表明β链中使用设计的接头l1和l2作为连接结构域能够实现更好的结构相容性，并产生更类似于天然tcr的组装体。因此，将分别在α链和β链中插入柔性接头和设计接头的λg4-reverse用作示例性的骨架用于进一步的工程化。[0237]seq id no:31，连接结构域7aa:edlnkvfp[0238]seq id no:32，连接结构域7dna:gaggacctgaacaaggtgttccca[0239]seq id no:33，连接结构域9aa:edlsnvsp[0240]seq id no:34，连接结构域9dna:gaggacctgtccaatgtcagtccc[0241]seq id no:35，连接结构域8aa:edlknvfp[0242]seq id no:36，连接结构域8dna:gaggacctgaaaaacgtgttccca[0243]表6：可变结构域和恒定结构域之间插入设计接头的fab样etcr的构建、表达和结合结果[0244][0245]实施例4：etcr的vβ-cl结合界面的设计和工程化[0246]通过仔细分析天然tcr结构，我们发现天然tcr的可变结构域和恒定结构域的结合通常由三个分别的区域贡献，即vα-cα、vβ-cβ和vα-cβ(图9)。其中，vβ-cβ处的最大结合区域被发现是高度有组织的，由几个氢键和盐桥以及疏水核心组成，表明具有非常强的结合亲和力(图10a，极性接触用红色箭头和黄色虚线表示，非极性接触由橙色圆圈表示)。然后，我们将嵌合etcr结构叠加到天然tcr上，并进一步注意到，将cβ替换为抗体恒定结构域cλ完全破坏了天然tcr的高度有组织的相互作用(图10b)。通过分析叠加模型，确定了cλ中可能有助于vβ和cλ结合的关键位置，并进一步设计和测试了突变。下面列出了示例性设计和突变。对于所有tcr可变结构域使用imgt编号规则。[0247]表7.示例性设计和突变no:33)的λg4-reverse用作进一步工程化的示例性骨架。基于结构分析，鉴定了抗体cλ中包括g30、a31和t33在内的关键位置，并分别突变为g30d、a31h和t33e，从而产生类似tcr的相互作用。[0259]产生单个突变和组合突变，并表达、纯化和表征。图11a显示了示例性突变的上清液的电泳结果，从sds-page中可以看到清晰的条带，表明嵌合etcr1的表达随着这些突变而显著增强。进一步的结合elisa测试也显示了与天然tcr ctcr1相当的结合表现(图11b，微小的差异可能由不同检测标签所致)，表明g30d-vβ123r、a31h-vβ125t和t33e-vβ10r之间通过合理突变重建的相互作用强烈稳定了总etcr1结构。尽管具有这些突变的etcr1表达良好且功能良好，但在具有相同突变的etcr2中观察到了差异。[0260]为了进一步增加链β的相容性，再次叠加etcr1和etcr2的结合界面并仔细分析。结构分析显示，位于v-c结合界面的tcr可变结构域的框架区1(fr1)在etcr1和etcr2中显著不同，为上述差异提供了解释(图12a，不同之处用红色箭头表示)。基于在链α和链β形式中插入柔性接头ssas(seq id no:19)和设计接头l1(seq id no:33)的λg4-reverse以及bm1设计，根据ctcr2 fr1中的结构分析选择的位置一一被取代为etcr 1fr1中相应的氨基酸，以进一步增加etcr2的相容性，结果，鉴定了etcr2可变β结构域(vβ)的一个位置r13。图12b显示了r13突变的上清液的示例性电泳结果，从sds-page中可见清晰的条带，表明与bm1相比，具有fr1突变体的嵌合etcr2的表达显著增强。进一步的q-elisa测试还显示，与亲本etcr2-bm1相比，具有r13k/t突变的etcr2-bm1的表达水平增加(957/755nm相比于208nm)，表明vβ中的r13突变以及cλ中的突变强烈稳定了整个etcr2结构。[0261]实施例5：etcr的spr分析[0262]然后使用spr技术测定etcr的准确结合表现。[0263]方法[0264]使用biacore t200(或biocore 8k)检测etcr与mhc-肽(pmhc)抗原的结合亲和力。一般过程如下所述：将pmhc抗原固定在cm5传感器芯片(ge)上。将一系列浓度的分析物和运行缓冲液(50mm磷酸钠、150mm nacl、0.05％吐温20，ph7.4)以30μl/min的流速依次注入芯片，结合阶段120秒和解离阶段2400秒。在每个循环后，用10mm甘氨酸(ph 1.5)完全再生传感器芯片表面。使用没有捕获配体的表面通道fc1作为对照表面用于参照物扣减。从参照fc1和缓冲通道数据中扣减得到每个相互作用的最终数据。将50.5kda的分子量用于计算分析物的摩尔浓度，并通过biacore 8k评估拟合实验数据。[0265]结果[0266]图13显示了etcr和ctcr的传感器图谱，通常从传感器图谱中观察到非常相似的结合行为。具体而言，表13和表8-9列出了示例性etcr1和etcr2的spr结果。嵌合etcr和ctcr具有定性上相似的结合性能。特别是，etcr显示出比ctcr更好的kon，这可能得益于与ctcr相比更稳定、更相容的抗体恒定结构域。[0267]表8.示例性etcr1和ctcr1的spr结果[0268][0269]表9.示例性etcr2和ctcr2的spr结果[0270][0271]实施例6：etcr的facs分析[0272]然后使用facs技术在肿瘤细胞系上评估etcr的结合性能。[0273]方法[0274]使用a375肿瘤细胞系(a375是hla*a*02:01和ny-eso-1双阳性细胞系)评估设计的etcr的结合能力。细胞系从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得，并维持于补充有10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基中。[0275]收集每个孔105个细胞的等分试样，用1％牛血清白蛋白(bsa)洗涤，然后与连续稀释的etcr在96孔圆形底板中在4℃孵育1小时。用1％ bsa洗涤三次后，将平板与缀合有pe的山羊抗人c-myc抗体在4℃进一步孵育30分钟。再洗涤板三次后，使用facscanto ii细胞仪(bd biosciences)通过流式细胞术分析细胞，并使用flowjo软件对关联的荧光强度定量。在prism软件(graphpad software，inc)中使用四参数非线性回归分析获得ec50值。[0276]结果[0277]图14显示了示例性etcr1的facs结果。嵌合的etcr1-bm1和ctcr1具有定性上相似的结合行为。然而，etcr1-bm2比ctcr1和etcr1-bm1具有显著更好的结合行为，这在elisa或spr中没有表现出来。我们推测与t33e-vβ10r单相互作用相比，g30d-vβ123r、a31h-vβ125t和t33e-vβ10r的综合相互作用的细微结构差异可以在低抗原密度(每个a375细胞10-50个拷贝的抗原)的条件下区分。[0278]实施例7：etcr的vβ框架结构域的设计与工程化[0279]为了进一步测试我们的嵌合形式的相容性，融合了我们的工程化抗体恒定结构域，并将tcr可变结构域的fr1中的突变引入不同的tcr种系，然而，就先前报道的1g4的种系对而言，未能产生稳定的etcr。我们推测，除了恒定结构域和结合界面外，tcr的可变结构域也可能对etcr的稳定性产生影响。因此，对vβ中的fr区进行了综合设计，以获得更好的稳定性。[0280]tcr序列[0281]选择另一种hla*a*02:01ny-eso-1(sllmwitqc)特异性tcr进行研究，该tcr在cαs48-cβt57之间具有非天然二硫键，命名为ctcr3(seq id no：45-48)。对于所有tcr可变结构域使用imgt编号规则。[0282]材料和方法[0283]抗体和tcr同源性建模[0284]使用modeller基于其氨基酸序列建立抗体和tcr结构模型。然后组装所有建模的区段以构建α嵌合链和β嵌合链结构模型。通过取总体序列最相似的tcr结构的角度来预测两个建模链之间的相对方向。所有的分子可视化和分析工作都是使用pymol软件(schrodinger)进行的。[0285]结果[0286]首先，扩增ctcr3的可变结构域并将其融合到包含bm2设计的工程化抗体恒定结构域(λg4-reverse，链α和链β中插入柔性接头ssas(seq idno:19)和设计接头l1(seq id no:35))。然而，所产生的etcr-bm2只有大约50nm的表达并且不能被纯化。为了研究在哺乳动物细胞中表达可溶性tcr时，tcr的vβ结构域的进一步稳定是否有利于tcr的表达、稳定性和组装，我们使用分子建模模拟来鉴定了稳定vβ结构域的突变。我们扫描了vβ结构域fr区的每个残基位置，并使用foldx对所有可能的点突变(半胱氨酸除外)进行建模，计算这些突变的能量。通过分析和排序这些能量数据，从理论上的1500种突变中选择了180种突变进行进一步的实验证实。最终，突变m19y(bm41)、a24k(bm42)、a24r(bm43)、m48f(bm39)、h54y(bm4 4)、h54w(bm45)、h54a(bm40)、n77e(bm46)、r90t(bm37)、r90v(bm47)、l91i(bm38)被证实能够分别地显著提高表达水平。接下来，将稳定化突变组合到不同的变体中，其包含两到四种突变。在所有组合中，r90t-l91i(bm37-bm38)得到最高的表达水平，达到1612nm。表10列出了示例性etcr3的spr结果。嵌合etcr和ctcr具有定性上相似的结合性能，表明tcr可变结构域中的突变也有助于etcr的稳定。[0287]表10.示例性etcr3和ctcr3的spr结果[0288][0289]实施例8：双特异性etcr的设计和工程化[0290]在成功产生稳定表达的etcr并确认嵌合形式能够结合天然配体后，我们继续构建双特异性形式并测试体外功能。使用分别在链α和链β中插入柔性接头ssas(seq id no:19)和设计的接头l1(seq id no:33)以及bm1设计的λg4-reverse作为etcr1形式。[0291]方法[0292]dna操作与质粒构建[0293]抗cd3 scfv抗体(seq id no：49-50)基因由genewiz inc.合成。扩增抗cd3 scfv抗体的基因产物并分别插入tcr vβ结构域的n末端、抗体cλ结构域的c末端、tcr vα结构域的n末端、抗体ch1结构域的c末端，从而生成双特异性etcr1-e1.1、etcr1-e1.2、etcr1-e1.3和etcr1-e1.4(图15a-d)。对于ctcr，扩增抗cd3 scfv的基因产物，并将其插入tcr vβ结构域的n末端，产生ctcr1-e1.1(图15e，形式如所述)。使用标准分子生物学方案进行质粒连接、转化、dna制备。[0294]蛋白质表达、纯化和其他表征方法遵循上述描述。[0295]结果[0296]所有抗cd3 scfv抗体(seq id no:50)etcr融合物在expi293细胞中成功表达并纯化。图16显示了上清液中和纯化后的产生的双特异性etcr蛋白的sds-page数据。清楚地观察到正确的分子量，即在未还原凝胶中约78kd处的条带。纯化后的样品在sec-hplc中进一步检测，纯度达到超过99％。数据表明，etcr双特异性蛋白得到了良好的表达和组装。[0297]然后通过spr测试所有etcr双特异性蛋白的结合行为。表11显示了示例性etcr双特异性蛋白的spr结果。抗cd3 scfv在不同位置的融合没有显著影响etcr1的结合亲和力。与ctcr1双特异性蛋白相比，再次观察到etcr1双特异性蛋白有类似的稍微更好的结合表现，这是由于更好的kon所致。然而，就抗cd3 scfv的结合行为而言，获得了有差异的结果。抗cd3scfv在tcr vα和vβ结构域的n末端缀合的etcr1-e1.1和etcr-e1.3的结合亲和力几乎是抗cd3 scfv在抗体ch1和cλ结构域的c末端缀合的etcr-e1.2和etcr-e1.4的10倍，这表明抗体恒定结构域的空间位阻似乎比tcr可变结构域强。[0298]表11.示例性etcr1双特异性蛋白和ctcr1双特异性蛋白的spr结果[0299][0300]实施例9：双特异性etcr的体外t2细胞杀伤测定[0301]进行体外功能测定以检查所设计的etcr双特异性蛋白在对载有特异性肽的抗原呈递细胞t2的t细胞参与杀伤中的活性。t2细胞是hla*a*02:01阳性的，特别是缺乏参与抗原处理的肽转运蛋白(tap)，因此不能正确地将内源性(处理过的)肽转运到内质网高尔基体中的mhc装载位点。因此，用肽脉冲的t2细胞可用于监测细胞毒性t细胞在非竞争环境中对感兴趣的外源抗原的应答。与肿瘤细胞系相比，装载特定肽的t2细胞通常提供更高的抗原密度，并产生更好的杀伤行为。[0302]方法[0303]通过ficoll-paque plus(ge healthcare-17-1440-03)密度离心从肝素化静脉血中新鲜分离健康供体的外周血单核细胞(pbmc)。在补充有10％ fbs、1％青霉素/链霉素溶液、50单位/ml人il-2配体蛋白和10ng/ml okt3抗体的rpmi 1640培养基中培养6天后，使pbmc通过easysep柱以富集cd8+t细胞。使用来自阴性选择柱的cd8+t细胞作为效应细胞。[0304]从atcc获得t2细胞(1749cem.t2，atcc crl-1992tm)，并在37℃、5％co2下在补充有20％fbs和青霉素/链霉素的imdm培养基中维持。使用前，计数并重悬于培养基中至1*106/ml，在37℃、5％ co2的培养箱中用肽浓度为20μg/ml的肽脉冲90分钟。然后用20nm far-red在dpbs中标记脉冲的t2细胞30分钟，洗涤两次并重悬至设计的细胞密度。[0305]然后将细胞和etcr双特异性蛋白混合并孵育达设计的时间。为了进行分析，向每个孔中加入100μl pi(在pbs中1:500稀释)，并运行facs。[0306]结果[0307]进行体外功能测定以检查所设计的etcr双特异性蛋白在对负载有特异性肽的抗原呈递细胞t2的t细胞参与的杀伤中的活性。将负载有不相关肽的t2细胞以及不相关etcr2用作阴性对照。图17显示了示例性etcr双特异性蛋白在18小时和24小时的剂量依赖性细胞杀伤功能。使用阴性对照均未观察到非特异性杀伤。此外，etcr-e1.1的效力(2.3pm)大约是etcr-e1.3(39pm，表12)的20倍，表明在tcr vβ而不是vα结构域的n末端缀合的抗cd3 scfv产生最佳的重定向杀伤功能(在相同条件下，使用在任一抗体恒定结构域的c末端缀合的抗cd3 scfv的etcr双特异性蛋白未观察到杀伤效果，数据未显示)。特别是，使用相同的抗cd3 scfv和缀合位置，etcr-e1.1(2.3pm)显示出比ctcr1-e1.1(25pm)效力高10倍的显著杀伤，表明由于工程化的抗体恒定结构域和tcr可变结构域嵌合etcr的总体稳定性优于ctcr。[0308]表12.示例性双特异性etcr1和双特异性ctcr1的体外t2细胞杀伤结果[0309][0310]实施例10：双特异性etcr的体外肿瘤细胞系杀伤测定[0311]还进行了体外功能测定以检查所设计的双特异性etcr在对肿瘤细胞系a375的t细胞参与的杀伤中的活性。a375肿瘤细胞是hla*a*02:01和ny-eso-1双阳性的，抗原密度在每个细胞10-50个拷贝之间，适合于测试ny-eso1特异性的tcr双特异性蛋白的杀伤。[0312]方法[0313]分离cd8+t细胞的方法描述于实施例9中。[0314]从atcc获得a375细胞(atcc crl1619tm)，并将其维持在补充有10％fbs的dmem中。为了进行杀伤测定，将50μl/孔稀释的双特异性etcr加入黑孔96孔平底板中。将50μl/孔的分离的cd8+t细胞以指定比例添加到104/孔的a375细胞中，并孵育达设计的时间。为了分析，用dpbs洗涤平板一次，并用cell titer-glo(ctg)测定试剂盒(promega，目录号g755b)检测细胞变化。[0315]结果[0316]进行体外功能测定以检查所设计的双特异性etcr在对肿瘤细胞系a375的t细胞参与的杀伤中的活性。使用无关的etcr2作为阴性对照。图18显示了示例性etcr的剂量依赖性的细胞杀伤功能。使用阴性对照未观察到非特异性杀伤。通常，与t2细胞系相比a375肿瘤细胞系的抗原密度急剧降低，所有双特异性etcr的杀伤效力都降低了，尤其是etcr-e1.3的杀伤功能几乎完全丧失。尽管如此，etcr-e1.1(3.6nm)显示出比ctcr1-e1.1(264nm，表13)效力高70倍的显著杀伤。这些数据再次表明，由于工程化的抗体恒定结构域和tcr可变结构域，嵌合etcr的总体稳定性优于ctcr，并且在真实肿瘤微环境中经常出现的低抗原密度条件下，这种优势得到了扩大。[0317]表13.示例性双特异性etcr1和双特异性ctcr1的体外a375细胞杀伤结果[0318]









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