用于肾脏类器官培养和移植的脱细胞肾脏组织衍生支架及其制备方法与流程 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及用于肾脏类器官培养和移植的脱细胞肾脏组织衍生支架及其制备方法。背景技术：2.现有的二维细胞培养方法在实现实际的体内微环境方面存在局限性，培养效率低，因此2d细胞株作为体外模型存在局限性。作为改善这些局限性的新方案，三维类器官培养技术最近备受关注，类器官作为能够应用于新药筛选、药物毒性评估、疾病建模、细胞治疗剂、组织工程等各种临床应用的组织类似物，是一种在全世界范围内快速发展的技术。类器官在三维结构体内不仅由构成人体特定脏器和组织的各种细胞组成，而且还可以实现它们之间的复杂的相互作用，因此与在现有技术中主要使用的药物评估模型，例如简单的2d细胞株模型或动物模型等相比，其可以用作更准确的体外模型平台。3.在全世界范围内已经构建了各种器官衍生的类器官平台，并且到目前为止相关研究仍在积极进行中，到目前为止为了培养类器官，将基质胶(matrigel)产品共同用作培养支架。但由于基质胶是从鼠的肉瘤组织中提取的成分，因此难以均匀地维持产品的品质，价格昂贵，并且在动物感染性菌以及病毒转移等安全性方面存在问题，从而作为一种类器官培养系统的基质胶具有很多需要解决的问题。尤其是，作为癌组织衍生的材料，其不能提供用于培养特定组织类器官所需的最佳的组织特异性微环境。虽然已经进行了一些以高分子为基础的水凝胶来替代基质胶的开发研究，但目前还没有报道关于能够替代基质胶的水平的材料。4.肾脏类器官可以从肾脏组织中提取成体干细胞并进行培养或由多能干细胞制备，例如人诱导多能干细胞或胚胎干细胞。然而，由于用于培养肾脏类器官的基质胶无法实现体内复杂的肾脏组织特异性微环境，因此有必要提高肾脏类器官的分化效率和功能。所以迫切需要开发一种新的培养系统以制备更成熟、更具功能性的肾脏类器官。5.末期肾功能衰竭、慢性肾炎等难治性肾脏疾病是严重的疾病，由于没有合适的治疗剂，患者需要终生进行血液透析或接受肾脏移植，因此日常生活变得困难，大幅度降低患者的生活质量，并且在肾脏移植后，因服用免疫抑制剂以及副作用而遭受巨大痛苦。因此，开发一种能够高效培养肾脏类器官的系统作为用于开发肾脏疾病治疗剂的精确体外模型，从医疗保健的观点来看是一个非常重要的问题。6.在本发明中，通过肾脏组织的脱细胞工艺制作了由肾脏组织特异性细胞外基质成分构成的水凝胶基质，并将其应用于肾脏类器官培养。与现有的器官脱细胞方法相比，本发明简化了脱细胞工艺，不仅使基质制作过程非常容易，而且肾脏组织特异性细胞外基质成分以及生长因子也得到了很好的保存，由此确认了可以诱导肾脏类器官的有效的生长和分化，并验证了作为可替代现有基质胶的培养基质的可能性。技术实现要素：7.发明所要解决的问题8.本发明的目的在于，通过对猪肾脏组织进行化学处理来获得大量的脱细胞组织，并基于此制作水凝胶支架，从而应用于肾脏类器官培养。9.然而，本发明所要解决的技术问题不限于上述所提及到的问题，本领域技术人员通过以下描述将清楚地理解未提及的其他问题。10.用于解决问题的方案11.本发明的一个方面，提供一种用于肾脏类器官培养和移植的支架，其使用肾脏组织衍生细胞外基质(kidney extracellular matrix；kem)。12.作为本发明的一具体例，上述肾脏组织衍生细胞外基质可以通过使用将曲拉通x-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和氢氧化铵进行混合的溶液来制备。13.作为本发明的一具体例，上述支架内上述肾脏组织衍生细胞外基质的浓度可以为1mg/ml至10mg/ml。14.本发明的另一方面，提供一种用于肾脏类器官培养和移植的支架的制备方法，其包括：1)将分离的肾脏组织进行粉碎的步骤；以及2)通过对上述粉碎的肾脏组织用曲拉通x-100和氢氧化铵来进行处理的方式进行脱细胞，并制备脱细胞的肾脏组织衍生细胞外基质(kem)的步骤。15.作为本发明的一具体例，在上述步骤2)之后，还可以包括：3)将上述脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质(kem)冷冻干燥，并制备冷冻干燥的肾脏组织衍生细胞外基质的步骤。16.作为本发明的一具体例，在上述步骤3)之后，还可以包括：4)将上述冷冻干燥的肾脏组织衍生细胞外基质形成为水凝胶形态的用于肾脏类器官培养和移植的支架的步骤。17.作为本发明的一具体例，上述步骤4)中，可以将上述冷冻干燥的肾脏组织衍生细胞外基质溶解在胃蛋白酶溶液中进行溶液化，然后通过调节ph来进行水凝胶化。18.本发明的另一方面，提供一种在上述支架或根据上述制备方法制备的支架中培养肾脏类器官的方法。19.发明效果20.使用本发明开发的脱细胞支架可以实现肾脏类器官的高效培养，因此有望替代存在各种问题的现有的基质胶，并能够广泛应用于新药开发、药物毒性及有效性评估、患者特异性药物筛选等医疗产业领域。由此，有望在健康社会方面提高国民的生活质量，同时在经济/产业方面创造巨大的附加价值。21.脱细胞肾脏组织衍生人工基质支架有望能够在多个领域广泛使用，如在体外实现各种难治性肾脏疾病(急性/慢性肾炎、肾功能衰竭等)并阐明其机制的疾病建模研究以及移植治疗平台的构建等。最近由于这些难治性肾脏疾病的患病率大幅增加并且需要进行大量研究，因此作为用于相关基础研究的研究用材料也能产生收益。22.肾脏类器官不仅作为疾病模型，而且作为再生医学目的的细胞治疗剂以及组织再生治疗剂，具有无限的可能性。对于末期肾功能衰竭患者，由于血液透析而无法正常生活，如果通过使用本发明开发的脱细胞肾脏衍生支架的肾脏类器官移植治疗能够治疗本质性的肾脏疾病，则能够大幅改善患者的生活质量，并且可以大幅降低相关费用。23.本发明开发的人工支架不仅可以应用于干细胞衍生肾脏类器官培养，还可以应用于肾癌类器官培养，因此有助于针对难治性疾病及癌症患者的特异性疾病模型的构建，从而也可以用作精准医学平台技术，考虑到最近激增的精准医学市场的规模，有望创造巨大的附加值。24.综上所述，与为了肾脏类器官的培养以及应用而所必需的基质胶相比，本发明开发的人工支架作为培养系统表现出优于基质胶的功能性，并且更安全，在费用方面也具有非常有利的优点。因此，可以预测，仅凭这种基质胶替代作用也可以创造巨大的经济收益。附图说明25.图1示出了用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质(kidney extracellular matrix；kem)支架的制备过程。26.图2示出了用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生kem支架的分析结果。27.图3示出了根据kem浓度的脱细胞肾脏组织衍生水凝胶支架的物理特性的分析结果。28.图4示出了用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质(kidney extracellular matrix，kem)的蛋白质组的分析结果。29.图5示出了将用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质(kidney extracellular matrix，kem)的蛋白质组与基质胶的蛋白质组进行比较分析的结果。30.图6示出了为了选定用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶支架的最佳浓度而进行的分析结果。31.图7示出了在脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶支架中培养的肾脏类器官的增殖以及分化标志物表达分析(细胞免疫染色分析)结果。32.图8示出了在脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶支架中形成的肾脏类器官的生长状况。33.图9示出了在脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix，kem)中长期培养的肾脏类器官的分析结果。34.图10以及图11示出了脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix，kem)的长期保存可能性的验证结果。35.图12是用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix，kem)的组织特异性效果的确认结果。36.图13示出了在脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix，kem)中培养的肾脏类器官的功能性的分析结果。37.图14是使用在脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix，kem)中培养的肾脏类器官来制作肾纤维化模型的结果。38.图15是脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质(kidney extracellular matrix，kem)支架的生物相容性的确认结果。39.图16以及图17示出了使用脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix，kem)的肾脏类器官的体内移植的结果。具体实施方式40.以下，将参照附图描述本发明。然而，本发明能够以多种不同的形态实现，因此不限于在这里描述的实施例。当某个部分“包括”某个构成要素时，除非另有说明，否则意味着可以进一步包括其他构成要素，而不是排除其他构成要素。41.除非另有定义，可以在分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程和dna测序分析以及在本领域技术人员的能力范围内重组dna领域中，通过常用的常规技术来进行。上述技术是本领域技术人员已知的，并且在许多标准化的教科书和参考书中都有记载。42.除非本说明书中另有定义，否则所使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同含义。43.包含本说明书所含术语的各种科学词典已众所周知，并且在本领域可使用。虽然发现，在本技术的执行或试验中，使用了与本说明书中说明的相似或等效的任意的方法和物质，但仍然描述了几种方法和物质。由于根据本领域技术人员所使用的脉络，能够以多样化的方式进行使用，因此本发明不限于特定的方法学、方案和试剂。以下，将更详细地描述本发明。44.本发明的一个方面，提供一种使用肾脏组织衍生细胞外基质(kidney extracellular matrix；kem)的用于肾脏类器官培养和移植的支架。45.上述“细胞外基质(extracellular matrix)”是指，在哺乳类以及多细胞生物(multicellular organisms)中发现的通过组织的脱细胞化来制作的用于细胞生长的天然支架。上述细胞外基质可以通过透析或交联的方式进一步处理。46.上述细胞外基质可以是不限于胶原蛋白(collagens)、弹性蛋白(elastins)、层粘连蛋白(laminins)、糖胺聚糖(glycosaminoglycans)、蛋白聚糖(proteoglycans)、抗菌剂(antimicrobials)、化学引诱剂(chemoattractants)、细胞因子(cytokines)和生长因子的结构型生物分子和非结构型生物分子(biomolecules)的混合物。47.在哺乳动物中，上述细胞外基质是多种形态的，可含有约90％的胶原蛋白。由于各组织所需的固有作用，多种生物组织衍生的细胞外基质整体结构体以及组成可能不同。48.上述“衍生(derive)”和“衍生的(derived)”是指通过有用的方法从所述来源获得的成分。49.作为本发明的一个具体例，上述肾脏组织衍生细胞外基质可以使用混合曲拉通x-100和氢氧化铵的溶液来制备。50.作为本发明的一个具体例，上述支架内上述肾脏组织衍生细胞外基质的浓度可以为1mg/ml至10mg/ml，具体可以为1mg/ml至7mg/ml。作为上述肾脏细胞外基质的浓度的示例，可以为1mg/ml至7mg/ml、1mg/ml至5mg/ml、1mg/ml至3mg/ml、3mg/ml至7mg/ml、3mg/ml至5mg/ml或5mg/ml至7mg/ml，作为一个实施例，可以为1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml或7mg/ml。当以上述范围之外的浓度包含在内时，不能获得本发明的目的效果。51.上述支架包括基于通过脱细胞化获得的肾脏组织衍生细胞外基质制备的三维水凝胶，并且可有效应用于肾脏类器官培养。52.上述脱细胞化的肾脏组织含有实际组织特异性细胞外基质成分，因此可以提供该组织的物理、机械以及生化环境，并且在分化为肾脏组织细胞以及促进组织特异性功能性方面非常有效。53.上述“类器官(organoid)”是指将组织或全能干细胞(totipotent stem cell)衍生的细胞以3d形态培养，制作成人工脏器形态的超小型活体器官。54.上述类器官作为包含由干细胞产生并以类似于体内状态的方式进行自组织(或自模式)的器官特异性细胞的三维组织类似物，可以通过对有限的要素(例如，生长因子)进行模式化而发育成特定组织。55.上述类器官具有细胞的本来的生理学特性，并且可以具有模拟细胞混合物原始状态的解剖学结构(不仅包括限定的细胞类型，还包括残留的干细胞、近端生理生态位(physiological niche))。上述类器官通过三维培养方法使得细胞和细胞功能得到更好的排列，可以具有如具备功能性的器官的形态和组织特异性功能。56.本发明的另一方面，提供一种用于肾脏类器官培养和移植的支架的制备方法，上述制备方法包括如下步骤：1)将分离的肾脏组织进行粉碎的步骤；以及2)通过对上述粉碎的肾脏组织用曲拉通x-100和氢氧化铵来进行处理的方式进行脱细胞，并制备脱细胞的肾脏组织衍生细胞外基质(kem)的步骤。57.上述步骤1)是将分离的肾脏组织进行粉碎的步骤，上述肾脏组织可以为从公知的动物中分离的，作为上述动物的具体示例，可以为牛、猪、猴、人类等。此外，在本发明中，由于脱细胞处理是在粉碎上述分离的肾脏组织之后进行的，因此脱细胞效率高。将分离的肾脏组织进行粉碎的方法可以通过公知的方法来进行。由于本发明是将上述肾脏组织粉碎而进行的脱细胞工艺，因此更有效并且能够实现较高水平的细胞去除。58.上述步骤2)是通过对上述粉碎的肾脏组织用曲拉通x-100和氢氧化铵来进行处理的方式进行脱细胞，并制备脱细胞的肾脏组织衍生细胞外基质(kem)的步骤。与现有的脱细胞方式不同，本发明仅用曲拉通x-100和氢氧化铵来进行处理，并将组织损伤最小化，从而可以保存更多的肾脏组织内的各种蛋白质。作为具体示例，可以将粉碎的肾脏组织与曲拉通x-100和氢氧化铵一起搅拌的同时进行脱细胞工艺。59.作为本发明的一具体例，在上述步骤2)之后，还可以包括：3)将上述脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质(kem)进行冷冻干燥，并制备冷冻干燥的肾脏组织衍生细胞外基质的步骤。60.上述步骤3)是将上述脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质(kem)进行冷冻干燥，并制备冷冻干燥的肾脏组织衍生细胞外基质的步骤。上述冷冻干燥的肾脏组织衍生细胞外基质在干燥后，可以暴露于电子束、伽马射线、环氧乙烷气体或超临界二氧化碳中，以便进行灭菌。61.作为本发明的一具体例，在上述步骤3)之后，还可以包括：4)将上述冷冻干燥的肾脏组织衍生细胞外基质形成为水凝胶形态的用于肾脏类器官培养和移植的支架的步骤。62.上述步骤4)是将上述冷冻干燥的肾脏组织衍生细胞外基质形成为水凝胶形态的用于肾脏类器官培养和移植的支架的步骤。上述步骤可以通过凝胶化(gelation)的方式而进行，具体地，可以为将上述冷冻干燥的肾脏组织衍生细胞外基质溶解在胃蛋白酶溶液中进行溶液化后，通过调节ph来进行水凝胶化。可以通过对上述脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质进行交联来制作三维水凝胶形态的支架，并且凝胶化的支架不仅可应用于实验和筛选，还可以多样化地应用于与类器官培养相关的领域。63.上述“水凝胶”是以水为分散介质的液体通过溶胶-凝胶相变，变硬失去流动性，并形成多孔性结构的物质，可以通过使具有三维网络结构和微晶结构的亲水性聚合物含有水并膨胀而形成。64.上述凝胶化可以为在酸性溶液中，通过用胃蛋白酶或胰蛋白酶等蛋白水解酶将冷冻干燥的肾脏组织衍生细胞外基质进行溶液化，并调节ph，具体地，通过使用10x pbs和1m naoh调节到中性ph和1x pbs缓冲液的电解质状态，在37℃的温度下进行30分钟。65.本发明的另一方面，提供一种培养肾脏类器官的方法，该方法在上述支架或根据上述制备方法制备的支架中培养肾脏类器官。66.现有的基于基质胶的培养系统作为动物癌组织衍生的提取物，批次间差异大，不能模拟实际肝脏的环境，分化、发育成肾脏类器官的效率微弱，但上述支架可以营造类似于肾脏组织的环境，因此适用于培养肾脏类器官。67.上述培养是指在合适的条件下，使细胞维持和生长的过程，适合的条件可以指例如，维持细胞的温度、营养素可溶性、大气co2含量和细胞密度。68.用于维持、增殖、扩增和分化不同类型细胞的适当培养条件在本领域中是已知的并记录在案。适合上述类器官形成的条件可以为使细胞分化和多细胞结构的形成变得容易或允许的条件。69.本发明的最佳实施方式70.由于本发明开发的脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架可以通过最小化的化学处理方式制作，因此与现有的通过脱细胞方式制作的支架相比，对组织特异性成分的损伤较少，在降低制作时间和成本方面效率更高，并且也具有易于大量生产的优点。因此，与现有的脱细胞基质相比，有望在商用化方面更具优势。71.经确认，本发明开发的脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架中，具有免疫原性的细胞均被去除，而实际肾脏组织中所含有的各种细胞外基质成分和生长因子得到了很好的保存。通过蛋白质组分析，掌握了肾脏组织中重要的细胞外基质成分和相关蛋白。因此，脱细胞肾脏组织衍生基质提供肾脏组织特异性微环境，并能够高效培养肾脏类器官。72.实际上在本发明中，确认了在所开发的脱细胞肾脏组织衍生水凝胶内成功诱导了肾脏类器官的形成和分化。制作各种细胞外基质浓度的脱细胞支架，并将其应用于肾脏类器官培养，由此选定最高效地进行肾脏类器官培养的最佳浓度条件。73.当将在所开发的脱细胞支架中培养的肾脏类器官和在用作对照组的基质胶支架中培养的肾脏类器官进行比较分析时，确认了在脱细胞支架中培养的肾脏类器官的分化进一步增强。基于这种结果，确认了与通过现有的方式培养的肾脏类器官相比，在脱细胞支架中培养的肾脏类器官，可以更准确和更精确地再现实际肾脏组织。结果证实，脱细胞肾脏组织衍生支架，实际上有助于肾脏类器官的高效分化和发育，由此证明了其作为基质胶替代材料的可能性。74.以下，示出优选实施例以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例只是为了更容易理解本发明，本发明的内容不受以下实施例的限制。75.用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质(kidney extracellular matrix；kem)支架的制作(图1)76.为了制作肾脏类器官培养支架，通过对猪肾脏组织进行脱细胞工艺处理，从而制作了基于细胞外基质的支架(kidney extracellular matrix；kem)。本发明所使用的脱细胞工艺与现有的脱细胞方法的区别在于，本发明仅使用1％曲拉通x-100和0.1％氢氧化铵(ammonium hydroxide)的混合溶液，该条件比现有的方式更为宽松，因此将组织损伤最小化，从而可以保存更多的肾脏组织内的各种细胞外基质以及生长因子蛋白。此外，由于在将肾脏组织切细后进行脱细胞处理，因此具有能够更高效、可靠地从组织中去除细胞成分(dna)的优点。77.(a)将猪肾脏组织切成小块后，经过一系列的化学处理去除组织内大部分的细胞并进行脱细胞化。然后，将其冷冻干燥以制作粉末形态的脱细胞肾脏组织基质(冻干kem)。78.(b)对10mg的含有肾脏组织细胞外基质的粉末形态的脱细胞肾脏组织基质(冻干kem))用4mg/ml的胃蛋白酶溶液(将4mg的猪胃粘膜衍生胃蛋白酶粉末溶解在1ml的0.02m hcl中的溶液)处理后，在常温下进行溶液化48小时。将10x pbs和1m naoh以适当的比例添加到溶液化的kem中并混合均匀，从而调节成能够进行细胞培养的中性ph和1x pbs缓冲液的电解质状态。最后，在37℃温度条件下的培养箱内诱导凝胶化(gelation)30分钟。在玻璃容器中通过诱导凝胶化而形成的kem水凝胶即使在容器翻转时也不会流下，由此确认了，通过根据温度的交联反应制备了固化的水凝胶。79.用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生kem支架的分析(图2)80.从猪的肾脏组织制作脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix，kem)并进行了特性分析。81.(a)通过h&e组织染色分析，确认了，在脱细胞过程后，组织的细胞核大部分被去除，而整体结构保持良好。此外，通过马松三色(masson’s trichrome)染色确认了胶原蛋白(collagen)也保存良好，并且通过阿尔新蓝(alcian blue)染色确认了gag成分保存良好并维持良好。82.(b)为了确认肾脏组织的ecm蛋白是否在脱细胞过程后也能得到很好的保存而进行了免疫染色。经确认，即使在脱细胞工艺之后，如纤连蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)等主要ecm蛋白也能得到很好的维持。83.(c)当使用扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，sem)观察脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶的内部结构时，确认了该内部结构是由胶原纳米纤维特有的多孔性微结构构成。因此，认为kem水凝胶可以提供适合肾脏类器官培养的结构微环境。84.(d)对脱细胞前的肾脏组织(native)和脱细胞后的肾脏组织(decell)进行了dna定量分析和糖胺聚糖(glycosaminoglycans，gag)定量分析。当比较脱细胞前后的结果时，在脱细胞工艺后dna被去除96.8％以上，从而确认了细胞被高效地去除。此外，经确认，在脱细胞工艺后，gag也以与实际肾脏组织相似的水平保存良好，并且胶原蛋白也得到了良好地维持和存在。85.根据kem浓度的脱细胞肾脏组织衍生水凝胶支架的物理特性分析(图3)86.使用脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质(kem)制作4种浓度的水凝胶支架后，测量了根据各浓度的物理特性变化。所有浓度条件下的凝胶是在37℃的培养箱中通过30分钟的交联反应来制作。经确认，在包括作为最低浓度的1mg/ml浓度条件在内的所有浓度条件下，储能模量(storage modulus(g′))值始终高于损耗模量(loss modulus(g″))值。由此确认了，通过水凝胶内的交联形成了稳定的高分子网络，并且随着kem浓度的增加机械物理性能(模量)也增加。87.用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生kem支架的蛋白质组的分析(图4)88.为了确认脱细胞肾脏组织衍生kem支架中包含的细胞外基质成分，实施了蛋白质组分析(proteomics)。89.作为通过蛋白质组分析制作的脱细胞肾脏组织衍生支架的kem水凝胶中含有胶原蛋白(collagens)、糖蛋白(glycoproteins)、蛋白多糖(proteoglycans)等多种细胞外基质成分，此外，确认了由组织内的细胞分泌并主要以与细胞外基质结合的状态存在的多种因子(分泌因子)，如生长因子、凝血因子、细胞因子等也一同包含在其中。90.在构成kem水凝胶的10种主要ecm中占很大比重的vi型胶原蛋白(collagen type vi，col6)作为肾小球细胞外基质的主要构成成分，在肾脏组织的形成中起着重要作用，层粘连蛋白(laminin，lam)糖蛋白作为基底膜的主要成分，参与肾脏细胞和组织的分化、体内稳态以及存活。此外，双糖链蛋白聚糖(biglycan，bgn)蛋白聚糖在肾脏免疫反应的调节中起着重要的媒介作用。91.除此之外，确认了，在kem支架中存在肾脏组织中的表达比在其他组织中高四倍以上的蛋白质(前10位肾脏-升高蛋白质)。92.因此，在kem水凝胶内观察到的实际肾脏组织中存在的这些各种蛋白质有望可以诱导肾脏类器官的形成和发育。93.用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生kem和基质胶支架的蛋白质组比较分析(图5)94.比较和分析了用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生kem和基质胶支架的蛋白质组。具体如下所示。95.(a)比较脱细胞肾脏组织衍生kem支架和基质胶的组成成分的结果，确认了基质胶大部分仅由糖蛋白(glycoproteins)构成，而kem是由包括糖蛋白在内的各种胶原蛋白和蛋白聚糖等构成。96.(b)当通过基因本体论(gene ontology)分析，将脱细胞肾脏组织衍生kem支架中所包含的主要前10位ecm成分的功能与现有的基质胶支架的主要成分的功能进行比较时，确认了，与基质胶相比，在kem支架中存在更多的与肾脏参与的氮化合物代谢过程相关的蛋白质。97.(c)为了比较基质胶和kem的蛋白质表达模式而通过热图(heatmap)和火山图(volcano plot)来分析的结果，确认了两种支架中所包含的蛋白质的组成非常不同。此外，当通过火山图分析来比较在各支架中表达显著更多的蛋白质之间时，确认了表达倾向也截然不同。98.用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶支架的最佳浓度的选定(图6)99.从小鼠肾脏组织中提取了管状碎片(tubular fragment)。为了选定最适合肾脏类器官培养的最佳浓度的kem水凝胶，首先制作了各种浓度条件的kem水凝胶。将提取的管状碎片均匀混合在各浓度的脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶支架中，然后进行三维培养并诱导肾脏类器官的形成。在培养的第7天进行传代培养，并进一步培养5天，在总共进行培养的第12天确认了在各kem浓度条件下形成的肾脏类器官的形态和形成效率以及基因表达。将基质胶用作对照组。100.(a)经确认，肾脏类器官在除了1mg/ml的浓度条件以外的其余浓度条件的kem水凝胶中形成，并且其以球形的形态形成，相似于在用作对照组的基质胶中培养的类器官。在浓度为1mg/ml的水凝胶中，类器官未形成。101.(b)以传代培养时间点为基准，分别测定第0天和第5天的类器官数量后，将其以比例进行表示并测定形成效率。当按照各kem浓度比较肾脏类器官的形成效率时，确认了，虽然在kem水凝胶中的形成效率整体低于基质胶，但在浓度为7mg/ml的kem水凝胶中显示出最高的形成效率。102.(c)在按照各浓度制作的kem水凝胶中培养肾脏类器官12天后，通过定量qpcr分析，比较分析了针对分化标志物的基因表达。在肾脏的特定细胞中表达的基因aqp1(近曲小管细胞)显示出随着kem浓度的增加而降低的倾向，但在所有浓度的kem中显著高于基质胶组，scl12a1(汉勒氏袢细胞(loop of henle cell))虽然显示出与基质胶组大致相似的表达水平，但在7mg/ml浓度的kem中显著增加。此外，aqp2(集合管细胞)基因在7mg/ml浓度的kem中，以与基质胶组最相似的水平进行表达。103.通过上述分析，确认了，在除了1mg/ml浓度的kem水凝胶以外的所有浓度下可以培养类器官，但总体而言，肾脏类器官的分化能力在7mg/ml kem浓度条件下最佳。104.在脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶支架中培养的肾脏类器官的增殖以及分化标志物表达的分析(细胞免疫染色分析)(图7)105.在培养的第12天通过免疫染色对各种标志物的表达进行分析时，确认了肾脏类器官特异性分化标志物aqp3(集合管细胞)和calb1(远曲小管细胞)均以与作为对照组的基质胶相似的水平良好地表达。106.此外，确认了，参与细胞间紧密连接(tight-junction)的标志物zo-1也在所有浓度的kem水凝胶中培养的肾脏类器官中良好地表达。107.经确认，与类器官增殖相关的标志物ki67也在所有浓度的kem水凝胶中培养的肾脏类器官中良好地表达。108.在脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶支架中形成的肾脏类器官的生长状况(图8)109.从培养的第7天进行传代培养以后开始到第1天～第4天，对分别在基质胶和脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶(5mg/ml、7mg/ml)中培养的肾脏类器官的生长状况进行了比较和观察。110.经确认，在各浓度的kem水凝胶中，均表现出与基质胶相似的状况，并且类器官进行了生长并在4天内培养良好。111.在脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix,kem)中长期培养的裸鼠肾脏类器官的分析(图9)112.(a)经确认，当尝试将肾脏类器官在脱细胞kem水凝胶和基质胶中长期培养至52天时，即使进行了9次的传代培养，类器官也在两种支架中均得到良好地培养并良好地维持相似的球形和大小。113.(b)对在各培养支架中52天内进行9次传代培养的肾脏类器官的pax8(肾祖细胞)和aqp1(近曲小管细胞)的mrna表达量进行比较的结果，确认了，在两种培养支架中pax8以相似的水平表达，而aqp1的表达水平在kem水凝胶中更高。114.(c)使用pax8(肾祖细胞)、villin(近曲小管细胞)、aqp3(集合管细胞)和calb1(远曲小管细胞)抗体对在各培养支架中进行9次传代培养的类器官进行了免疫染色。免疫染色的结果，可以确认，构成肾脏的肾小管的4种细胞在第52天为止仍能良好地维持它们标志物的表达，同时得到很好地培养，并确认了参与细胞间相互作用(cell-cell interaction)的细胞骨架(cytoskeleton)的标志物f-肌动蛋白(f-actin)也良好地表达。115.由此证实，肾脏类器官可以在kem水凝胶中持续长期培养2个月以上，并且确认了与作为商用化的类器官培养基的基质胶相比，肾脏的各种细胞类型标志物以相似或更高的水平表达。116.脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix,kem)的长期保存可能性的验证(图10以及图11)117.首先，验证了脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix，kem)的长期冷藏保存的可能性(图10)。118.(a)将脱细胞肾脏组织衍生kem溶液(浓度为7mg/ml)在4℃下冷藏保存最长1个月，并将其用于肾脏类器官培养，从而确认kem水凝胶是否能长期保存和是否稳定。119.(b)经确认，在用培养前新制备的kem溶液制备的水凝胶(0天)和用冷藏保存一周(7天)以及1个月(31天)的kem溶液制作的水凝胶支架中，肾脏类器官均以与基质胶相似的水平得到了很好的形成和培养(在培养的第12天，进行了1次传代培养的类器官图像)。在传代培养之后和进一步培养4天后，分别测定了类器官的数量，并将其按比例进行表示，从而测定类器官形成效率。120.(c)当进行定量qpcr分析时，在kem水凝胶组中与干性(stemness)相关的pax8基因以与基质胶相似的水平表达。经观察，与基质胶组相比，在kem水凝胶组中作为肾脏特异性标志物的aqp1(近曲小管细胞)的mrna表达量整体更高(在培养的第12天，用进行了1次传代培养的类器官作为样本进行分析)。121.(d)类器官免疫染色分析的结果，确认了，作为肾脏特异性标志物的aqp3(集合管细胞)、calb1(远曲小管细胞)和pax8(肾祖细胞)，即使在kem水凝胶条件下，也能够以与基质胶相似的水平良好地表达。122.通过本实验确认了，即使将脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶溶液以液相冷藏保存，也可以长期保存至少1个月而不影响其活性和功能。这是在产品开发中用于证实kem水凝胶的长期保存可能性的重要的结果。123.此外，验证了脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix，kem)的长期冷冻保存的可能性(图11)。124.(a)将脱细胞肾脏组织衍生kem溶液(浓度为7mg/ml)在-80℃下冷冻保存至最长3个月，然后将其重新解冻并用于肾脏类器官培养，从而确认kem是否能长期保存和是否稳定。125.(b)经确认，在用培养前新制备的kem溶液制备的水凝胶(0天)和用冷冻保存一周(7天)以及3个月(90天)的kem溶液制作的水凝胶支架中，肾脏类器官均以与基质胶相似的水平得到了很好的形成和培养(在培养的第12天，进行了1次传代培养的类器官图像)。126.(c)当实施定量qpcr分析时，在kem水凝胶组中与干性(stemness)相关的pax8基因以与基质胶相似的水平表达。此外，经确认，与基质胶组相比，在kem水凝胶组中作为肾脏特异性标志物的aqp1(近曲小管细胞)的mrna表达量更高(在培养的第12天，将进行了1次传代培养的类器官作为样本进行分析)。127.(d)免疫染色分析的结果，确认了，作为肾脏特异性标志物的aqp3(集合管细胞)，即使在kem水凝胶条件下，也能够以与基质胶相似的水平良好地表达。128.通过本实验确认了，即使将脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶溶液在冷冻条件(-80℃)下冷冻保存，也可以稳定地长期保存至少3个月而不影响其活性和功能。129.用于肾脏类器官培养的脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix，kem)的组织特异性效果的确认(图12)130.为了证实脱细胞肾脏组织衍生kem支架中所含有的肾脏特异性细胞外基质成分对肾脏类器官的形成和发育所带来的组织特异性效果，在其他器官衍生脱细胞支架中也对肾脏类器官进行培养后进行了比较分析。131.(a)在肾脏(kem)、肠(iem)、肌肉(mem)、皮肤(skem)和心脏(hem)衍生脱细胞水凝胶支架中培养肾脏类器官的结果，确认了，在第7天，在皮肤和心脏衍生脱细胞支架中肾脏类器官没有正常形成。此外，经观察，当进行1次传代培养并进一步培养4天的情况(共培养11天)下，在除了脱细胞肾脏组织衍生支架之外的其余脱细胞组织支架中类器官的尺寸形成的较小，并且确认了，在心脏衍生支架中与上述第7天相同地类器官未形成。132.(b)肾脏类器官形成效率的定量分析结果，可以确认，在肾脏衍生脱细胞kem支架中的形成效率最高，而在其他器官衍生脱细胞支架中的形成效率显著降低。在传代培养之后以及进一步培养4天后，分别测定类器官的数量，然后将其按比例进行表示，并测定形成效率。133.(c)为了比较在各器官衍生脱细胞水凝胶支架中培养11天的肾脏类器官的标志物蛋白质的表达量，使用与细胞增殖相关的ki67抗体和与集合管细胞(collecting duct cell)相关的aqp3抗体进行了免疫染色。可以确认，对于在kem水凝胶支架中培养的肾脏类器官，表现出最明显的标志物的表达，而在其余组织衍生支架中培养的类器官都仅观察到相对细微的表达或未能形成正常的结构。134.通过本实验，可以发现肾脏组织衍生kem水凝胶对肾脏类器官形成和发育的组织特异性效果。135.在脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix,kem)中培养的肾脏类器官的功能性的分析(图13)136.为了确认在脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶中培养的肾类器官是否能够很好地实现体内肾脏的功能，进行了分析。为了确认构成肾脏类器官的各种细胞类型之一的近曲小管细胞中存在的p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)异生素外排泵(xenobiotics efflux pump)的功能，使用作为p-gp抑制剂的维拉帕米(verapamil)进行处理后，暴露于钙黄绿素am(calcein am)中，并通过荧光确认了钙黄绿素am在细胞内的积聚程度。137.(a)经确认，在未用维拉帕米(verapamil)进行处理的条件下，p-gp将钙黄绿素排出至细胞外，从而荧光信号几乎不会积聚在类器官内(未处理组)。经确认，随着维拉帕米药物的处理浓度增加，使钙黄绿素积聚在细胞内，从而在类器官内荧光表达相对更高。138.(b)在未用维拉帕米药物进行处理的条件和用100μm维拉帕米进行处理的条件下对肾脏类器官内钙黄绿素的荧光强度进行定量的结果，确认了在用处理维拉帕米进行处理的条件下荧光强度显著增加。139.由此可见，在kem水凝胶中培养的肾脏类器官具有用于排出外界物质的外排泵功能性。140.使用在脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix,kem)中培养的裸鼠肾脏类器官来制作肾纤维化模型(图14)141.使用在kem水凝胶中培养的肾脏类器官来制作了肾纤维化疾病模型。为此，通过用tgf-b药物对小鼠肾脏类器官进行处理来诱发肾纤维化。在对肾脏类器官进行培养的第9天(第7天进行1次传代培养后，进一步培养2天)按照各浓度进行处理3天，在第12天进行分析，并将未用tgf-β处理的肾脏类器官(nt，未处理)作为对照组进行了比较。142.(a)为了制作肾纤维化模型而将tgf-β按浓度进行处理的结果，确认了，未用tgf-β处理的肾脏类器官生长良好，但用tgf-β处理的肾脏类器官出现了形态变异，生长不良。143.(b)对肾纤维化相关标志物acta2和col1a1进行qpcr分析的结果，确认了，随着处理的tgf-β的浓度增加，纤维化标志物mrna的表达成比例地增加。144.(c)通过免疫染色来确认了作为肾纤维化相关标志物的波形蛋白(vimentin)、胶原蛋白1型(collagen type 1，col1)和α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-sma)的表达。当用tgf-β对在7mg/ml kem中培养的肾脏类器官进行处理时，确认了在kem水凝胶收缩的同时诱发纤维化的类器官积聚成一块的现象。进行免疫染色的结果，确认了，在用tgf-β处理的肾脏类器官中所有纤维化标志物的表达有所增加，并且确认了，在基质胶和kem支架中的肾脏类器官都显示出相似的纤维化标志物表达状况。145.通过本实验，可以确认基于在kem水凝胶支架中培养的肾脏类器官制作肾纤维化疾病模型的可能性。146.脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质(kidney extracellular matrix,kem)支架的生物相容性的确认(图15)147.为了确认脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶支架是否适合作为用于肾脏类器官移植的材料，将5mg/ml的脱细胞肾脏组织衍生kem支架移植到小鼠皮下组织后，进行了组织学分析。为了确认在所移植的kem水凝胶支架内炎症细胞的浸润程度而进行了h&e染色，并且为了确认是否有因免疫反应而产生的肥大细胞(mast cell)，进行了甲苯胺蓝(toluidine blue)染色。分析结果，在移植kem水凝胶的部位未发现炎症相关细胞，由此确认了，当移植kem水凝胶时体内几乎不会诱发免疫反应或炎症反应。148.使用脱细胞肾脏组织衍生细胞外基质支架(kidney extracellular matrix,kem)的肾脏类器官体内移植的结果(图16、图17)149.为了确认脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶是否可以用作类器官移植材料，使用kem水凝胶将肾脏类器官移植到小鼠肾脏肾被膜(kidney capsule)上。为了确认所移植的细胞的植入(engraftment)和存在与否，使用了用dii荧光染料dye标记的肾脏类器官，并且为了调整水凝胶的粘度以提高移植到肾脏组织内的效率，将kem水凝胶以1:20(v/v)(kem：培养液组分)的比例混合并移植到体内。150.为了观察移植到体内的肾脏类器官的植入程度，在移植后的第4天获取肾脏组织并进行了组织学分析。其结果，如图16所示，在肾被膜的内侧确认了荧光信号的存在，因此确认了，所移植的类器官良好地被植入到组织中。151.为了确认脱细胞肾脏组织衍生kem水凝胶支架是否可以用作肾脏类器官移植用材料而进行了动物实验和组织学分析。为了诱发急性肾损伤(acute kidney injury，aki)模型，在小鼠腹腔内一次性地注射10mg/kg顺铂(cisplatin)药物，第二天，为了提高移植效率和植入，使用25μl的7mg/ml kem水凝胶将600～700个肾脏类器官移植到小鼠肾被膜上。在移植的第14天，获取各组小鼠的肾脏组织并进行了h&e染色和免疫染色分析。152.此外，在肾损伤动物模型中确认了肾脏类器官的体内移植的可能性(图17)。153.(a)进行h&e染色的结果，在未移植类器官的受损肾脏组织中广泛观察到作为急性肾损伤典型状况的急性肾小管坏死(acute tubular necrosis，atn)和充血(肾充血)部位。相反，在使用kem支架对肾脏类器官进行移植的情况下，确认了，肾脏类器官在受损肾脏组织的皮质部位植入良好，与未接受治疗的对照组肾脏组织相比，相对而言受损部位大幅减少。此外，为了确认作为急性肾损伤的症状之一的肾小球结构的收缩程度，对肾小球面积进行定量分析的结果，确认了，与未移植肾脏类器官的组织相比，移植了肾脏类器官的肾脏组织维持了损伤较小的肾小球结构。154.(b)为了确认各条件下作为急性肾损伤的主要症状之一的近曲小管的细胞凋亡程度，对作为近曲小管标志物的绒毛蛋白(villin)进行了免疫染色。其结果证实，与未移植类器官的受损肾脏组织相比，移植了类器官的肾脏组织中近曲小管的比例显著更高，因此，确认了，所移植的类器官植入到受损部位并实现了近曲小管的再生。155.通过本实验，确认了，kem水凝胶支架可以用作用于治疗肾脏疾病模型的类器官移植用材料，并且提高受损组织内类器官的植入效率，同时诱导肾脏结构恢复。156.本发明的上述描述是示例性的，对于本发明所属领域的普通技术人员来说可以理解，在不改变本发明的技术思想或必要特征的情况下，可以很容易地将其修改为其他具体形态。因此，应当理解，上述实施例在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。









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