一种ROS响应型蛋白交联脂质体及其应用 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术一种ros响应型蛋白交联脂质体及其应用技术领域1.本发明涉及化学与制剂领域，具体涉及一种ros响应型蛋白交联脂质体及其应用。背景技术：2.免疫疗法已成为实体瘤治疗的主流研究方向，但其面临的关键问题是免疫抑制和免疫逃逸。一方面，在实体瘤微环境中存在大量免疫抑制细胞，以m2促肿瘤表型的肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，tams)为代表，其分泌大量免疫抑制性因子，严重削弱免疫治疗效果。另一方面，肿瘤细胞还可通过下调主要组织相容性复合体ⅰ类分子(major histocompatibility complex-i，mhc-i)的表达以产生免疫逃逸。因此，药物联用，尤其是具有免疫调节作用的蛋白药物与小分子药物联用，是解决这一局限的有效策略。如蛋白药物干扰素γ(interferon-γ，ifn-γ)具有免疫调节和抗肿瘤作用，已被批准用于增强免疫功能。ifn-γ不仅可以调节tams转变为m1抗肿瘤表型，也能够上调肿瘤细胞mhc‑ⅰ类分子的表达，但单一治疗仍疗效不佳。而氯喹(chloroquine，cq)作为临床多年的抗疟疾药物，近些年被发现具有抗肿瘤相关作用；并且作为一类溶酶体碱化剂，cq能抑制自噬体与溶酶体结合，减少mhc‑ⅰ类蛋白的降解，恢复抗原呈递；同时，cq被证明能提高ifn-γ下游p38/nf-κb的激活和转录因子tfeb的表达，增强ifn-γ介导的tams表型转换。因此，cq与ifn-γ联合应用可发挥良好的实体瘤治疗作用。3.但蛋白药物和小分子药物的联用仍面临递送技术的挑战。一方面，二者常规给药的血液半衰期短、肿瘤靶向性差且具有剂量依赖性的副作用。另一方面，二者理化性质与作用位点差异大，蛋白类药物作用位点常为细胞膜表面相应受体，小分子药物作用位点常为胞内。并且，蛋白药物自身容易因构象改变而失活。因此，实现两药的稳定共载及可控释放是亟需解决的问题。技术实现要素：4.本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供了一种ros响应型蛋白交联脂质体及其制备方法。5.本发明的另一目的在于提供新型的ros响应型交联剂，不仅能快速交联蛋白药物，还能快速响应ros，释放出原型蛋白药物，且不影响其生理活性。6.本发明的又一目的是提供ros响应型蛋白交联脂质体在实体瘤，尤其是胰腺癌治疗中的应用。7.一种ros响应型蛋白交联脂质体，利用ros响应型交联剂将蛋白药物交联在载有小分子药物的脂质体表面而成。其制备方法为：先制备载有小分子药物的脂质体，再将带有相反电荷的蛋白药物吸附到脂质体表面，利用ros响应型交联剂交联而成。8.作为本发明的一种优选，所述的ros响应型交联剂是双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)((丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙烷-2,1-二基)双(碳酸酯)，结构式为：[0009][0010]作为本发明的一种优选，所述的脂质体由阳离子脂质或阴离子脂质，以及常用辅助脂质构成。[0011]作为本发明的一种优选，所述的阳离子脂质选自氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(dotma)，溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(dotap)，或专利zl2018113048420中的叔胺类阳离子脂质衍生物等，优选专利zl2018113048420中所述的叔胺类阳离子脂质衍生物。[0012]所述的叔胺类阳离子脂质衍生物，其化学结构可由通式(i)或(ii)表示：[0013][0014]其中，[0015]n＝1或2；[0016]m代表1-4的整数；[0017][0018]p代表2-4的整数,q代表1-3的整数,r代表1-2的整数,s代表0-3的整数,r5代表甲基、羟甲基、乙基、羟乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基,r6代表甲基、乙基或苄基,r7代表吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、吡唑基或咪唑基；[0019]u代表7-19的整数；[0020][0021]作为本发明的一种优选，所述的阴离子脂质选自二油酰基磷脂酰丝氨酸(dops)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、4-((1,5-二氧代-1,5-双(十四烷氧基)戊烷-2-基)氨基)-4-氧代丁酸(ta-cooh)，优选ta-cooh，结构式为：[0022][0023]作为本发明的一种优选，所述的常用辅助脂质选自卵磷脂(spc)，二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe)，二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)，二油酰基卵磷脂(dopc)，二芥酰基卵磷脂(depc)，二棕榈酰基卵磷脂(dppc)或胆固醇等，优选spc和/或胆固醇。[0024]作为本发明的一种优选，所述的小分子药物，选自肿瘤化疗药物或小分子免疫调节药物；所述的肿瘤化疗药物选自紫杉醇、阿霉素、磷酸氯喹(cq)，优选cq；所述的小分子免疫调节药物选自tgf-β抑制剂。[0025]作为本发明的一种优选，所述的蛋白药物选自正电性蛋白药物、负电性蛋白药物；所述的正电性蛋白药物选自ifn-γ、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，所述的负电性蛋白药物选自il-2、il-15。[0026]作为本发明的进一步优选，所述的蛋白药物选自ifn-γ。[0027]作为本发明的一种优选，所述交联剂与蛋白药物的物质的量比为50:1。[0028]本发明所述的ros响应型交联剂作为蛋白交联剂的应用。[0029]本发明所述的ros响应型蛋白交联脂质体在制备实体瘤治疗药物中的应用，优选胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌，进一步优选胰腺癌。[0030]一种ros响应型交联剂，其特征在于化学结构如下所示：[0031][0032]所述的ros响应型交联剂在制备脂质体和蛋白交联药物中的应用。[0033]所述的ros响应型交联剂在制备蛋白交联剂中的应用。[0034]本发明公开一种ros响应型交联剂的合成方法，具体步骤如下：[0035](1)将硫代乙醇酸溶解于丙酮和三氟乙酸中，于室温搅拌反应4-8h。反应结束后抽滤，得白色粉末状固体(产物1)2,2'-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))二乙酸。[0036](2)将产物1溶解于无水四氢呋喃中，于冰水浴条件下缓慢加入四氢铝锂，后转移至室温下搅拌过夜。反应完成后，冰水浴条件下用纯水猝灭反应，并加入饱和四水合酒石酸钾钠水溶液，于室温下搅拌2-6h。最后用乙酸乙酯萃取4次，无水硫酸钠干燥后，旋蒸浓缩，得到油状粗产物，经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)，得到油状产物(产物2)2,2'-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙烷-1-醇)。[0037](3)将n,n-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、产物2和n,n-二异丙基乙胺溶于dmso中，于40℃搅拌2-4h。反应结束后，加入适量纯水并用乙酸乙酯萃取。之后收集有机相，用饱和食盐水溶液洗涤。使用无水硫酸钠干燥后，柱层析纯化产物(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)，得到白色固体终产物双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)((丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙烷-2,1-二基)双(碳酸酯)。[0038]合成反应式如下：[0039][0040]有益效果：[0041]本发明公开的ros响应型交联剂具有温和高效的ros响应性(见实施例1)。本发明的ros响应型蛋白交联脂质体具有较好的小分子药物包封率和蛋白药物交联效率，粒径在161nm左右。在tem图像下呈类球型，且与装载小分子药物的脂质体相比表面有凝胶层状包裹(见实施例2)。可以有效调控巨噬细胞的表型转换(见实施例3)，并促进肿瘤细胞的mhc‑ⅰ表达(见实施例4)，同时还能有效抑制肿瘤细胞生长(见实施例5)。[0042]本发明的创新之处是提供了新型的ros响应型蛋白交联剂，实现了蛋白类药物和小分子药物的温和共载和可控释放，为实体瘤免疫治疗提供了新的联合递送策略和递送系统。附图说明[0043]图1是本发明ros响应型交联剂的1h-nmr谱图[0044]图2是本发明ros响应型交联剂的质谱谱图[0045]图3是本发明ros响应型交联剂的ros响应性实验[0046]图4是本发明cq-lip的透射电子显微镜(tem)图像及粒径图[0047]图5是本发明ifn-γ/cq-lip的tem图像及粒径图[0048]图6是本发明ifn-γ/cq-lip处理m2型巨噬细胞后的cd80及cd206表达[0049]图7是本发明ifn-γ/cq-lip处理鼠胰腺癌细胞panc02后的mhc‑ⅰ表达[0050]图8是本发明ifn-γ/cq-lip处理鼠胰腺癌细胞panc02后的凋亡情况具体实施方式[0051]通过以下实施例对本发明进一步解释，但这些实施例不对本发明构成任何限制。[0052]实施例1[0053]ros响应型交联剂的合成与表征，化学结构式为：[0054][0055](1)精密称取硫代乙醇酸(10.0g,108.6mmol,0.1eq.)和丙酮(3.8g,65.1mmol,1.2eq.),置于茄型瓶中。加入三氟乙酸(618.9mg,0.1eq.)，于室温搅拌反应6h。反应结束后，抽滤得白色粉末状固体11.2g(产物1)，为2,2'-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))二乙酸。[0056](2)称取产物1(10.0g，44.6mmol，1eq.)，置于茄型瓶中。加入200ml无水四氢呋喃将其完全溶解。于冰水浴条件下缓慢加入四氢铝锂粉末(4.2g,111.5mmol,2.5eq.)。反应30min后，将反应体系转移至室温下搅拌过夜。反应完成后，冰水浴条件下缓慢滴加与四氢铝锂等质量的水猝灭反应。待猝灭完成后，向反应体系中加入150ml水、100ml饱和四水合酒石酸钾钠水溶液，室温下搅拌4h。反应体系从灰色混悬液逐渐转变为深棕色乳浊液，4h后将反应液用乙酸乙酯萃取4次。无水硫酸钠干燥后，通过旋蒸浓缩反应液，得到油状粗产物，经柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)，得到油状产物4g(产物2)，为2,2'-(丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙烷-1-醇)。[0057](3)称取n,n-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(1.2g，4.6mmol，4eq.)溶于20ml二甲基亚砜中，依次加入产物2(224.2mg，1.1mmol，1eq.)和n,n-二异丙基乙胺(590.3mg，4.6mmol，4eq.)，于40℃搅拌3h。反应完成后，将反应液转移到分液漏斗，加入约反应液体积10倍量的水，摇晃均匀后用乙酸乙酯萃取2次，收集上层有机相，有机相用饱和食盐水溶液洗涤两次。无水硫酸钠干燥后，使用柱层析纯化产物(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)，得到白色固体200mg(产物3)，双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)((丙烷-2,2-二基双(磺胺二基))双(乙烷-2,1-二基)双(碳酸酯)。[0058](4)氢谱和质谱表征[0059]ros响应型交联剂的氢谱如图1所示，δ＝1.65ppm(d)为-ch3-的特征峰，δ＝3.02ppm(c)为-ch2-的特征峰，δ＝4.49ppm(a)为碳酸酯键旁边的-ch2-的特征峰，δ＝2.86ppm(a)为内酰胺上的-ch2-。[0060]ros响应型交联剂的高分辨质谱结果如图2所示，分子量应为478.06，[m+na]+峰应为501.06。以上结果证明交联剂合成成功。[0061](5)ros响应性考察[0062]配置1mg/ml的ros响应型交联剂，3％的h2o2溶液和30％的h2o2溶液。后向1ml交联剂溶液中分别加入10μl 3％的h2o2溶液和30％的h2o2溶液，使得溶液中h2o2浓度分别为5mm和50mm。孵育15min后使用紫外分光光度计测量吸光度变化。[0063]结果如图3所示，交联剂于260nm处产生响应产物n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的吸收峰。由吸光度变化证明，交联剂在5mm h2o2条件下经过15min响应性断裂约50％，在50mm h2o2条件下经过15min响应性断裂约100％。表明该交联剂具有良好的ros响应性。[0064]实施例2[0065]ros响应型蛋白交联脂质体的制备与表征[0066](1)cq脂质体的制备[0067]称取40mg spc,8mg chol与12mg ta-cooh，溶解于甲醇和氯仿混合溶液(1:4，v:v)中，转移至茄型瓶中。于37℃减压蒸馏形成脂质薄膜。然后于室温真空干燥12h除去有机溶剂。随后加入5ml柠檬酸盐缓冲液(ph 3.5，0.3m)，于37℃水合15min，使用30％功率超声15min。最后过0.22μm微孔滤膜，得空白脂质体溶液。[0068]将cq溶解于磷酸氢二钠溶液中，并按药脂比1：12(w:w)将其与空白脂质体溶液混合，使用5％naoh调ph为7.4。随后将反应液转移至茄型瓶中，于37℃搅拌15min。最后将反应液转移至透析袋中，于pbs缓冲液中透析4h,每1h更换一次透析液。待透析完毕后，过0.22μm微孔滤膜，得cq-lip。并采用tem观察其形貌。[0069](2)ros响应型蛋白交联脂质体的制备[0070]将cq-lip与ifn-γ溶液按质量比150:1混合，于4℃振荡孵育15min。随后加入ros响应型交联剂，使交联剂:ifn-γ的质量比为50:1。继续于4℃振荡孵育15min后，采用截留分子量为100k的超滤离心管除去游离的ifn-γ，得ifn-γ/cq-lip。并采用tem观察其形貌。[0071](3)ros响应型蛋白交联脂质体的表征[0072]分别测定cq-lip和ifn-γ/cq-lip的粒径和电位，并使用tem观察形貌。二者的tem图像及粒径图分别如图4、图5所示,cq-lip表面光滑，而ifn-γ/cq-lip呈类球型且表面有类凝胶层状包裹。并采用高效液相色谱法测定cq-lip和ifn-γ/cq-lip中cq的含量，计算包封率。同时，采用elisa试剂盒检测未交联的ifn-γ含量，计算ifn-γ的交联效率。结果如表1。[0073]表1cq-lip和ifn-γ/cq-lip的粒径、电位和包封率[0074][0075]实施例3[0076]ros响应型蛋白交联脂质体对m2型巨噬细胞的表型转换作用[0077]从c57小鼠提取骨髓来源巨噬细胞(bmdm)作为模型细胞，使用il-4将其诱导为m2表型。将其调整成密度为1×106个/ml的细胞悬液，每孔500μl铺于12孔板中，待细胞贴壁后，弃上清，pbs洗涤，每孔分别加入1ml的pbs、cq(4.5μg/ml)、ifn-γ(30ng/ml)、ifn-γ/cq-lip(30ng/ml+4.5μg/ml)，设置3个复孔。分别与上述各组孵育24h后，使用流式细胞仪检测巨噬细胞表面cd80和cd206的表达。结果如图6所示，ifn-γ/cq-lip组有效上调了m1型巨噬细胞标志物cd80的表达，并下调了m2型巨噬细胞标志物cd206的表达，证明了ifn-γ/cq-lip能够充分发挥并提高ifn-γ和cq对巨噬细胞的表型转换作用。[0078]实施例4[0079]ros响应型蛋白交联脂质体对肿瘤细胞mhc‑ⅰ表达的影响[0080]选择鼠胰腺癌细胞panc02作为模型细胞，将其调整成密度为1×106个/ml的细胞悬液，每孔500μl铺于12孔板中，待细胞贴壁后，弃上清，pbs洗涤，每孔分别加入1ml的pbs、cq(4.5μg/ml)、ifn-γ(30ng/ml)、ifn-γ/cq-lip(30ng/ml+4.5μg/ml)，设置3个复孔。分别与上述各组孵育24h后，使用流式细胞仪检测panc02的mhc‑ⅰ表达情况。结果如图7所示。ifn-γ/cq-lip组有效上调了panc02细胞的mhc‑ⅰ的表达，且明显优于ifn-γ组和cq组。证明了ifn-γ/cq-lip能够能够充分发挥并提高ifn-γ和cq对肿瘤细胞的mhc‑ⅰ的上调作用。[0081]实施例5[0082]ros响应型蛋白交联脂质体对肿瘤细胞的促凋亡作用[0083]将panc02细胞调整成密度为1×106个/ml的细胞悬液，每孔500μl铺于12孔板中，待细胞贴壁后，弃上清，pbs洗涤，每孔分别加入1ml的pbs、cq(4.5μg/ml)、ifn-γ(30ng/ml)、ifn-γ/cq-lip(30ng/ml+4.5μg/ml)，设置3个复孔。分别与上述各组孵育24h后，使用流式细胞仪检测panc02的凋亡情况。结果如图8所示，ifn-γ/cq-lip组有效促进了肿瘤细胞的凋亡。[0084]以上实施例仅是对本发明技术方案和技术效果的举例说明，不能因此限定本发明保护范围。本发明也利用其他小分子药物和蛋白药物制备了ros响应型蛋白交联脂质体，也具有与上述实施例极其相近似的效果，对实体瘤具有良好的治疗效果。









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