一种近红外小分子荧光探针及其制备方法和应用 专利技术说明

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明涉及生物医学成像领域，具体涉及一种近红外小分子荧光探针及其制备方法和应用。背景技术：2.慢性伤口愈合仍然是一个全球性的挑战，是不可忽视的主要和常见的公共卫生问题之一。此外，慢性伤口愈合是一个复杂的生理过程，由四个主要阶段组成：止血、炎症、增殖和重塑。然而，外部因素或一些疾病(破坏性刺激、糖尿病)的影响可能会干扰伤口愈合，导致整个皮肤组织的结构和功能再生受损，进而可能导致严重残疾，甚至增加死亡率。因此，监测伤口愈合过程中的生理参数变化对于了解伤口愈合的状态和生理过程至关重要，这有助于识别伤口感染和后续治疗。中性粒细胞的过度浸润似乎是慢性伤口愈合的罪魁祸首和生物标志物之一。中性粒细胞中丰富的ros参与了伤口愈合的所有阶段。过量的ros会引起氧化应激，对伤口愈合产生不利影响，阻碍新组织的形成。相反，在慢性伤口中，生长因子的产生经常会增加。双氧水(h2o2)在生理过程中起着很好的作用，如细胞的生长、增殖和分化，免疫细胞的激活，以及血管的重塑。因此，在伤口愈合过程中，实时监测h2o2的动态变化和愈合状态至关重要，这可以更好地了解h2o2在伤口愈合中的作用机制。3.视觉观察是对慢性伤口进行初步诊断的最简单和最通用的手段。然而，这样的诊断不仅依赖于一定的专业知识，而且不能预测治疗的效果和愈合的阶段，这使得诊断具有一定的猜测性。荧光检测和成像被认为是一种强大的生物标本方法，因为它具有非侵入性、极大的敏感性和高的时空分辨率。与可见光区的荧光探针相比，近红外(nir)荧光探针可以减少某些背景干扰和光损伤。此外，它拥有更深的穿透组织的能力，更适用于组织或体内成像。大斯托克斯移位的探针可以有效地避免假阳性信号，以最大限度地减少激发源和荧光发射之间的串扰。因此，开发一种拥有大的斯克拖拉位移的近红外小分子荧光探针对于监测慢性伤口愈合过程中的h2o2水平至关重要。技术实现要素：4.本发明提供的一种近红外小分子荧光探针及其制备方法和应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。5.为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：6.本发明所述近红外小分子荧光探针主要以双氰胺-甲基苯并吡喃作为近红外的发光团，以五氟苯磺酰酯作为响应基团，对h2o2做出特异性的响应。双氰胺-甲基苯并吡喃的引入，使得探针拥有大的斯克拖拉位移，有效地避免了光谱重叠。本发明中的近红外小分子荧光探针合成步骤简便，具有优异的光谱特性以及良好的生物相容性，便于用于生物组织的检测或成像。7.本发明所述的近红外小分子荧光探针中，双氰胺-甲基苯并吡喃为荧光团，五氟苯磺酰酯为荧光响应的分子。8.作为本发明的其中一个优选实施例，荧光响应分子选自五氟苯磺酰氯分子。9.本发明还提供了一种上述的近红外小分子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：10.s1：将2-羟基苯甲醛加入到含有乙酸乙酯的圆底烧瓶中，然后加入金属钠，室温搅拌18h，加入甲醇使金属钠反应完全，然后滴加盐酸，用乙酸乙酯萃取，去除溶剂后得到黄色固体。11.s2：将s1中得到的化合物和盐酸加入含有甲醇的圆底烧瓶中，加热回流4小时，纯化，得到白色固体。12.s3：将s2中得到的白色固体和丙二腈溶解在乙酸酐中，将混合物回流14小时，然后在真空中蒸发溶剂，将去离子水加入残渣中，回流0.5h，然后用二氯甲烷提取。硅胶柱层析纯化，得到橙色固体。13.s4：在惰性氛围中，将s3中得到的橙色固体和n-(4-甲酰苯基)乙酰胺(0.25g,2mmol)加入到乙腈中，加入哌啶和冰醋酸回流4h，得到的固体用冰的二氯甲烷洗涤，得到棕色固体。14.s5：将s4中获得的化合物溶解于无水四氢呋喃中，在惰性氛围中加入二甲氨基吡啶，在-10℃搅拌20min，滴加五氟苯磺酰氯，室温搅拌过夜，过滤，得到近红外小分子荧光探针。15.本发明的另一个目的是提供上述的近红外小分子荧光探针在生物医学成像中的应用。16.优选的，所述生物医学成像为在细胞水平成像或在动物模型水平成像。17.其中，所述细胞水平成像包括如下步骤：18.(1)将巨噬细胞raw264.7与近红外小分子荧光探针溶液共孵育，使探针上的小分子与不同刺激条件下的巨噬细胞的氧化胁迫产物进行特异性响应；19.(2)用激光共聚焦荧光显微镜对细胞进行荧光成像。20.所述动物模型水平成像包括以下步骤：21.(1)构建烫伤和割伤小鼠模型研究创面愈合过程；22.(2)对烫伤和割伤小鼠表面进行注射微量近红外小分子探针溶液；23.(3)使用激光共聚焦显微镜对实验动物的伤口部位进行荧光成像并对成像结果进行分析。24.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：25.本发明提供的近红外小分子荧光探针主要以双氰胺-甲基苯并吡喃作为近红外的发光团，以五氟苯磺酰酯作为响应基团，对h2o2做出特异性的响应。双氰胺-甲基苯并吡喃的引入，使得探针拥有大的斯克拖拉位移，有效地避免了光谱重叠，此外，对组织的穿透能力有多提高。本发明中的近红外小分子荧光探针合成步骤简便，具有优异的光谱特性以及良好的生物相容性，便于用于生物组织的检测或成像。附图说明26.图1为本发明提供的近红外小分子荧光探针的结构示意图及响应机制。27.图2为本发明实例2所制备的近红外小分子荧光探针的核磁氢谱图。28.图3为本发明实例2所制备的近红外小分子荧光探针的荧光光谱图。29.图4为本发明实例3用于检测内源性的h2o2的激光共聚焦荧光成像图。raw264.7用1μg/ml脂多糖(lps)和山梨醇-12-肉豆蔻-13-醋酸(pma)与共孵育后，加入探针处理30分钟。然后，用pbs缓冲液清洗三次，图中标尺为50μm。30.图5为本发明在烫伤动物模型伤口愈合过程中的荧光成像结果图。31.图6为本发明在割伤动物模型伤口愈合过程中的荧光成像结果图。具体实施方式32.下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。33.实施例1近红外小分子荧光探针的合成34.选择五氟苯磺酰酯分子作为荧光响应分子，双氰胺-甲基苯并吡喃作为近红外的发光团，通过有机合成方法成功制备了h2o2特异性响应的近红外小分子荧光探针。具体方法如下所述：35.将获得的荧光团(双氰胺-甲基苯并吡喃)溶解于无水四氢呋喃中，在惰性氛围中加入二甲氨基吡啶。在-10℃搅拌20min，滴加五氟苯磺酰氯，室温搅拌过夜，过滤，得到近红外小分子荧光探针。近红外小分子荧光探针的结构示意图及响应机制如图1所示。36.实施例2近红外小分子荧光探针的制备37.将所得的近红外小分子荧光探针溶于dmso，制备得到1mmol/l探针标准溶液，并储存于4oc冰箱备用。加入不同的h2o2,观察信号强度的变化，探针的最终浓度为10μm。近红外小分子荧光探针的核磁氢谱图和荧光光谱图分别如图2、3所示。38.实施例3近红外小分子荧光探针在细胞水平成像上用于h2o2的检测中的应用39.将实施例2中制备的近红外小分子荧光探针溶pbs缓冲溶液中(ph＝7.4,pbs:dmso＝7:3)，选用巨噬细胞raw264.7作为研究对象，观察近红外小分子荧光探针选择性检测细胞内h2o2的能力。40.细胞在含有近红外小分子荧光探针的培养液中培养0.5小时。然后去除培养液，用pbs清洗细胞三次，以去除未结合的探针。细胞内反应设置了4组。41.a)没有任何后续处理的对照组42.b)1μg/ml脂多糖(lps)和50ng/ml干扰素-γ(ifn-γ)加入到有培养细胞的1ml培养基中4小时，然后用10nmol/l的山梨醇-12-肉豆蔻-13-醋酸(pma)刺激3小时。43.c)用一种活性氧的清除剂(n-乙酰半胱氨酸，nac，1mmol/l)预处理后，用lps(1μg/ml)和ifn-γ(50ng/ml)培养细胞4小时，然后用pma(10nmol/l)刺激0.5小时。44.d)用一种no的抑制剂(l-name，5mm)预处理后，用lps(1μg/ml)和ifn-γ(50ng/ml)培养细胞4小时，然后用pma(10nmol/l)刺激0.5小时。45.综上，构建的高灵敏近红外小分子荧光探针能够实现细胞中h2o2水平的监测。46.实施例4表近红外小分子荧光探针在动物模型水平成像中的应用47.选择正常小鼠：小鼠先用浓度3％的戊巴比妥麻醉，采用10μl/g的剂量腹腔注射。待小鼠麻醉后，用宠物剃毛刀将其背部毛剔除，露出背部皮肤。对于割伤小鼠，我们在小鼠背部构建了一个长约3厘米、深约0.3厘米的伤口。为了促进伤口的愈合，避免小鼠活动造成的二次伤害，我们对伤口进行了缝合。对于烫伤的小鼠，我们用消毒过的金属棒处理小鼠的背部，并建立相关的烧伤模型。创伤手术均在spf级环境中进行。48.在不同的时间点分别进行活体伤口荧光成像，皮肤组织进行he、masson和免疫组织化学染色。利用激光共聚焦荧光显微镜对不同组小鼠进行荧光成像，激发波长为561nm。其结果如图5和图6所示。49.在以上实施例所制备的近红外小分子荧光探针中，通过监测伤口愈合过程中h2o2的变化，可实现对对不同治疗组的疗效进行评估和指导的可视化分析。不仅可以用来阐明慢性伤口延迟愈合的机制，也可以用来验证新药物和治疗方法的疗效。50.以上所述仅为本发明一部分实例，而不是全部实例。对于本发明的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实例。基于本发明的实例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实例，都属于本发明保护的范围。









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