一种控释药物植入剂及其制备方法与其在制备乳腺癌术后辅助治疗药物中的应用 专利技术说明

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明属于医用生物材料技术领域，涉及一种控释药物植入剂及其制备方法与其在制备乳腺癌术后辅助治疗药物中的应用。背景技术：2.乳腺癌仍然是世界上最常见的癌症之一。在全球范围内，乳腺癌约占女性癌症的30％，其死亡率与发病率之比为15％。当前，乳腺癌的全球发病率介于27/100000(非洲和东亚地区)和97/100000(北美)之间，反映了乳腺癌发病率与经济发展程度以及社会、生活方式因素有关。相较之下，随着诊疗技术的提高，全球乳腺癌死亡率总体呈下降趋势。通过提高世界范围内高质量预防、早期诊断和治疗服务的机会，可进一步提高乳腺癌患者的总体生存率。3.手术切除是治疗早期原发性乳腺肿瘤的标准临床策略。尽管手术切除具有一定的治愈机会，但由于乳腺肿瘤通常存在术后复发和转移率高的问题，乳腺癌患者接受手术治疗后的长期预后仍不理想。长期随访研究表明，乳腺癌术后复发的风险为10％～41％，并且大多数复发情况伴有远端转移问题。理论上，手术切除肿瘤组织可直接切除肿瘤组织，达到根治的目的。但对于进展期的乳腺肿瘤，手术切除后常存在微小残留病灶(mrd)，如残留的肿瘤细胞或微小的肿瘤组织，此为肿瘤复发的直接来源。乳腺肿瘤细胞固有的侵袭性使得mrd极易向周围组织侵袭，并最终使肿瘤细胞向特定器官迁移或远处转移。4.术后辅助化疗和放疗是目前预防手术切除后乳腺肿瘤局部复发和转移的标准方案，多年来发挥了一定积极作用。但目前实施的标准临床方案通常伴随着严重的并发症和副作用。因此，如何降低乳腺癌术后辅助化疗的不良反应，改善因肿瘤复发和转移导致的患者不良预后是当下亟待解决的问题。5.针对这一问题，开发可在术后肿瘤组织部位局部、大量释放化疗药物的递送系统具有十分重大的意义。这不仅可以有效提高术后治疗效果、降低癌症复发率和转移率，还可以避免对患者的身心伤害，提高患者的依从性，最终提高术后治疗的成功率并延长患者的生存期。6.术后辅助化疗主要的给药方式为静脉注射或口服。临床上所使用的药物往往不具有靶向肿瘤组织的能力。静脉注射方式期望使药物通过血液循环直接到达肿瘤组织，存在着较为严重的脱靶效应，引起的全身毒性也会严重损害患者的身心健康；而药物口服后则通过器官代谢进入体循环，由于肠胃和肝脏“首过效应”的存在，药物的利用率较低。临床上的许多化疗方法不仅无法达到预期效果，还容易对患者造成严重伤害，使得能够坚持完全部疗程的患者屈指可数，因此疗效也大打折扣。7.局部药物递送系统(local drug delivery systems，lddss)是近年来备受关注的一类新型给药系统。lddss不仅可在局部病灶组织大量释放药物，并可有效降低脱靶器官药物浓度，因此已被广泛用于避孕、抗菌、抗炎和抗肿瘤等领域。抗肿瘤lddss由于具备上述所提及的优势，已被用于临床实践，其成功案例包括卡莫司汀缓释植入剂gliadel圆片、醋酸戈舍瑞林缓释植入剂zoladex、原位成型可注射醋酸亮丙瑞林缓释植入剂eligard和氟尿嘧啶缓释植入剂中人氟安等。但目前临床上所使用的各类抗肿瘤lddss通常只能提供单一药物的缓释，并且部分产品还存在材料不可降解、药物突释严重和给药时间短等问题。8.根据中国临床肿瘤学会(csco)和美国国立综合癌症网络(nccn)颁布的癌症诊疗指南，乳腺癌术后辅助治疗发展至今，为了提高整体效果，临床上通常使用多个疗程进行和多种药物联合的治疗方案。现如今临床上使用的产品和临床前研究开发的lddss往往只能实现单一药物的缓慢释放，少有可进行程序性控制、个性化定制和不同药物联合的方法。因此，当前开发的抗肿瘤植入剂显然已无法满足临床需求，尤其是常采用多药物联合治疗的乳腺癌术后辅助化疗领域。因此，针对临床标准疗法开发生物相容性良好、可生物降解、多种药物程序性递送、联合治疗的局部给药系统可起到降低毒副作用、改善乳腺癌患者生活质量和提高整体治疗效果的作用，从而为乳腺癌临床实践提供安全、有效的治疗方案。技术实现要素：9.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种控释药物植入剂。10.本发明还要解决的技术问题是提供上述控释药物植入剂的制备方法。11.本发明最后要解决的技术问题是提供上述控释药物植入剂在制备乳腺癌术后辅助治疗药物中的应用。12.发明思路：本发明采用可生物降解的聚丙交酯(pdlla)、聚三亚甲基碳酸酯(ptmc)和抗肿瘤药物作为基体材料，采用静电纺丝技术加工成型，通过真空热处理干燥、固化样品，从而获得可生物降解、多层式、可程序性控制多种药物释放的控释药物植入剂。本发明采用静电纺丝/喷雾技术制备的程序性局部递送多种药物的控释药物植入剂具有多层结构，采用ptmc作为药物控释基体材料，pdlla作为药物渗透阻隔材料。pdlla具有较高的玻璃化转变温度，在人体体温环境中处于玻璃态，pdlla还具有较长的降解周期，对多种阿霉素和紫杉醇具有较低的渗透性；ptmc具有独特的表面降解行为，在人体环境中可经酶解作用进行表面溶蚀降解。13.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：14.本发明公开了一种控释药物植入剂的制备方法，包括如下步骤：15.(1)将聚丙交酯溶于第一溶剂，得到pdlla溶液；将pdlla溶液通过静电喷雾方式收集到接收器上，得到pdlla阻隔层；16.(2)将聚三亚甲基碳酸酯和第一药物活性成分溶于第二溶剂，得到含有第一药物活性成分的ptmc溶液；将含有第一药物活性成分的ptmc溶液通过静电纺丝方式收集到步骤(1)的pdlla阻隔层上，得到第一ptmc载药层；17.(3)将聚三亚甲基碳酸酯溶于第三溶剂，得到ptmc溶液；将ptmc溶液通过静电纺丝方式收集到步骤(2)的第一ptmc载药层上，得到ptmc间隔层；18.(4)将聚三亚甲基碳酸酯和第二药物活性成分溶于第四溶剂，得到含有第二药物活性成分溶剂的ptmc溶液；将含有第二药物活性成分溶剂的ptmc溶液通过静电纺丝方式收集到步骤(3)的ptmc间隔层上，得到第二ptmc载药层，即得控释药物植入剂。19.在一些实施例中，步骤(1)中，所述的第一溶剂为n,n-二甲基甲酰胺和碳酸二甲酯任意比例的混合物，优选为n,n-二甲基甲酰胺与碳酸二甲酯按照体积比为1：9的混合物；所述的聚丙交酯与第一溶剂的质量体积比为0.5g～1g：10ml，优选为0.8g～1g：10ml，更优选为1g：10ml。20.在一些实施例中，步骤(1)中，所述的静电喷雾，正高压为+4kv，负高压为-4kv，平移距离为10～15cm；所述的接收器，直径为0.5～2.0mm，优选为0.5mm；所述的pdlla阻隔层，厚度为50～100μm，优选为50～80μm，更优选为50μm。21.在一些实施例中，步骤(2)中，所述的第一药物活性成分为紫杉醇、多烯紫杉醇或亚甲基蓝；所述的第二溶剂为六氟异丙醇或三氟乙醇；所述的聚三亚甲基碳酸酯和第一药物活性成分的总质量与第二溶剂的质量体积比为0.05g～0.2g：10ml；所述的聚三亚甲基碳酸酯与第一药物活性成分的质量比为1.5～19：1。22.在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体外药物释放实验中，所述的第一药物活性成分为亚甲基蓝；所述的第二溶剂为六氟异丙醇；所述的聚三亚甲基碳酸酯和第一药物活性成分的总质量与第二溶剂的质量体积比为0.1g：10ml；所述的聚三亚甲基碳酸酯与第一药物活性成分的质量比为9：1。23.在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体内药物释放实验中，所述的第一药物活性成分为紫杉醇；所述的第二溶剂为三氟乙醇；所述的聚三亚甲基碳酸酯和第一药物活性成分的总质量与第二溶剂的质量体积比为0.2g：10ml；所述的聚三亚甲基碳酸酯与第一药物活性成分的质量比为4：1。24.在一些实施例中，步骤(2)中，所述的静电纺丝，正高压为+6kv，负高压为-2kv，平移距离为5～10cm；所述的第一ptmc载药层，厚度为30～120μm。25.在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体外药物释放实验中，所述的第一ptmc载药层，厚度为100μm。26.在一些实施例中，优选地，步骤(2)中，体内药物释放实验中，所述的第一ptmc载药层，厚度为30μm。27.在一些实施例中，步骤(3)中，所述的第三溶剂为三氟乙醇、六氟异丙醇、二氯甲烷与n,n-二甲基甲酰胺体积比为9：1的混合物、氯仿与n,n-二甲基甲酰胺体积比为9：1的混合物中的任意一种或几种的组合，优选为三氟乙醇；所述的聚三亚甲基碳酸酯与第三溶剂的质量体积比为0.05g～0.2g：10ml，优选为0.2g：10ml；所述的静电纺丝，正高压为+6kv，负高压为-2kv，平移距离为5～10cm；所述的ptmc间隔层，厚度为10～150μm。28.在一些实施例中，优选地，步骤(3)中，体外药物释放实验中，所述的ptmc间隔层，厚度为50～150μm，更优选为50μm、100μm或150μm。29.在一些实施例中，优选地，步骤(3)中，体内药物释放实验中，所述的ptmc间隔层，厚度为10～100μm，更优选为20～80μm，进一步优选为20μm。30.在一些实施例中，步骤(4)中，体外药物释放实验中，所述的第二药物活性成分为盐酸阿霉素或表阿霉素，优选为盐酸阿霉素；所述的第四溶剂为六氟异丙醇。31.在一些实施例中，步骤(4)中，体外药物释放实验中，所述的聚三亚甲基碳酸酯和第二药物活性成分的总质量与第四溶剂的质量体积比为0.05g～0.2g：10ml；所述的聚三亚甲基碳酸酯与第二药物活性成分的质量比为1.5～19：1。32.在一些实施例中，优选地，步骤(4)中，体外药物释放实验中，所述的聚三亚甲基碳酸酯和第二药物活性成分的总质量与第四溶剂的质量体积比为0.1g：10ml；所述的聚三亚甲基碳酸酯与第二药物活性成分的质量比为9：1。33.在一些实施例中，步骤(4)中，体内药物释放实验中，在制备含有第二药物活性成分溶剂的ptmc溶液时添加聚乙二醇，将聚三亚甲基碳酸酯、聚乙二醇和第二药物活性成分溶于第四溶剂，得到含有第二药物活性成分溶剂的ptmc溶液。34.在一些实施例中，步骤(4)中，体内药物释放实验中，所述的第二药物活性成分为盐酸阿霉素或表阿霉素，优选为盐酸阿霉素；所述的第四溶剂为六氟异丙醇。35.在一些实施例中，步骤(4)中，体内药物释放实验中，所述的聚乙二醇的数均分子量为600～20000da；所述的聚三亚甲基碳酸酯、聚乙二醇和第二药物活性成分的总质量与第四溶剂的质量体积比为0.05g～0.2g：10ml；所述的聚三亚甲基碳酸酯、聚乙二醇与第二药物活性成分的质量比为6～8：1：1～3。36.在一些实施例中，优选地，步骤(4)中，体内药物释放实验中，所述的聚乙二醇的数均分子量为4000da；所述的聚三亚甲基碳酸酯、聚乙二醇和第二药物活性成分的总质量与第四溶剂的质量体积比为0.1g：10ml；所述的聚三亚甲基碳酸酯、聚乙二醇与第二药物活性成分的质量比为8：1：1。37.在一些实施例中，步骤(4)中，所述的静电纺丝，正高压为+6kv，负高压为-2kv，平移距离为5～10cm；所述的第二ptmc载药层，厚度为17.5～100μm。38.在一些实施例中，优选地，步骤(4)中，体外药物释放实验中，所述的第二ptmc载药层，厚度为100μm。39.在一些实施例中，优选地，步骤(4)中，体内药物释放实验中，所述的第二ptmc载药层，厚度为17.5～70μm，更优选为17.5μm。40.上述的制备方法制备得到的控释药物植入剂也在本发明的保护范围之内。41.上述的控释药物植入剂在制备乳腺癌术后辅助治疗药物中的应用也在本发明的保护范围之内。42.除非另有说明，本发明中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。43.术语“术后治疗”是指肿瘤切除后，将植入剂直接放置于肿瘤手术切除处，缝合；植入剂在瘤床处局部释放药物，即达到局部递送效果。44.术语“乳腺癌术后辅助治疗”是指乳腺癌手术切除后的辅助治疗，通常是手术后给予的治疗，如化疗，放疗，靶向药治疗和内分泌药治疗等等，以消灭体内任何仍然残余的癌细胞。45.术语“程序性控制”或“控释”是指通过调节植入剂中ptmc间隔层的厚度，提前人为设定、调控药物的开始释放时间，即达到药物的“程序性”释放控制。46.术语“程控多药释放”是指通过调节植入剂中第一药物活性成分和第二药物活性成分负载层的厚度分别提前人为设定、调控第一药物活性成分和第二药物活性成分的释放持续时间，并且通过调节植入剂中ptmc间隔层的厚度，提前人为设定、调控第一药物活性成分和第二药物活性成分释放的间隔时间，即达到“程控多药释放”的效果。47.其中，上述控释药物植入剂的体外药物释放实验中，ptmc间隔层的厚度与第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间之间的关系如图1(c)所示，当ptmc间隔层的厚度为0μm时，第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间为0.2天；当ptmc间隔层的厚度为50μm时，第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间为1.3天；当ptmc间隔层的厚度为100μm时，第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间为2.9天；当ptmc间隔层的厚度为150μm时，第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间为3.4天。48.其中，上述控释药物植入剂的体内药物释放实验中，ptmc间隔层的厚度与第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间之间的关系如图3(a)所示，当ptmc间隔层的厚度为20μm时，第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间为4天。49.其中，上述的聚丙交酯(pdlla)可以按照现有技术其他方法制备，也可以按照以下方法进行制备：50.将聚合管预先加热干燥，然后迅速转移到干燥器中，冷却至室温；称量丙交酯(dl-la)装入聚合管中，加入辛酸亚锡(snoct2)，在室温下真空干燥。抽真空、通氮气，循环三次后，于真空状态下用喷枪高温火焰封管，再将反应体系完全浸入在油浴中进行加热反应。反应完毕后，将反应聚合管取出，冷却到室温，通过液氮冷冻破碎玻璃聚合管，再将取出的产物溶解于二氯甲烷中，于乙醇中沉淀提纯，并置于真空环境中干燥，即得pdlla材料。51.其中，所述的pdlla材料，数均分子量为50～500kda，分子量分布为1.0～2.5。52.其中，上述的聚三亚甲基碳酸酯(ptmc)可以按照现有技术其他方法制备，也可以按照以下方法进行制备：53.将聚合管预先加热干燥，然后迅速转移到干燥器中，冷却至室温；称量三亚甲基碳酸酯(tmc)装入聚合管中，加入辛酸亚锡(snoct2)，在室温下真空干燥。抽真空、通氮气，循环三次后，于真空状态下用喷枪高温火焰封管，再将反应体系完全浸入在油浴中进行加热反应。反应完毕后，将反应聚合管取出，冷却到室温，通过液氮冷冻破碎玻璃聚合管，再将取出的产物溶解于二氯甲烷中，于乙醇中沉淀提纯，并置于真空环境中干燥，即得ptmc材料。54.其中，所述的ptmc材料，数均分子量为200～500kda，分子量分布为1.0～2.5。55.有益效果：56.(1)本发明基于静电纺丝/喷雾法制备了用于乳腺癌术后辅助治疗的程序性局部递送阿霉素和紫杉醇的控释药物植入剂。相比以往利用挤出成型、模压成型等制备的传统的局部给药系统，本发明制备的植入剂具有多层结构，并且其多层结构的组成、尺寸可由静电纺丝/喷雾条件参数进行调控，因此本发明采用的方法具有定制化制备、精确化控制复杂多层管状结构的优势。57.(2)本发明利用pdlla的药物阻隔特性和ptmc的表面降解特性，精确调控的阿霉素和紫杉醇在不同时间点进行释放，实现了两种药物的程控序贯释放。相比传统只能实现单一药物缓释的局部给药系统而言，本法制备的植入剂可实现两种药物的程序性控制释放，为药物联合使用提供基础。58.(3)本发明采用的pdlla和ptmc生物可降解聚合物材料具有良好的生物安全性和生物可降解性，且均为fda批准的材料，具有丰富的临床使用经验。59.(4)本发明采用生物可降解聚合物材料开发的植入剂为全降解型装置，在体内可完全降解，无需二次手术取出，降低了对患者的进一步伤害。相比部分不可降解局部给药系统，该植入剂有效提高了患者依从性。60.(5)本发明开发的植入剂制备平台具有定制化特性，可根据临床的给药需求，进行定制化设计与制备满足临床不同给药方案的个性化局部给药系统。61.(6)本发明设计、制备的程序性局部递送阿霉素和紫杉醇的植入剂可在乳腺肿瘤手术部位大量释放抗肿瘤药物，并且实验观察到其脱靶部位药物浓度较低。相比标准临床系统性给药方案，本发明的植入剂给药方案具有提高抗乳腺癌复发和转移疗效、降低毒副作用的巨大优势。附图说明62.下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。63.图1为程控多药释放植入剂示意图及药物释放性能图。64.图2为程序性局部递送阿霉素和紫杉醇的控释植入剂的示意图及扫描电镜图像。65.图3为程序性局部递送阿霉素和紫杉醇的控释植入剂的体内药物释放和组织药物分布图。66.图4为程序性控制盐酸阿霉素-紫杉醇释放植入剂的抗乳腺癌术后肿瘤复发效果、动物体重变化和生存率评估图。67.图5为程序性控制盐酸阿霉素-紫杉醇释放植入剂的抗乳腺癌术后肿瘤转移效果。68.图6为实施例1制备得到的pdlla材料的核磁氢谱图。69.图7为实施例1制备得到的ptmc材料的核磁氢谱图。具体实施方式70.下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。71.盐酸阿霉素，纯度99％，购于上海毕得医药科技有限公司；72.紫杉醇，纯度98％，购于上海毕得医药科技有限公司；73.聚乙二醇，数均分子量4000da，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。74.亚甲基蓝，纯度98％，购于上海源叶生物科技有限公司。75.本发明实施例中所用的脂肪酶来自于米曲霉，该脂肪酶中酶活单位1u的定义是在给定的标准条件下，每分钟释放1μmol可滴定丁酸的酶量。76.实施例1：聚丙交酯和聚三亚甲基碳酸酯的制备77.聚丙交酯(pdlla)的制备：将聚合管预先在100℃下干燥6h，然后迅速转移到干燥器中，冷却至室温。称量50g丙交酯(dl-la)装入聚合管中，加入0.05g辛酸亚锡(snoct2)，在室温下真空干燥1h，随后抽真空、通氮气，循环三次后，于真空状态下用喷枪高温火焰封管，再将反应体系完全浸入在130℃的油浴中反应12h。反应完毕后，将反应聚合管取出，冷却到室温，通过液氮冷冻破碎玻璃聚合管，再将取出的产物溶解于二氯甲烷中，于乙醇中沉淀提纯，并置于40℃的真空环境中干燥48h，获得纯化的pdlla材料。78.制备得到的pdlla材料，数均分子量为120kda，分子量分布为1.89；pdlla材料的核磁氢谱图见图6。79.聚三亚甲基碳酸酯(ptmc)的制备：将聚合管预先在100℃下干燥6h，然后迅速转移到干燥器中，冷却至室温。称量三亚甲基碳酸酯50g(tmc)，装入聚合管中，加入0.025g辛酸亚锡(snoct2)，在室温下真空干燥1h，随后抽真空、通氮气，循环三次后，于真空状态下用喷枪高温火焰封管，再将反应体系完全浸入在130℃的油浴中反应12h。反应完毕后，将反应聚合管取出，冷却到室温，通过液氮冷冻破碎玻璃聚合管，再将取出的产物溶解于二氯甲烷中，于乙醇中沉淀提纯，并置于40℃的真空环境中干燥48h，获得纯化的ptmc材料。80.制备得到的ptmc材料，数均分子量为430kda，分子量分布为1.56；ptmc材料的核磁氢谱图见图7。81.实施例2：程序性局部递送多种药物的控释药物植入剂的制备及药物释放检测82.程序性局部递送多种药物的药物植入剂的制备：采用静电纺丝/喷雾技术制备程控多药释放植入剂，盐酸阿霉素(dox)和亚甲基蓝(mb)为模型药物。具体实验条件如下：环境温度40℃，湿度30％～50％rh；接收器为不锈钢丝(直径0.5mm)，接收器转速为60rpm，接收距离为5cm；注射针筒5ml，针头26g，工作液推注速度为2ml/h，针筒平移移速50cm/min。将实施例1制备的pdlla材料和ptmc材料用于本实施例中，按照如下顺序进行程控多药释放植入剂的制备：83.(1)将1.00g的pdlla溶解于10ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)与碳酸二甲酯(dmc)混合溶剂(dmf：dmc＝1：9v/v)制备pdlla溶液(10％g/ml)。将pdlla溶液在推注体积0.18ml、正高压+4kv、负高压-4kv、平移距离15cm的条件下，通过静电喷雾方式收集到接收器上，得到pdlla阻隔层，厚度为50μm。84.(2)将0.09g的ptmc和0.01g的亚甲基蓝(mb)溶解于10ml的六氟异丙醇制备ptmc(mb)溶液(1％g/ml)。将ptmc(mb)溶液在推注体积3.10ml、正高压+6kv、负高压-2kv、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(1)的pdlla阻隔层上，得到ptmc(mb)载药层，厚度为100μm。85.(3)将0.2g的ptmc溶解于10ml的三氟乙醇制备ptmc溶液(2％g/ml)。将ptmc溶液在正高压+6kv、负高压-2kv、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(2)的ptmc(mb)载药层上，得到ptmc间隔层。86.为获得不同厚度(0μm、50μm、100μm、150μm)的ptmc间隔层，推注体积分别设置为0ml、0.94ml、1.99ml、3.16ml。87.(4)将0.09g的ptmc和0.01g的盐酸阿霉素(dox)溶解于10ml的六氟异丙醇制备ptmc(dox)溶液(1％g/ml)。将ptmc(dox)溶液在正高压+6kv、负高压-2kv、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(3)的ptmc间隔层上，得到ptmc(dox)载药层。针对具有不同厚度(0μm、50μm、100μm、150μm)的ptmc间隔层的样品，为获得同一厚度(100μm)的ptmc(dox)载药层，推注体积分别设置为3.99ml、4.43ml、4.88ml、5.32ml。88.步骤(4)中不添加聚乙二醇(peg)，是因为本实施例制备的药物植入剂主要研究植入剂体外药物释放实验，体外的盐酸阿霉素释放不需要添加peg就可以快速释放。89.反应结束后，将载有样品的接收器取出，置于100℃的真空环境下干燥、固化4h。待自然冷却后，取下样品，切割成长度为1cm的程控多药释放植入剂。植入剂的长度由游标卡尺测量得到，厚度由千分尺测量得到。90.药物植入剂体外药物释放检测：将程控多药释放植入剂浸没于20ml的脂肪酶溶液(1000u/ml)，置于温度37℃、转速100rpm条件下评估药物释放性能。每隔12h取出所有溶液，再补充等量新鲜的脂肪酶溶液。通过多功能酶标仪分别检测取出溶液在480nm和664nm的吸光度，利用dox和mb标准曲线计算程控多药释放植入剂的dox和mb累计释放率，两种药物释放间隔时间与ptmc间隔层厚度的关系由药物累计释放曲线拟合得到，结果如图1所示，图1(a)为程控多药释放植入剂的结构示意图。91.如图1(c)所示，当ptmc间隔层的厚度为0μm时，第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间为0.2天；当ptmc间隔层的厚度为50μm时，第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间为1.3天；当ptmc间隔层的厚度为100μm时，第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间为2.9天；当ptmc间隔层的厚度为150μm时，第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间为3.4天。92.由图1(b)、图1(c)可知，在第一种药物(dox)释放完毕后，ptmc间隔层的设计有效延缓了第二种药物(mb)的起始释放点，植入剂的药物释放间隔时间与ptmc间隔层厚度呈现良好的线性关系。因此，两种药物的释放时间具有程序性可控性，表明程控多药释放植入剂可通过改变ptmc间隔层厚度调控不同药物之间的释放间隔时间。93.实施例3：程序性局部递送阿霉素和紫杉醇的植入剂的制备及药物递送研究94.程序性局部递送阿霉素和紫杉醇的植入剂的制备：阿霉素和紫杉醇作为乳腺癌术后辅助化疗的一线药物，在临床实践中主要采用序贯方案进行给药，因其同时给药将影响其代谢过程，从而造成较为严重的血液毒性和心肌毒性等毒副作用。基于此，本发明采用静电纺丝/喷雾技术制备程序性控制盐酸阿霉素-紫杉醇序贯释放的植入剂，盐酸阿霉素(dox)和紫杉醇(ptx)为药物，ptmc作为间隔层。具体实验条件如下：环境温度40℃，湿度30％～50％rh；接收器为不锈钢丝(直径0.5mm)，接收器转速为60rpm，接收距离为5cm；注射针筒5ml，针头26g，工作液推注速度为2ml/h，针筒平移移速50cm/min。将实施例1制备的pdlla材料和ptmc材料用于本实施例中，按照如下顺序进行植入剂的制备：95.(1)将1.00g的pdlla溶解于10ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)与碳酸二甲酯(dmc)混合溶剂(dmf：dmc＝1：9v/v)制备pdlla溶液(10％g/ml)。将pdlla溶液在推注体积0.18ml、正高压+4kv、负高压-4kv、平移距离15cm的条件下，通过静电喷雾方式收集到接收器上，得到pdlla阻隔层，厚度为50μm。96.(2)将0.16g的ptmc和0.04g的紫杉醇(ptx)溶解于10ml的三氟乙醇制备ptmc(ptx)溶液(2％g/ml)。将ptmc(ptx)溶液在推注体积0.42ml、正高压+6kv，负高压-2kv、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(1)的pdlla阻隔层上，得到ptmc(ptx)载药层，厚度为30μm。97.(3)将0.2g的ptmc溶解于10ml的三氟乙醇制备ptmc溶液(2％g/ml)。将ptmc溶液在推注体积0.30ml、正高压+6kv、负高压-2kv、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(3)的ptmc(ptx)载药层上，得到ptmc间隔层，厚度为20μm。98.(4)将0.08g的ptmc、0.01g的聚乙二醇(peg，4000da)和0.01g的盐酸阿霉素(dox)溶解于10ml的六氟异丙醇制备ptmc/peg(dox)溶液(1％g/ml)。将ptmc/peg(dox)溶液在推注体积0.56ml、正高压+6kv，负高压-2kv、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(3)的ptmc间隔层上，得到ptmc/peg(dox)载药层，厚度为17.5μm，即得dox-ptx序贯释放植入剂。99.反应结束后，将载有样品的接收器取出，置于100℃的真空环境下干燥、固化4h。待自然冷却后，取下样品，切割成长度为1cm的延时药物释放植入剂。植入剂的长度由游标卡尺测量得到，厚度由千分尺测量得到。100.药物递送研究-植入剂体内药物释放测试：将程序性控制dox-ptx释放植入剂(样品×2，2个植入剂的剂量dox 5mg/kg、ptx 15mg/kg)经紫外灯灭菌1h后，通过16g组织穿刺针植入到雌性、20g的4t1原位荷瘤balb/c小鼠的瘤床。每隔24h时间取出样品(同一批实验中有多只小鼠参与，每24h检测一次牺牲一只小鼠，并取出其体内的样品)，溶解于0.5ml二甲基亚砜，3000rpm、3min离心。取上清液100μl，通过多功能酶标仪检测480nm的吸光度，利用dox标准曲线计算dox累计释放率。取上清液200μl，加入800μl乙腈，通过高效液相色谱(hplc)检测ptx的累计释放率。101.药物递送研究-体内药物分布：给药24h后，取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肿瘤。取出的组织样品分别加入1ml的kh2po4溶液(20mm，ph＝2.8)匀浆，取200μl匀浆液，加入到2ml的naoh(1m)中，用1ml氯仿萃取，干燥后，用1ml的dmso溶解。经3000rpm、3min离心后，取上清液，通过荧光分光光度计检测并计算dox的组织浓度(λex＝480nm，λem＝586nm)。102.分别取不同组织样品200μl匀浆液，加入20μl多烯紫杉醇(2μg/ml)作为内标，加入700μl甲醇沉淀，涡旋5min，13000rpm、10min离心，取500μl上清液，利用氮气吹干仪吹干，加入200μl乙腈/水(9/1)混合溶剂复溶，涡旋5min，13000rpm、5min离心，取120μl上清液，采用液相色谱-质谱联用技术(hplc-ms)检测上清液的ptx含量。103.小鼠静脉注射gox和ptx：将雌性、20g的4t1原位荷瘤balb/c小鼠通过尾静脉注射dox 100μl(注射剂量dox 5mg/kg)和ptx 250μl(注射剂量ptx 15mg/kg)。104.由图2(a)、图2(b)可知，程序性局部递送阿霉素和紫杉醇的植入剂的截面表现为多层结构，分别由pdlla阻隔层、ptmc(ptx)载药层、ptmc间隔层和ptmc/peg(dox)载药层组成。105.如图3(a)、图3(b)所示，植入剂在小鼠体内可实现dox和ptx的程序性控制释放。当dox释放完毕后(第一周期，第0～6天)，由于间隔层的存在，第6～10天进入休息期，此间dox与ptx释放速率极低；第10天开始，药物释放进入第二周期，此时ptx开始释放，且ptx至第16天已基本释放完毕(累计释放率为84.5％)。106.其中，如图3(a)所示，当ptmc间隔层的厚度为20μm时，第一ptmc载药层与第二ptmc载药层中药物活性成分的间隔释放时间为4天。107.如图3(c)、图3(d)所示，每个周期结束后的24h内，实验检测植入剂给药方案的肿瘤内dox和ptx药物浓度分别比静脉注射给药方案(dox 5mg/kg，ptx 15mg/kg)组高5.9和12.3倍，而植入剂组中小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的药物浓度比静脉给药组低4.8～46.6倍，表明植入剂可实现在肿瘤内大量释放dox和ptx，并且可大大降低全身药物浓度分布。108.实施例4：程序性局部递送阿霉素和紫杉醇的植入剂在乳腺癌术后辅助治疗的应用109.本发明进一步建立小鼠4t1原位乳腺癌术后模型，以评估控释植入剂的抗肿瘤复发及转移效果。110.小鼠4t1原位乳腺癌术后模型建立：将4t1乳腺癌细胞离心(1000rpm，3min)收集，并用pbs(ph＝7.4，0.01m)洗涤后，将所得到的细胞悬浮液(细胞密度为1×106个每只小鼠)通过皮下注射到雌性balb/c小鼠(18g)的腹部乳腺脂肪垫，观察肿瘤的生长情况并测量肿瘤的尺寸。肿瘤的尺寸用游标卡尺测量计算得到，具体计算公式如下：111.v＝w2×l/2112.其中，v代表肿瘤体积，w为肿瘤的宽度，l为肿瘤的长度。113.当乳腺肿瘤长至约300mm3时，手术切除～90％体积的肿瘤，在手术的瘤床处直接植入程序性控制dox-ptx释放植入剂(样品×2，实施例3制备得到，2个植入剂的剂量dox 5mg/kg、ptx 15mg/kg)，缝合。114.空白植入剂的制备：115.(1)将1.00g的pdlla溶解于10ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)与碳酸二甲酯(dmc)混合溶剂(dmf：dmc＝1：9v/v)制备pdlla溶液(10％g/ml)。将pdlla溶液在推注体积0.18ml、正高压+4kv、负高压-4kv、平移距离15cm的条件下，通过静电喷雾方式收集到接收器上，得到pdlla阻隔层，厚度为50μm。116.(2)将0.2g的ptmc溶解于10ml的三氟乙醇制备ptmc溶液(2％g/ml)。将ptmc溶液在推注体积1.56ml、正高压+6kv、负高压-2kv、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(1)的pdlla阻隔层上，得到ptmc空白聚合物层，厚度为100μm，即得空白植入剂。117.dox+ptx同时释放植入剂的制备：118.(i)将1.00g的pdlla溶解于10ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)与碳酸二甲酯(dmc)混合溶剂(dmf：dmc＝1：9v/v)制备pdlla溶液(10％g/ml)。将pdlla溶液在推注体积0.18ml、正高压+4kv、负高压-4kv、平移距离15cm的条件下，通过静电喷雾方式收集到接收器上，得到pdlla阻隔层，厚度为50μm。119.(ii)将0.16g的ptmc和0.04g的紫杉醇(ptx)溶解于10ml的三氟乙醇制备ptmc(ptx)溶液(2％g/ml)。将ptmc(ptx)溶液在推注体积0.42ml、正高压+6kv，负高压-2kv、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(i)的pdlla阻隔层上，得到ptmc(ptx)载药层，厚度为30μm，得到单独释放ptx的植入剂。120.(iii)将0.08g的ptmc、0.01g的聚乙二醇(peg，4000da)和0.01g的盐酸阿霉素(dox)溶解于10ml的六氟异丙醇制备ptmc/peg(dox)溶液(1％g/ml)。将ptmc/peg(dox)溶液在推注体积0.56ml、正高压+6kv，负高压-2kv、平移距离10cm的条件下，通过静电纺丝方式收集到步骤(i)的pdlla阻隔层上，得到ptmc/peg(dox)载药层，厚度为20μm，得到单独释放dox的植入剂。将步骤(ii)制备得到的单独释放ptx的植入剂和步骤(iii)制备得到的单独释放dox的植入剂进行组合，即得dox+ptx同时释放植入剂。121.空白植入剂组的小鼠处理方法同上，植入的是不含药物的空白植入剂(样品×2)对照。122.dox+ptx同时释放植入剂组的小鼠处理方法同上，植入的是可同时释放dox和ptx的植入剂(dox+ptx同时释放植入剂×2)。123.生理盐水静脉注射组：手术后直接缝合，然后在术后第1、4、7天分别通过尾静脉注射100μl生理盐水。124.dox+ptx同时静脉注射组：手术后直接缝合，然后在术后第1、4、7天分别通过尾静脉注射dox 100μl和ptx 250μl，剂量分别是dox 5mg/kg、ptx 15mg/kg。125.dox-ptx序贯静脉给药组：手术后直接缝合，然后在术后第1、4、7天通过尾静脉注射dox 100μl，术后第10、13、16天通过尾静脉注射ptx 250μl，剂量分别是dox 5mg/kg、ptx 15mg/kg。126.图4中g1为生理盐水静脉注射组，g2为dox-ptx序贯静脉给药组，g3为dox+ptx同时静脉给药组，g4为空白植入剂植入组，g5为dox+ptx同时释放植入剂植入组，g6为程序性控制dox-ptx释放植入剂植入组。127.如图4(a)和图4(d)所示，当4t1乳腺肿瘤增长到～300mm3时，切除～90％的原发乳腺肿瘤，并植入植入剂。实验结果表明，在术后22天的观察期内，程序性控制dox-ptx释放植入剂显著抑制了4t1乳腺肿瘤的复发，小鼠荷瘤测量尺寸在术后22天仅为23.6mm3，其抗肿瘤复发效果显著优于其他对照组。128.如图4(b)所示，dox和ptx静脉给药后，动物体重显著下降了15％～18％，表明静脉给药方案具有较为严重的全身毒性。实验设置的dox+ptx同时释放植入剂方案给药后，小鼠体重出现了一定程度上的下降，提示药物毒副作用的存在。而程序性控制dox-ptx释放植入剂治疗方案并不会引起动物体重的显著变化，表明其治疗方案具有良好的安全性。129.如图4(c)所示，在为期75天的生存率评估实验中，经程序性控制dox-ptx释放植入剂方案治疗后的小鼠生存率达到83.3％，显著提高了乳腺癌术后的生存率。130.图5中g1为生理盐水静脉注射组，g2为dox-ptx序贯静脉给药组，g3为dox+ptx同时静脉给药组，g4为空白植入剂植入组，g5为dox+ptx同时释放植入剂植入组，g6为程序性控制dox-ptx释放植入剂植入组。131.如图5所示，对小鼠的肺部组织进行bouin's固定液染色和苏木精-伊红(h&e)染色，在生理盐水、空白植入剂及静脉给药组的小鼠肺部可发现肿瘤转移灶，而经程序性控制dox-ptx释放植入剂给药方案显著抑制了乳腺癌肿瘤转移。132.本发明提供了一种控释药物植入剂及其制备方法与其在制备乳腺癌术后辅助治疗药物中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。









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