用于预防和治疗幽门螺杆菌感染的草药制剂的制作方法 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本技术涉及具有特定化学组成的草药制剂的治疗应用，所述草药制剂通过混合来自香薄荷属(satureja l.)、牛至属(origanum l.)和百里香属(thymus l)的两种或更多种精油获得，以制备成功根除致病菌的食品补充剂或药物。更具体地，本技术涉及这种草药制剂在制备成功根除人类的幽门螺杆菌(h.pylori)的食品补充剂或药物的用途。背景技术：2.幽门螺杆菌存在于人的胃中，可诱发许多严重的胃肠道疾病，如胃炎、消化性溃疡和十二指肠溃疡以及胃癌。世界卫生组织(who)指出，全球约有50％的人口感染幽门螺杆菌，发达国家(25％至50％)和发展中国家(70％至90％)的患病率不同。尽管大多数患者从未出现过疾病症状，但相当高比例的所感染的受试者会发展为消化性溃疡(约10％至20％)，这些患者中有四分之一(约4.25％)会出现严重的溃疡并发症，而1-2％会发展成胃癌。胃癌是世界上癌症相关死亡的第二大常见原因(kusters et al.(2006)pathogenesis of h.pylori infection.clin microbiol rev 19:449–490)。相应地，幽门螺杆菌于1994年被世界卫生组织宣布为人类致癌物。甚至，由于幽门螺杆菌感染，全球约有5亿人迟早会患上严重的胃病，即消化性溃疡，约有3000万人可能发展为胃癌。3.非常需要实现根除来自胃粘膜的幽门螺杆菌。为此，已使用多种抗生素疗法：阿莫西林、四环素、甲硝唑、呋喃唑酮、左旋氟沙星和克拉霉素(wannmacher(2011)review of the evidence for h.pylori treatment regimens,18th expert committee on the selection and use of essential medicines)。目前，除了辅助药物外，幽门螺杆菌感染的疗法包括高剂量的三到四种不同的抗生素。然而，这种疗法表现出高度有限的功效，主要是由于幽门螺杆菌的抗生素耐药菌株的出现极为频繁。例如：使用克拉霉素和阿莫西林/甲硝唑与质子泵抑制剂(ppi)的三联疗法显示成功率为84％和76％，而由ppi、铋、甲硝唑和四环素组成的四联疗法显示成功率为87％。由于甚至有20％的幽门螺杆菌感染患者在完成抗生素治疗的第一疗程后仍未痊愈，因此需要额外的治疗周期。因此，世界卫生组织将幽门螺杆菌列入由70位世界领先专家于2017年制定的“指导新抗生素的研究、发现和开发的抗生素耐药菌全球优先清单”。此外，所有提及的治疗往往与患者难以忍受的严重胃肠道副作用有关，例如腹泻、恶心、呕吐、腹胀和腹痛。4.此外，已经提出了几种基于微生物、肽、多糖和胃内紫光照射的根除人类幽门螺杆菌感染的替代疗法，但未能有效根除细菌(ayala et al.(2014)exploring alternative treatment for helicobacter pylori infection,word jgastroenterol 20(6):1450-1469)。此外，最近的疫苗研究证实，尚未发现有希望的候选疫苗(sutton&boag(2019)status of vaccine research and development for helicobacter pylori,vaccine 37:7295-7299)。5.益生菌和一些植物性膳食补充剂用于预防或减少一些抗生素治疗的副作用。然而，没有市售的膳食补充剂或其他草药产品经人体测试具有抗幽门螺杆菌活性、改善对抗生素的治疗反应或预防人类幽门螺杆菌感染的复发。6.从芳香植物中提取的精油是众所周知的抗多种细菌菌株的抗微生物剂。精油是挥发性有机化合物(主要是萜烯和苯基丙烷)的复杂混合物，其通过水蒸馏或蒸汽蒸馏从芳香植物中获得。来自一种芳香植物的精油可以包含数百种不同的成分。特定植物物种的精油的化学组成在定性和定量方面都是高度可变的。造成这种可变性的因素有多种，例如：与植物相关的内在因素、植物与环境的相互作用(土壤类型和气候等)、植物的成熟度、选择用于精油分离的植物器官、白天中的收获时间和与提取方法相关的外在因素。精油的抗微生物潜力高度依赖它的化学组成。相应地，不确定其化学成分，就不能声称来自特定植物的精油的抗微生物活性的强度。因此，在研究特定精油的潜在应用时，应定义每个精油样品的化学组成。7.一些精油在体外生物测定中表现出抗微生物活性，甚至可以抵抗多重耐药性幽门螺杆菌菌株(martin&ernst(2003)herbal medicines for treatment of bacterial infections:a review of controlled clinical trials.j antimicrob chemother51:241-246；ohno et al.(2003)antimicrobial activity of essential oils against helicobacter pylori.helicobacter 8:207–215；takeuchi et al.(2014)natural products and food components with anti-helicobacter pylori activities,world jgastroenterol 20:8971-8978)。8.有大量关于从来自香薄荷属、牛至属和百里香属的物种中获得的精油的抗幽门螺杆菌活性的体外证据。9.例如，satureja bachtiarica、冬季香薄荷(satureja montana)和夏季香薄荷(satureja hortensis)的精油在体外表现出高抗幽门螺杆菌活性(bergonzelli etal.(2003)essential oils as components of a diet-based approach to management of helicobacter infection.antimicrob agents chemother 47:3240–324；falsafi etal.(2015)chemical composition and anti-helicobacter pylori effect of satureja bachtiarica bunge essential oil.phytomed 22:173-177；lesjak et al.(2016):binary and tertiary mixtures of satureja hortensis and origanum vulgare essential oils as potent antimicrobial agents against helicobacter pylori.phytother res 30:476-484)。10.从牛至(origanum vulgare)中获得的精油在体外生物测定中显示出抗幽门螺杆菌活性(bergonzelli et al.(2003)essential oils as components of adiet-based approach to management of helicobacter infection.antimicrob agents chemother 47:3240–324)。还证明了牛至精油的主要成分香芹酚在体外显示抗幽门螺杆菌菌株的杀菌活性(marinelli et al.(2018)carvacrol and its derivatives as antibacterial agents.phytochem rev 17:903-921；ruiz-rico et al.(2020)in vitro antimicrobial activity of immobilised essential oil components against helicobacter pylori.world j microbiol biotechnol 36:3-9)。11.已经证明，百里香(thymus vulgaris)精油对幽门螺杆菌具有抗菌作用(esmaeili et al.(2012):anti-helicobacter pylori activities of soya powder and essential oils of thymus vulgaris and eucalyptus globulus.open microbiol j6:65-69)。还有一些其他百里香物种表现出抗幽门螺杆菌活性(dandlen et al.(2011):antimicrobial activity,cytotoxicity and intracellular growth inhibition of portuguese thymus essential oils.rev.bras.farmacogn 21:1012-1024)。此外，百里香精油的主要成分百里酚在体外对幽门螺杆菌菌株显示出高杀菌活性(korona-glowniak et al.(2020)the in vitro activity of essential oils against helicobacter pylori growth and urease activity.molecules 25:1-15)。12.此外，已经表明，百里香精油中大量存在的环状烃对伞花烃和夏季香薄荷精油中大量存在的γ-松油烯对革兰氏阴性菌没有抗菌活性(korona-glowniak et al.(2020)the in vitro activity of essential oils against helicobacter pylori growth and urease activity.molecules 25:1-15)。然而，据报道，一些没有抗菌活性的化合物在其他抗微生物剂的存在下显示出协同作用。例如，精油中对伞花烃和香芹酚的存在可能会增强油的抗微生物活性(ultee et al.(2002)the phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the food-borne pathogen bacillus cereus.appl environ microbiol68:1561–1568)。13.此外，精油的混合物，特别是夏季香薄荷、希腊牛至(origanum vulgare subsp.hirtum)和希腊牛至精油的二元和三元混合物相比混合物中每种单一油的活性更有效(lesjak et al.(2016):binary and tertiary mixtures of satureja hortensis and origanum vulgare essential oils as potent antimicrobial agents against helicobacter pylori.phytother res 30:476-484)。14.关于实验动物的体内证据，证明了夏季香薄荷和希腊牛至精油的混合物在不使用抗生素的情况下成功地根除了70％的小鼠的幽门螺杆菌，同时没有表现出毒性或改变细胞因子和趋化因子平衡(harmati et al.(2017):binary mixture of satureja hortensis and origanum vulgare subsp.hirtum essential oils:in vivo therapeutic efficiency against helicobacter pylori infection.helicobacter e12350)。15.然而，现有技术中没有对人类进行的研究，目的是评估从香薄荷属(satureja sp.)、牛至属(origanum sp.)和百里香属(thymus sp.)获得的精油，它们的混合物，或从这些油中分离出的纯化合物，用于根除幽门螺杆菌的治疗功效。16.上述简要综述清楚地说明了寻找新疗法以根除人类幽门螺杆菌感染的巨大需求以及建议对抗这种细菌的各种方法。17.技术问题18.本技术的目的是提供一种包含精油混合物的具有确定化学特征的草药制剂，其在根除人类幽门螺杆菌感染方面高度有效。19.本技术的第二个目的是提供一种制备所述草药制剂的方法。20.本技术的第三个目的是建立用草药制剂治疗确诊幽门螺杆菌感染的患者的剂量方案，其从胃粘膜成功地根除幽门螺杆菌。21.本技术的第四个目的是在不使用任何已知药物或抗生素的情况下建立用草药制剂从胃粘膜根除幽门螺杆菌的治疗方法。22.本技术的第五个目的是建立用草药制剂从胃粘膜根除幽门螺杆菌的治疗方法，它不会引起任何不希望的副作用，例如腹泻、恶心、呕吐、腹胀和腹痛，这些对于标准抗生素疗法非常常见。23.发明的公开内容24.本技术是草药制剂(特殊的精油混合物)作为食品补充剂或药物用于预防和治疗人类幽门螺杆菌感染的应用。所述混合物的特征在于，存在以下量的4种主要化合物：约35％至约50％的香芹酚、约10％至约30％的γ-松油烯、约10％至约25％的百里酚、约8％至约20％的对伞花烃，以gc/ms色谱图中总峰面积的百分比表示。所述混合物可以通过混合来自香薄荷属(satureja l.)、牛至属(origanum l.)和百里香属(thymus l)的物种的两种或更多种精油获得。可以将混合物置于液体或固体载体上并装入非耐胃液胶囊中。如本技术中所公开的制剂适合用作治疗幽门螺杆菌感染的食品补充剂或草药。本技术还公开了从人类胃粘膜成功根除幽门螺杆菌的剂量方案。25.制剂(精油混合物)的获得方法：26.本技术的草药制剂必须具有特定的化学特性才能实现高抗幽门螺杆菌活性。其特征在于存在四种主要化合物：约35％至约50％的香芹酚、约10％至约30％的γ-松油烯、约10％至约25％的百里酚、约8％至约20％的对伞花烃。量以通过具有质谱检测的气相色谱法(gc-ms)获得的色谱图中所有峰的总面积的百分比表示。此外，所述制剂可以包含少量化合物，例如α-松油烯、反式-β-石竹烯、α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、芳樟醇、1,8-桉叶油醇和柠檬烯，各占0.1至3％(以gc-ms色谱图中所有峰的总面积的百分比表示)。制剂中任何其他成分的含量最高可达0.4％。优选地，制剂的组成(以色谱图中所有峰的总面积的百分比表示)应该是：约38％至约48％的香芹酚、约18％至约28％的γ-松油烯、约10％至约12％的百里酚、9％至约14％的对伞花烃，以及α-松油烯、反式-β-石竹烯、α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、芳樟醇、1,8-桉叶油醇和柠檬烯，各占0.4％至2.9％。具有以下确切组成的制剂获得了对幽门螺杆菌的最高效果(以色谱图中所有峰的总面积的百分比表示)：47.5％的香芹酚、18.5％的γ-松油烯、11.9％的百里酚、13.6％的对伞花烃，1.55％的α-松油烯、1.49％的反式-β-石竹烯、1.24％的芳樟醇、0.99％的α-蒎烯、0.97％的β-月桂烯、0.55％的1,8-桉叶油醇、0.46％的柠檬烯和0.40％的β-蒎烯。27.根据本技术的制剂可以通过混合两种或更多种精油获得，优选通过水蒸馏获得，所述精油来自以下植物：香薄荷种、牛至种和百里香种。这些植物通常被用作香料或茶。更重要的是，这些精油通常被美国食品和药物管理局(fda)认定为安全(gras)物质，并且已被欧盟委员会接受用作为食品的调味剂。28.优选地，本技术的草药制剂可以通过按比例2:1:1混合夏季香薄荷(satureja hortensis l.)、希腊牛至(origanum vulgare subsp.hirtum l.)和百里香属(thymus vulgaris l.)的精油。因为精油的化学特征变化很大，主要是由于各种生态因素、芳香植物的栽培方法和分离方法，用于获得本技术草药制剂的各种精油的优选化学组成在下表中给出：29.表：用于制备混合物的各种精油的化学组成(占总峰面积的百分比)，由gc-ms确定[0030][0031]al——算术保留指数；a丰度》1％的化合物用粗体表示[0032]本技术中公开的精油从夏季香薄荷、希腊牛至和百里香属的植物物种获得。植物材料在开花期收集，在25-30℃下风干后，在搅拌机中磨碎。根据ph.eur.iv(欧洲药典，2002年)的程序通过水蒸馏在ciavenger装置中分离精油。简言之，将100g植物材料用水轻拍并蒸馏持续3小时。冷却后，从ciavenger装置中取出纯精油，用无水硫酸钠干燥。通过布氏漏斗过滤去除硫酸盐后，收集精油并在-20℃储存直至使用。将获得的夏季香薄荷、希腊牛至和百里香属的精油按比例2:1:1混合，以得到本技术的草药制剂，进一步用于治疗幽门螺杆菌感染的人类志愿者。[0033]本技术的潜在应用：[0034]根据本技术的草药制剂可以作为食品补充剂或草药用于治疗或预防幽门螺杆菌感染。如果它被用作药物，它可以单独应用或与标准抗生素疗法联合应用。制剂(精油的特定混合物)可以置于液体或固体载体上并装入明胶胶囊中。每个胶囊必须含有至少50mg的制剂，优选65mg的制剂。[0035]本技术的草药制剂抗幽门螺杆菌的功效已通过体外和体内研究得到证明。[0036]本技术的草药制剂针对20种幽门螺杆菌临床菌株进行了测试，菌株分为4个不同的群体，包括hpeurope(欧洲)、hpeasia(东亚)、hpasia2(印度)和hpafrical(非洲)。大多数菌株对多种抗生素具有耐药性。使用琼脂稀释法进行测试。最小抑制活性(mic)被确定为完全抑制幽门螺杆菌生长所需的最低组合物浓度。最小杀菌浓度(mbc)由活菌落计数确定，产品的杀菌效果表示为与未处理对照相比细菌菌落计数减少的百分比。结果证实，制剂在相同活性水平下对不同的抗生素耐药性幽门螺杆菌菌株具有活性，这意味着本技术的制剂对特定类型的幽门螺杆菌没有选择性，并且制剂没有特定的细胞靶标。也就是说，精油是大量亲脂性化合物的复杂混合物，这些化合物穿透细胞壁，破坏细菌膜并干扰完整的膜蛋白。这种混合物的复杂性完全使微生物无法产生抗药性。这意味着制剂适用于根除所有类型的幽门螺杆菌，意味着它具有应用于治疗来自世界各地的患者的潜力，无论是哪种幽门螺杆菌菌株(抗生素耐药或抗生素不耐药)引起了感染。[0037]在本专利申请中，公开了用本技术的草药制剂治疗28名人类志愿者(分为三组)的结果。[0038]第一组包括10名确诊为急性幽门螺杆菌感染、伴有轻度感染症状(腹胀、胃痛、胃酸升高、咳嗽、食欲不振)的人类志愿者。志愿者服用含有溶解在435mg向日葵油中(5名志愿者)或置于固体载体上(5名志愿者)的65mg制剂的明胶胶囊。每名志愿者每天服用2粒胶囊(每粒胶囊含65mg制剂)，早上1粒，晚上1粒，饭前30分钟空腹服用，连续服用30天，即每天服用130mg草药制剂，每天两次，每次65mg，连续30天。[0039]在这30天中，他们没有接受任何其他幽门螺杆菌感染治疗，并且有正常的饮食习惯，只是不喝酒。治疗结束后四周和八周，志愿者接受了幽门螺杆菌粪便抗原检测。50％的病例实现了感染的根除。这就是为什么我们得出结论，剂量应该更高，至少在治疗开始时更高，并且时间更长。[0040]第二组包括15名确诊为急性幽门螺杆菌感染、伴有轻度感染症状(腹胀、胃痛、胃酸升高、咳嗽、食欲不振)的人类志愿者。与第一组中应用的剂量方案相比，第二组中应用的剂量方案在治疗开始时更高并且时间更长。志愿者服用含有溶解在435mg向日葵油中(7名志愿者)或置于固体载体上(8名志愿者)的65mg制剂的明胶胶囊。每个志愿者每天服用4粒胶囊，早上2粒，晚上2粒，饭前30分钟空腹服用，连续服用15天，随后另外30天每天服用2粒，早上1粒，晚上1粒，饭前30分钟空腹服用，即每天服用260mg草药制剂，每天两次每次130mg，连续15天；随后另外30天每天服用130mg草药制剂，每天两次每次65mg。[0041]在这45天里，他们没有接受任何其他幽门螺杆菌感染的治疗，并且有正常的饮食习惯，只是不喝酒。治疗结束后四周和八周，志愿者接受了幽门螺杆菌粪便抗原检测。15名志愿者中有14名被证实完全根除幽门螺杆菌感染(93％的病例实现了感染根除)。10名志愿者在治疗开始10天后报告疾病症状(胃痛、胃酸水平升高、腹胀)完全消失，而其他4名志愿者直到治疗结束症状才消失。这意味着根据本技术的草药制剂除了对幽门螺杆菌的抗菌作用外，还表现出抗炎作用。在此治疗期间，没有志愿者报告任何胃肠道副作用，如腹泻、恶心、呕吐或腹痛，这些在抗生素治疗期间非常常见。这些结果有力地证实了本技术的制剂在从胃粘膜根除幽门螺杆菌感染方面是有效的，优选不使用抗生素，并且不会引起任何不希望的副作用。[0042]在第三组中，3名患有慢性感染(症状出现超过一年)的其他志愿者正在接受为期两周的标准疗法(每天两次ppi+克拉霉素(2《500mg)+阿莫西林(2x1000 mg))，连同服用含有溶解在435mg向日葵油中的65mg本技术制剂的明胶胶囊。治疗结束后四周和八周，志愿者接受了幽门螺杆菌粪便抗原检测，证实没有感染。这证实了本技术的制剂不会降低标准疗法的效果，反而会促进它。[0043]此外，与所有目前已知和使用的治疗由幽门螺杆菌引起的感染的治疗剂不同，本文公开的制剂是完全天然的组合物并且不含任何合成化合物。这使得该组合物更适合对抗生素过敏的(allergic or hypersensitive)人。[0044]此外，制剂可用于预防易患胃炎和幽门螺杆菌感染的人群中的幽门螺杆菌感染。出于预防目的，制剂可在一年内服用一次或两次，连续服用60天，每天一粒胶囊，饭前30分钟空腹服用，即每天服用65mg草药制剂，连续服用60天。优选地，该治疗应在夏末或冬末进行。[0045]本技术的制剂特别适用于已证实感染幽门螺杆菌的患者，尤其是喜欢草药治疗而不喜欢使用抗生素的患者，甚至更优选以前接受过抗生素治疗但在完成抗生素治疗后仍未治愈的患者。









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