一种磷酸二氢钾改性生物炭材料、制备方法及其应用 专利技术说明

无机化学及其化合物制造及其合成,应用技术1.本发明涉及一种磷酸二氢钾改性生物炭材料、制备方法及其应用(在畜禽粪便厌氧消化过程中降低抗性基因丰度、钝化重金属)，属于生物炭制备及应用技术领域。背景技术：2.兽用抗生素和重金属添加剂具有防治动物疾病、提高畜禽饲料利用率、促进动物生长发育、增亮畜禽皮毛颜色、降低养殖成本等作用，因此被广泛应用于畜禽养殖业中。但动物肠道对抗生素及重金属的吸收率很低，约有30-95％的抗生素及重金属会被动物排出体外，残留在排泄物中。这导致畜禽的排泄物中残留大量的抗生素及重金属，这些残留物会诱导微生物产生耐药性及增加耐药菌的数量，使环境中微生物的抗性逐年增加，诱导环境中抗性基因(args)的富集。目前，世界卫生组织(who)已经将args作为21世纪威胁人类健康的重大挑战之一。随着居民消费需求的增加和畜禽养殖业的快速发展，兽用抗生素的使用与污染问题将会持续存在，args对生态环境、人类健康所造成的潜在风险也将会一直存在。3.生物炭是一种碳质材料，是由生物质在缺氧环境下热解产生的性质稳定的多孔材料，具有较大的表面积、完善的微孔结构、较高的芳香化程度以及丰富的官能团。生物炭可与畜禽粪便中的重金属发生络合、吸附、阳离子互换等反应，降低重金属、抗生素等的含量，减轻系统的选择性压力，从而降低args的基因丰度。生物炭还可以通过影响微生物的群落结构及微生物间的水平基因转移(hgt)来改变厌氧消化过程中args的丰度和迁转过程。然而，由于生物炭的原材料不同，导致比表面积、孔隙结构、表面基团的类型及性质也各不相同，可能存在吸附量小，对args去除效果差的问题。因此，进一步改性生物炭来提高吸附力、改变化学性质是非常必要的。4.生物炭改性是指将生物炭经化学、物理、生物等方法处理以增加其比表面积、孔隙度和表面官能团的方法。生物炭的改性方法包括物理改性和化学改性。物理改性主要是蒸汽处理，通过高温蒸汽去除杂质，改变生物炭的孔隙结构，增加生物炭的比表面积。化学改性方法则包括酸碱氧化、有机物负载、无机物负载等方法，但是基本都存在猪粪厌氧消化过程中抗性基因去除效率低的问题。技术实现要素：5.针对猪粪厌氧消化过程中抗性基因去除效率低的问题，本发明提供了一种磷酸二氢钾改性生物炭材料、制备方法及其应用。本发明以水稻壳为原料，经过无氧热解后制成水稻壳生物炭，进一步采用磷酸二氢钾对水稻壳生物炭进行改性，合成负载磷酸二氢钾的生物炭功能材料，并将磷酸二氢钾改性生物炭材料作为增强剂投加至猪粪厌氧消化反应器中，加速并增强猪粪中抗性基因的去除过程，钝化重金属，从而降低粪肥和沼渣的土地利用风险。6.本发明的技术方案是：一种磷酸二氢钾改性生物炭材料的制备方法，其特征是，7.(1)制备稻壳基生物炭8.将水稻壳清洗、烘干，然后置于管式炉内，通入n2，升温至500-600℃炭化2-3小时，后改为通入co2反应1-2小时，在n2保护氛围中冷却至室温；再经洗涤、烘干和研磨并过100目筛，得到稻壳基生物炭(bc)；9.(2)磷酸二氢钾改性生物炭10.取步骤(1)制备的稻壳基生物炭置于磷酸二氢钾溶液中，使稻壳基生物炭均匀分散在磷酸二氢钾溶液中，在室温下搅拌反应5小时以上，再静置20-24小时；过滤，离心处理；然后水冲洗至溶液ph接近中性(ph6-7)后干燥，冷却至室温，研磨并过100目筛，最终得到磷酸二氢钾改性生物炭(bp)。11.进一步的，上述步骤(1)中，以恒定速率通入n2，以10-20℃/min(最佳为15℃/min)的升温速度升温至500-600℃。水稻壳原料必须在500℃的高温下裂解，且热解温度要保持3小时以上，以降低生物炭本身的毒性和污染物溶出量，避免二次环境污染；稻壳基生物炭(bc)在n2和co2保护下通过高温热解制成，该生物炭颗粒结构稳定，具有较大的比表面积和丰富的中孔与介孔结构，且分布均匀。使用的水稻壳，优选废弃水稻壳，其中重金属残留量需在检测限以下。所述烘干是在60-80℃干燥箱内烘干。12.进一步的，上述步骤(2)中，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为15-25wt％，优选20wt％。磷酸二氢钾与稻壳基生物炭的质量比为1-1.2:1。13.进一步的，上述步骤(2)中，所述均匀分散的过程是指超声分散，优选超声0.5小时。所述干燥是指置于105-120℃的真空烘箱内干燥24小时以上。14.进一步的，上述步骤(2)制备的磷酸二氢钾改性生物炭(bp)的粒径小于0.15mm(100目)，以在厌氧消化系统中获得更好的分散效果。15.本发明还提供了上述方法制备的磷酸二氢钾改性稻壳基生物炭，其特征是，改性后的bp具有更多的孔隙结构和更大比表面积，其总孔容积≥0.15cm3/g，比表面积≥50cm2/g。16.本发明还提供了上述的磷酸二氢钾改性生物炭材料在畜禽粪便厌氧消化过程中降低抗性基因丰度、钝化重金属中的应用。17.本发明还提供了上述的磷酸二氢钾改性生物炭材料在畜禽粪便厌氧消化过程中降低抗性基因丰度、钝化重金属的方法，其特征是：将新鲜畜禽粪便(尤其是猪粪)与具有产甲烷活性的厌氧消化污泥按照质量比5:2.5-3.5的比例混合均匀，在室温下调节最终底物总含固率为7％-9％；磷酸二氢钾改性稻壳基生物炭的投加量为底物干重的5％-10％；将底物和生物炭混合均匀后，置于厌氧消化反应器中，在厌氧环境下于35-37℃条件下进行恒温搅拌发酵50-90天。18.生物炭投加量为底物干重5％-10％时的钝化效果最好，过量的投加量(》15％时)会增加厌氧消化系统的含固率，降低传质效率，造成严重的水分流失，干扰有机废物的生物降解，进而影响消化效率并限制重金属钝化效果。19.本发明采用磷酸二氢钾对生物炭进行化学改性，磷酸二氢钾具有高效、环保、危害较小、腐蚀性低和不会额外引入重金属等优点。用磷酸盐改性的生物炭具有多种优点，改性后的生物炭可以作为磷的缓释肥料，在还田后提高土壤肥力。附着在生物炭上的磷酸盐可与重金属形成沉淀，提高生物炭固定化重金属的效果，从而减轻系统的选择性压力，这有助于args丰度的降低。环境中的抗性基因一般有两种存在形式，一种是存在于细胞内的抗性基因(iargs)，另一种是游离在细胞外的抗性基因(eargs)，环境中的胞内抗性基因与胞外抗性基因处于动态变化的过程。磷酸二氢钾中的k元素具有扩孔作用，能增大生物炭的孔径和增加比表面积，更大的比表面积可以吸附更多的胞外基因，从而降低eargs的基因丰度。20.本发明的技术效果是：21.(1)采用磷酸二氢钾为改性剂，磷酸二氢钾中的k元素具有扩孔作用，经过磷酸二氢钾改性后的生物炭具有丰富的孔隙结构和巨大的比表面积，更有助于吸附胞外dna，可显著降低猪粪厌氧消化过程中eargs的基因丰度；22.(2)经过磷酸二氢钾改性后的生物炭的比表面积更大，表面-oh、-cooh等含氧官能团增多，阳离子交换容量更大，能更有效的结合或直接吸附游离态重金属，降低dtpa可提取态重金属的含量，从而减轻重金属共抗性、交叉抗性及共调节作用对args造成的选择性压力，从而降低args的丰度；23.(3)将改性生物炭作为厌氧消化的添加剂，可有效降低畜禽粪便中args和移动基因元件(mges)的基因丰度，从而能够显著削减粪肥和沼渣中的args；24.(4)改性后的生物炭可作为磷的缓释肥料，在还田后可提高土壤的肥力，可在农田土壤中有效供给植物所需的营养元素磷，具有较好的应用前景和较大的经济效益；25.(5)采用磷酸二氢钾为改性剂，具有环保、高效和腐蚀性低的特点，不会额外引入重金属，且制备方法操作简单，对设备要求不苛刻，制备过程不会造成二次环境污染；本发明制备成本低，能够大规模工业化生产，有助于减轻畜禽粪便中args的环境排放；26.(6)采用农作物废弃物为原料，来源广泛，成本低廉，以废治废，可实现优化废弃物管理和环境保护的双赢。附图说明27.图1是实施例1中制备的稻壳基生物炭与磷酸二氢钾改性生物炭的不同位置扫描电镜图。28.其中(a)和(b)是稻壳基生物炭(bc)的两个位置，(c)和(d)是磷酸二氢钾改性生物炭(bp)的两个位置；29.图2是实施例1中制备的稻壳基生物炭与磷酸二氢钾改性生物炭的x射线衍射图谱(xrd谱图)；30.图3是实施例2中猪粪厌氧消化过程中各试验组的胞内抗性基因(iargs，imrgs和imrgs)的绝对基因丰度的变化；31.图4是实施例2中猪粪厌氧消化过程中各试验组的胞外抗性基因(eargs、emrgs和emges)的绝对基因丰度的变化；32.图5是实施例2中猪粪厌氧消化过程中胞内、胞外的16s rrna、args、mrgs和mges之间的相关性矩阵；33.图6为采用dtpa浸提法提取的五种有效态金属(as、cr、cu、pb和zn)的含量；34.图7为利用tessier五步连续重金属提取法得到的猪粪厌氧消化样品中重金属(as、cr、cu、pb和zn)的形态分布情况。具体实施方式35.以下结合实施例和附图来说明其效果。36.实施例137.(1)以废弃水稻壳为原材料，经过多次超纯水清洗去除表面杂质后，置于60℃干燥箱内烘干至恒重后收集；将干净的稻壳置于管式炉内，以恒定速率通入n2，以15℃/min的速度升温至500-600℃，炭化2h后改通入co2反应1.5h，然后在n2保护氛围中冷却至室温；冷却后的生物炭经过超纯水多次洗涤后，在60℃干燥箱内烘干后研磨并过100目筛，得到稻壳基生物炭(bc)。38.(2)取稻壳基生物炭置于浓度为20wt％的磷酸二氢钾溶液中，超声0.5h，使稻壳基生物炭均匀分散在磷酸二氢钾溶液中，随后在室温下搅拌反应5h后继续静置浸泡24h，其中磷酸二氢钾和生物炭的质量比为1:1；将浸泡过的产物过滤，离心，用超纯水反复冲洗至溶液接近中性后，置于105℃的真空烘箱内干燥24h后，冷却至室温，研磨并过100目筛，最终得到磷酸二氢钾改性生物炭(bp)。39.对步骤(1)制备的稻壳基生物炭(bc)及步骤(2)得到的磷酸二氢钾生物炭(bp)进行表征，bc和bp的总孔容积分别为0.112cm3/g和0.157cm3/g，bc和bp的平均孔径分别为52.53nm和75.67nm，bc和bp的比表面积分别为9.26cm2/g和54.37cm2/g。如图1所示，bc的表面光滑且规则，具有多处褶皱，bc的孔隙较大是因为原材料水稻壳具有发达的孔隙组织。改性后的生物炭表bp表面出现大量的蜂窝状结构且表面变的破碎和不规则。扫描电镜的结果与生物炭孔隙度分析的结果相一致，即改性后的bp具有更多的孔隙结构和更大比表面积。40.如图2所示，改性后生物炭衍射峰的数量和位置都有明显的改变。bp上在2θ＝17.379°、23.837°、30.709°和46.455°处出现的衍射峰分别对应于(101)、(200)、(112)、(220)及(312)处的布拉格平面。通过与标准卡片(xrd标准图库pdf卡号72-102)对比后发现，为kh2po4晶型的特征峰，这个结果可以证实：磷酸二氢钾已经被成功负载到了生物炭上。41.实施例242.将实施例1制备的制备的稻壳基生物炭(bc)及磷酸二氢钾生物炭(bp)分别用于强化猪粪厌氧消化过程中抗性基因的去除，进行对比。43.所用厌氧消化污泥的特质为ph：7.46；总固体(ts％)：11.36；挥发性固体(vs％)：3.54；总有机碳(toc,g/l)：7.75±0.93；总氮(tn,g/l)：1.42±0.11；溶解性cod(scod,g/l)：3.90±0.62；碳氮比(c/n)：23.46:1；抗生素含量在检测限以下；重金属含量为as：11.34mg/kg，cr：16.23mg/kg，cu：134.76mg/kg，pb：28.96mg/kg和zn：215.64mg/kg。44.所用新鲜猪粪的特质为ph：7.65；总固体(ts％)：14.17；挥发性固体(vs％)：7.22；总有机碳(toc,g/l)：14.80±1.31；总氮(tn,g/l)：8.62±1.71；溶解性cod(scod,g/l)：7.89±2.18；碳氮比(c/n)：16.68:1；重金属含量为as：25.76mg/kg，cr：18.96mg/kg，cu：219.20mg/kg，pb：35.47mg/kg和zn：676.20mg/kg；粪便样品取自哺乳期母猪的猪圈，处于哺乳期的母猪饲料中不含或含少量抗生素等添加剂，该粪便样品中的抗生素的残留量均在检测限以下。45.将新鲜猪粪与具有产甲烷活性的厌氧消化污泥按照5:3的比例混合均匀，在室温下调节最终底物总含固率约为8％。生物炭的投加量根据底物的干重确定，bc和bp的投加量分别为底物干重的0％、5％、10％和20％，分别为ck组、bc5、bc10、bc15、bc20、bp5、bp10、bp15及bp20组。同时设置无添加生物炭试验组作为对照组。46.将底物和生物炭混合均匀后，置于厌氧消化反应器中，在实验开始前，为保证厌氧环境，向反应器中通入3min氮气以排出反应瓶中的氧气，在厌氧环境下于37℃条件下进行恒温搅拌发酵60天。在运行过程中，根据运行状况在第0、15、30、45和60天取样，每次约50ml，提取dna后，采用采用高通量荧光定量pcr技术对猪粪厌氧消化混合菌群中args(抗生素抗性基因)、mges(可移动遗传元件)及重金属抗性基因(mrgs)的绝对基因丰度进行定量。args、mges及mrgs的引物序列如表1所示。此外，还测定重金属总量、重金属各种形态及dtpa可提取态重金属的含量。47.表1抗生素抗性基因、可移动遗传元件及重金属抗性基因引物序列48.[0049][0050]如图3所示，厌氧消化结束后，与初始物料中的16s rrna的基因丰度相比，消化后16srrna的绝对丰度在ck组、bc5组、bc10组、bp5组以及bp10组中分别减少了51.8％、72.1％、91.3％、67.2％和88.2％。添加生物炭bc和bp后显著增加了sul2、aac(6')-ib-cr、ermb、ermf、blactx-m、parc、aac(6')‑ⅱ、aada1、tetg、blatem、tetw和tetx的去除效果，这些args的去除效率提高到61％-99％不等。4种imrgs(copa、cusa、pcoa和znta)的总绝对丰度由初始物料中的4.52e+06分别降低至4.25e+05(ck组)、4.43e+05(bc5组)、9.55e+05(bc10组)、2.61e+05(bp5组)和2.90e+05(bp10组)(gene copies/g slurry)。在bp处理中，parc、aac(6')‑ⅱ、aada1、tetg和tetw的去除率高于bc组和ck组。综上说明，生物炭可以强化削减猪粪中的胞内抗性基因，且磷酸盐改性后的生物炭bp对iargs的削减效果明显优于普通生物炭bc。[0051]如图4所示，在消化系统中添加生物炭bc和bp后，都进一步增强了无法被消化过程消除的残留eargs的去除效果。添加生物炭后胞外blactx-m和tetw的绝对基因的去除率由ck组的47.4％和58.5％提高至88.9％和96.4％(bc10组)及79.9％和98.8％(bp10组)。与添加bc的试验组相比，添加bp后有更好的胞外抗性基因的去除效果，大多数earg如sul1、sul2、ermb、ermf、blatem、parc、aac(6')-ii、aada1、tetg、tetw和tetx的绝对基因丰度都有更大程度的减少。综上说明，具有更大比表面积的生物炭bp或者更高的生物炭投加剂量都有利于胞外抗性基因的去除，因为更大的比表面积或更多的投量可以吸附更多的胞外基因，从而降低胞外抗性基因的基因丰度，从经济适用的角度考虑，5％-10％的生物炭投加量为最优投量。[0052]hgt是包括iargs间的的接合、转导和细胞间eargs的自然转化。本试验选取了三种典型mges(inti1，tn916/1545和iscr1)作为目标基因来探究args发生hgt的情况。猪粪厌氧消化过程中imges及emges的绝对丰度的变化情况如图3和图4所示。args、mrgs及mges之间的相关性分析结果如图5所示。inti1是整个消化过程中绝对基因丰度最高的一种移动遗传元件，且inti1与sul2、blactx-m、aac(6')-ib-cr、aac(6')‑ⅱ和aada1之间均存在显著呈正相关关系(p《0.01)。在厌氧消化期间由inti1所介导的hgt极大地有助于sul2、blactx-m、aac(6')-ib-cr、aac(6')‑ⅱ和aada1的传播。生物炭bp的加入起到了强化削减imges的作用，添加bp试验组中imges的去除效果强于空白组。消化结束后，ck组、bc5组、bc10组、bp5组以及bp10组中emge的绝对基因丰度分别减少至9.91e+6、4.79e+06、5.32e+06、3.18e+06以及3.21e+06(gene copies/g slurry)。添加生物炭后可以显著增加降低系统中emges的基因丰度。相比于ck组，添加生物炭后emrgs的去除率提高了约20％，且bp对emges的削减效果优于bc，添加bp后显著提高对胞外inti1的去除效果。胞外inti1和tn916/1545b与胞外16s rrna和多数胞外抗性基因sul1、sul2、blactx-m、aac(6')-ib-cr、aac(6')‑ⅱ、aada1、tetg和tetx之间都存在显著正相关性(p《0.05)。添加bp后，胞外inti1和tn916/1545b可能携带这些抗性基因，厌氧消化期间eargs的减少是通过hgt的频率从而减少了eargs的基因丰度。综上说明，添加生物炭可抑制猪粪厌氧消化后inti1的增加，且改性碳bp有更好的阻控抗性基因迁转的效果。[0053]如图6所示，未经消化处理的猪粪中含有大量有效态金属，初始样品中的dtpa可提取的有效态as、cr、cu、pb和zn的含量分别为30.43、0.62、8.59、1.48和233.4mg/kg。猪粪厌氧消化后，ck组、bc5组及bp5组中总有效态金属的浸出量分别为161.0、108.2和78.68mg/kg，添加生物炭bp的试验组固定重金属的效率提高了2倍以上。[0054]根据重金属不同赋存形态的生物有效性和毒性的大小排序，得到f1》f2》f3》f4》f5，f1、f2和f3的总和归为重金属的不稳定形态，f4和f5的和归为重金属的稳定状态。如图7所示，添加生物炭bc和bp后，均明显改变了猪粪中重金属的形态分布，降低了重金属的生物有效性，消化后重金属形态主要以硫化物与有机结合态(f4)和残渣态(f5)的形态存在，猪粪中的重金属明显趋于稳定化，且添加bp的试验组对重金属有更好的钝化效果。[0055]实施例3[0056](1)以废弃水稻壳为原材料，经过多次超纯水清洗去除表面杂质后，置于60℃干燥箱内烘干至恒重后收集；将干净的稻壳置于管式炉内，以恒定速率通入n2，以20℃/min的速度升温至500-550℃，炭化3h后改通入co2反应1h，然后在n2保护氛围中冷却至室温；冷却后的生物炭经过超纯水多次洗涤后，在60℃干燥箱内烘干后研磨并过100目筛，得到稻壳基生物炭(bc)。[0057](2)取稻壳基生物炭置于浓度为22wt％的磷酸二氢钾溶液中，超声0.5h，使稻壳基生物炭均匀分散在磷酸二氢钾溶液中，随后在室温下搅拌反应6h后继续静置浸泡24h，其中磷酸二氢钾和生物炭的质量比为1.2:1；将浸泡过的产物过滤，离心，用超纯水反复冲洗至溶液接近中性后，置于115℃的真空烘箱内干燥24h后，冷却至室温，研磨并过100目筛，最终得到磷酸二氢钾改性生物炭(bp)。[0058]实施例4[0059](1)以废弃水稻壳为原材料，经过多次超纯水清洗去除表面杂质后，置于60℃干燥箱内烘干至恒重后收集；将干净的稻壳置于管式炉内，以恒定速率通入n2，以15℃/min的速度升温至550-600℃，炭化2h后改通入co2反应1.5h，然后在n2保护氛围中冷却至室温；冷却后的生物炭经过超纯水多次洗涤后，在60℃干燥箱内烘干后研磨并过100目筛，得到稻壳基生物炭(bc)。[0060](2)取稻壳基生物炭置于浓度为21wt％的磷酸二氢钾溶液中，超声0.5h，使稻壳基生物炭均匀分散在磷酸二氢钾溶液中，随后在室温下搅拌反应7h后继续静置浸泡24h，其中磷酸二氢钾和生物炭的质量比为1.1:1；将浸泡过的产物过滤，离心，用超纯水反复冲洗至溶液接近中性后，置于110℃的真空烘箱内干燥24h后，冷却至室温，研磨并过100目筛，最终得到磷酸二氢钾改性生物炭(bp)。









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