一种基于中性粒细胞的骨髓靶向给药载体及应用 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于医药领域，涉及一种基于中性粒细胞的骨髓靶向给药载体及应用，是通过获得载药的骨髓靶向的中性粒细胞，及在制备抗肿瘤、抗菌、抗骨质疏松、抗炎等药物中的应用。背景技术：2.骨疾病，如骨癌、骨髓炎、骨质疏松和骨关节炎，在临床上很常见。但由于骨低血灌注的特性(血-骨髓屏障)([1]k.ramanlal chaudhari,a.kumar,v.k.megraj khandelwal,m.ukawala,a.s.manjappa,a.k.mishra,j.monkkonen,r.s.ramachandra murthy,bone metastasis targeting:a novel approach to reach bone using zoledronate anchored plga nanoparticle as carrier system loaded with docetaxel,journal of controlled release 158(3)(2012)470-478.)，骨疾病的治疗问题一直没有得到完全解决。因此，除非使用更高的剂量，否则很难获得给药后骨中的有效药物浓度，这反过来会导致毒副作用增加。为了解决这一难题，在过去的几十年里，人们广泛探索了很多不同大小粒径和组成的纳米载体来封装治疗药物以促进骨髓靶向，但这些纳米颗粒的骨髓靶向能力仍然很大的受到血-骨髓屏障的限制，且无法主动穿过血管内皮细胞进入骨髓。[0003]中性粒细胞是人体内最常见的白细胞，占人体循环白细胞的50-70％。骨髓中60％的祖细胞分化为嗜中性粒细胞。一般而言，成年人每天产生大约1000亿个中性粒细胞，为了保持体内平衡，必须定期更换相同数量的衰老细胞。因此，中性粒细胞的半衰期相对较短，约为19h，随后是衰老和凋亡。而中性粒细胞老化时，cxcr4升高，而cxcr2降低。在cxcr4/cxcl12信号的影响下，老龄中性粒细胞转移到骨髓凋亡([2]c.martin,p.c.burdon,g.bridger,j.c.gutierrez-ramos,t.j.williams,s.m.rankin,chemokines acting via cxcr2 and cxcr4 control the release of neutrophils from the bone marrow and their return following senescence,immunity 19(4)(2003)583-93.[3]j.wang,m.hossain,a.thanabalasuriar,m.gunzer,c.meininger,p.kubes,visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair,science 358(6359)(2017)111-116.[4]r.c.furze,s.m.rankin,neutrophil mobilization and clearance in the bone marrow,immunology 125(3)(2008)281-8.)。因此，可以借助中性粒细胞实现骨髓的药物靶向递送。技术实现要素：[0004]本发明的第一个目的是提供一种基于中性粒细胞的骨髓靶向给药载体，具体通过以下步骤实现：[0005](1)取小鼠骨髓或血液，首先用红细胞裂解液去除样本中的红细胞，然后，用percoll液配置密度梯度层，在离心管中，从下到上分别小心铺设78％，65％和55％的percoll溶液，在最上层加入待分选样本，以400g的离心力离心20分钟后，在78％和65％的密度层间小心吸取细胞，该层细胞即中性粒细胞。通过流式细胞术验证，分离得到的细胞表现为ly6g阳性，或者gr1和mair4双阳性的中性粒细胞；[0006](2)聚乳酸聚乙醇酸plga(分子量为10000-200000)与卡巴他赛溶解于二氯甲烷中，然后将二氯甲烷溶液快速加入2％的pva溶液中，用探头超声以30％的功率探超3分钟。接着，将得到的乳液缓慢加入0.2％的pva中，搅拌挥发以除去有机溶剂。冻干得到载药纳米粒；[0007](3)①通过中性粒细胞直接内吞纳米载体或药物的方式制备中性粒细胞给药载体：中性粒细胞在培养箱中，以无血清培养液中孵育1小时后，加入1mg/ml游离药物/载药纳米粒，继续培养1小时，然后离心除去未结合的游离药物/载药纳米粒，加入含血清的完全培养基，重悬后继续培养1-24小时，使中性粒细胞逐渐衰老，以获得骨髓靶向的中性粒细胞给药载体。②药物或纳米载体通过物理吸附或化学共价修饰的方式锚定在中性粒细胞表面以制备中性粒细胞给药载体：中性粒细胞在培养箱中，以无血清培养液中孵育1小时后，加入1mg/ml的修饰了马来酰亚胺等活性基团或特异性识别中性粒细胞表面抗原的抗体的药物/载药纳米粒，继续培养1小时，使药物/纳米粒与细胞表面的对应反应基团或抗原结合，然后离心除去未结合的游离药物/载药纳米粒，加入含血清的完全培养基，重悬后继续培养1-24小时，使中性粒细胞逐渐衰老，以获得骨髓靶向的中性粒细胞给药载体。[0008]本发明骨髓靶向的中性粒细胞给药载体为达到最佳的骨髓靶向效果，中性粒细胞在体外的培养时间是关键，可以将中性粒细胞在培养箱中继续培养1-24小时来增强，4-12小时培养时间为最佳时间，其处理的顺序可以为：(1)中性粒细胞先与药物/载药纳米粒孵育得到载药中性粒细胞，然后继续培养4-12小时骨髓靶向的中性粒细胞给药载体；(2)或中性粒细胞先在培养箱中孵育4-12小时，然后加入药物/载药纳米粒获得骨髓靶向的中性粒细胞给药载体。[0009]本发明中性粒细胞嫁接/内吞药物，根据表面活性分子或者受体的量决定纳米粒最大的嫁接程度，并且可以根据共孵育的浓度，调节中性粒细胞装载药物的量。其中，涉及的纳米载体包括但不限于plga纳米粒/微球、ps纳米粒/微球、脂质体/脂质纳米粒、乳剂、胶束、无机和金属纳米粒。[0010]本发明的第二个目的是提供所述给药载体在制备治疗骨相关疾病药物中的应用，所述骨相关疾病包括骨肿瘤及骨髓转移瘤、骨髓炎、骨髓细菌感染、骨质疏松、骨关节炎等。[0011]本发明利用中性粒细胞衰老后可以回到骨髓的特点，通过包载或嫁接抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗骨质疏松等药物，提高骨髓中相关药物的有效浓度，来治疗骨肿瘤及骨髓转移瘤、骨髓炎、骨髓细菌感染、骨质疏松、骨关节炎等骨相关疾病。[0012]目前骨髓靶向给药还存在很多问题，并且现阶段主要的改进方式是针对纳米粒的设计。但是，由于骨髓血液的低灌注性以及血-骨髓屏障的存在，需要一种全新机制的骨髓靶向给药载体。本发明提供的基于中性粒细胞的骨髓靶向给药载体，通过利用衰老中性粒细胞高表达的cxcr4，主动返回骨髓的特点，使药物搭中性粒细胞便车，有效穿过血管内皮细胞进入骨髓，使骨髓部位的药物浓度有效提高，从而提高了治疗效果。附图说明[0013]图1是卡巴他赛plga纳米粒的扫描电镜图。[0014]图2是中性粒细胞纯度鉴定图。[0015]图3是吞噬了纳米粒的中性粒细胞的电镜图。[0016]图4是吞噬了纳米粒的中性粒细胞的荧光成像图。[0017]图5是纳米粒子的孵育浓度对中性粒细胞摄取的影响。[0018]图6是包裹载卡巴他赛plga纳米粒的中性粒细胞的生物分布。[0019]图7是包裹载卡巴他赛plga纳米粒的中性粒细胞的骨髓中药物含量。[0020]图8是包裹载卡巴他赛plga纳米粒的中性粒细胞对乳腺癌骨转移瘤的治疗效果。[0021]图9是包裹载特立帕肽plga纳米粒的中性粒细胞的体内分布的荧光图像。[0022]图10是包裹载特立帕肽plga纳米粒的中性粒细胞对骨质疏松的治疗效果。[0023]图11是包裹18f-fdg游离药物的中性粒细胞的骨髓靶向性验证。[0024]图12是主要炎性因子il-6浓度的elisa检测结果。具体实施方式[0025]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。[0026]实施例1包裹载卡巴他赛plga纳米粒的中性粒细胞的骨髓靶向给药载体的构建和评价精密称取plga和卡巴他赛溶解于二氯甲烷中。然后将二氯甲烷溶液快速加入2％的pva溶液中，用探头超声以30％的功率探超4min。接着，将得到的乳液缓慢加入0.2％的pva中，搅拌挥发以除去有机溶剂。冻干得到载药纳米粒；[0027]取小鼠骨髓或血液，首先用红细胞裂解液去除样本中的红细胞。然后，用percoll液配置密度梯度层，在离心管中，从下到上分别小心铺设78％，65％和55％的percoll溶液，在最上层加入待分选样本。以400g的离心力离心20分钟后，在78％和65％的密度层间小心吸取细胞并验证中性粒细胞的纯度。[0028]中性粒细胞在培养箱中，以无血清培养液中孵育1小时后，加入1mg/ml载药纳米粒,继续培养1小时，然后离心除去未结合的游离纳米粒。加入含血清的培养液，重悬后继续在37度细胞培养箱培养3小时，以获得载药的骨髓靶向的中性粒细胞。[0029]载卡巴他赛plga纳米粒(ctx-nps)的形态确证：采用扫描电镜对ctx-nps的形态进行确证(图1)。显示，纳米粒表面光滑，粒径均一。[0030]中性粒细胞的纯度确证：采用流式细胞术检测获得细胞中的中性粒细胞的纯度，用anti fitc-gr1和anti pe-mair4对细胞染色，结果显示，中性粒细胞的浓度超过90％(图2)。[0031]包裹载卡巴他赛plga纳米粒的中性粒细胞(ctx-nps@ne)的确证：采用透射电镜对ctx-nps@ne的形态进行确证(图3)。局部放大图中，箭头所指部位即为被中性粒细胞吞噬的纳米粒。用共聚焦显微镜对ctx-nps@ne的成功制备再次确证。分别标记中性粒细胞的细胞核、细胞膜和纳米粒，在共聚焦下，纳米粒的荧光进入到中性粒细胞内部，表明ctx-nps@ne的成功制备(图4)。[0032]纳米粒的浓度会影响中性粒细胞的摄取量，为此我们用did标记了纳米粒，考察不同纳米粒浓度对中性粒细胞摄取的影响。在相同孵育时间下，更高浓度的纳米粒可以使中性粒细胞的荧光强度更高，表明中性粒细胞摄取了更多的纳米粒。1mg/ml的纳米粒浓度可以使约94.6％的中性粒细胞摄取纳米粒(图5)。[0033]包裹载卡巴他赛plga纳米粒的中性粒细胞体内分布和骨髓靶向验证：用dir标记ctx-nps和ctx-nps@nes，分别回输到体内。12小时后，处死小鼠，将主要脏器和骨架用小动物成像系统观察荧光分布。结果显示，与游离的纳米粒相比，中性粒细胞包载的纳米粒减少了肝脏的分布，而增加了在骨髓的分布(图6)。[0034]包裹载卡巴他赛plga纳米粒的中性粒细胞提高骨髓中卡巴他赛浓度的验证：分别将等药物浓度的卡巴他赛游离药(ctx)，卡巴他赛的plga纳米粒(ctx-nps)和包裹载卡巴他赛plga纳米粒的中性粒细胞(ctx-nps@nes)通过尾静脉回输到体内。在6小时，24小时和48小时，分别处死小鼠，提取骨髓，通过高效液相色谱(hplc)测定药物的含量。结果显示，ctx-nps@nes组的小鼠卡巴他赛在骨髓中的浓度相比于其他两组显著提高(图7)。[0035]体内抗骨髓转移瘤效果：通过骨髓腔内接种luciferase转染的4t1-luc乳腺癌肿瘤细胞。设置saline组，ctx游离药组，ctx-nps组，单独的中性粒细胞nes组，ctx-nps@nes组，具体给药方式见图8的a。隔天测量小鼠的腿围，并每周通过生物发光成像记录小鼠的肿瘤生长情况。结果显示，ctx-nps组的肿瘤被显著抑制(图8)。治疗结束后，处死小鼠，用micro ct观测小鼠的腿骨情况，结果显示只有ctx-nps@nes组中的小鼠腿骨形态相对保持完整，并且骨密度下降较少。[0036]实施例2包裹载特立帕肽plga纳米粒的中性粒细胞(pth-nps@nes)的骨髓靶向给药载体的构建和评价精密称取特立帕肽溶于50ul水中，然后再精密称取plga溶解在500ul左右的二氯甲烷中，用探头超声以30％的功率探超3分钟，然后加入2-5ml 2％的pva溶液。继续用探头超声以30％的功率探超4分钟。接着，将得到的乳液缓慢加入0.2％的pva中，搅拌挥发以除去有机溶剂。冻干得到载药纳米粒。按照实施例1的方法获取中性粒细胞，并得到包裹载特立帕肽plga纳米粒的中性粒细胞(pth-nps@nes)。[0037]包裹载特立帕肽plga纳米粒的中性粒细胞体内分布和骨髓靶向验证：用dir标记pth-nps和pth-nps@nes，分别回输到体内。12小时后，处死小鼠，将主要肝脏、脾脏和骨髓收集并研磨成单细胞悬液，在荧光倒置显微镜下观察各脏器中荧光的信号。结果显示，与游离的纳米粒相比，中性粒细胞包载的纳米粒减少了肝脏的分布，而增加了在骨髓、脾脏的分布(图9)。[0038]体内抗骨质疏松效果：提前50天通过卵巢摘除术将3月龄的c57雌鼠去势，然后按照图10a中的方式分成假手术组(sham)，手术后不治疗组(ovx)，特立帕肽游离药组(pth)，特立帕肽的plga纳米粒组(pth-nps)和包裹载特立帕肽plga纳米粒的中性粒细胞组(pth-nps@nes)，并给药。经过70天的治疗，小鼠被处死，血液中的钙离子，骨钙素(ocn)和camp的浓度被检测，pth-nps@nes组表现出最好的治疗效果(图10)。接着，将小鼠的腿骨用micro ct观测，结果显示只有ctx-nps@nes组中的小鼠骨小梁恢复到正常小鼠腿骨骨小梁情况，包括骨密度(bmd)，bv/tv和tb.sp指标的正常化。[0039]实施例3递送18f-fdg的游离药物的中性粒细胞骨髓靶向给药载体的体内分布pet/ct成像验证将中性粒细胞在不含葡萄糖的培养液中2-3小时。然后，离心收集细胞，以107/ml的密度加入10mci/ml 18f-fdg在培养箱中继续孵育1小时。孵育结束后离心，用pbs洗去游离的18f-fdg。将标记好的细胞回输到小鼠体内用小动物pet/ct扫描仪观测18f-fdg标记的中性粒细胞回输2小时和6小时后的体内放射性信号分布情况。结果显示，在2小时时，已经有不少中性粒细胞携带fdg药物进入骨髓，由6小时结果可以看到进入骨髓的药物的量还在不断增加。并且，相比于在体外培养24小时的细胞，在体外培养6小时的细胞有更好的靶向效果(图11)。[0040]实施例4包裹载地塞米松乳剂的中性粒细胞的骨髓靶向给药载体的构建精密称取卵磷脂e80，中链脂肪酸mct，维生素e以质量浓度5:5:1的比例溶解在200ul无水乙醇中,然后加入质量分数为总脂质含量5％的地塞米松，水浴超声至所有药物均完全溶解。将2ml水缓慢滴加入乙醇相中，并伴随着强力的磁力搅拌，获得初乳。将该初乳在探头超声下以40％的功率探超4分钟，获得载地塞米松的精制乳。将骨髓或血液中细胞离心后用1ml pbs重悬，然后加入10ul anti ly6g在37度培养箱中孵育20分钟。清洗掉游离的抗体后，通过流式分选出中性粒细胞。将获得的中性粒细胞在37度细胞培养箱中继续培养4小时，然后与1mg/ml的地塞米松乳剂共孵育1小时。离心，去除游离的乳剂，获得包裹载地塞米松乳剂的骨髓靶向中性粒细胞。[0041]将小鼠骨髓腔内注射lps造骨髓炎模型，然后将小鼠分成saline组，地塞米松游离药组，地塞米松乳剂组和包裹载地塞米松乳剂的中性粒细胞组。给药后三天，处死小鼠，提取骨髓，用elisa试剂盒检测il-6的浓度。结果显示，包裹载地塞米松乳剂的中性粒细胞组小鼠的il-6浓度快速下降，表明急性炎症得到缓解(图12)。[0042]实施例5嫁接金纳米粒的中性粒细胞的骨髓靶向给药载体的构建将1mg/ml的粒径为30-200nm的金纳米粒与1mg/ml biotin-peg-sh反应过夜，然后通过15000转离心30分钟，洗去未反应的分子。接着加入过量的链霉亲和素，搅拌两小时后，以同样的转速离心除去未反应生的链霉亲和素。将提取好的中性粒细胞与dspe-peg-biotin孵育4小时，使中性粒细胞表面标记上生物素。然后，将反应得到的产物和生物素标记的中性粒细胞在37度细胞培养箱中共孵育1小时后，离心，除去游离的金纳米粒。将嫁接了载体的细胞回输到体内。[0043]实施例6嫁接紫杉醇脂质体的中性粒细胞的骨髓靶向给药载体的构建通过薄膜分散法制备紫杉醇脂质体。具体来讲精密称取卵磷脂e80，胆固醇chol和dspe-peg-mal以质量比10：2：1的比例加入到三氯甲烷中，接着精密称取脂质质量分数5％的紫杉醇溶于其中。在30摄氏度下，用真空旋转蒸发仪除去三氯甲烷。加入1ml水，重新分散脂质，然后用探头超声以25％的功率探超3分钟，获得均一的修饰的紫杉醇脂质体。[0044]在无血清条件下，将紫杉醇脂质体与获取的中性粒细胞共孵育一小时，每隔十分钟用移液枪吹匀培养液，以帮助脂质体表面修饰的马来酰亚胺基团与中性粒细胞表面游离的巯基相连。离心，去除游离的脂质体。将嫁接有紫杉醇脂质体的中性粒细胞在培养箱中继续培养4小时，以获得骨髓靶向的载药中性粒细胞。[0045]实施例7嫁接吲哚美辛的骨靶向中性粒细胞的构建将吲哚美辛nhs活性酯与提取的中性粒细胞在ph＝6.8的pbs溶液中共孵育2小时，然后离心去除游离的吲哚美辛，继续在37度细胞培养箱中培养10小时，然后回输到体内，待中性粒细胞走向衰老，携带药物进入骨髓。









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