联合磷酸糖酶与ATP再生系统合成D-阿洛酮糖的方法

有机化合物处理,合成应用技术联合磷酸糖酶与atp再生系统合成d-阿洛酮糖的方法技术领域1.本发明属于合成生物技术领域，具体涉及一种联合磷酸糖酶与atp再生系统合成d-阿洛酮糖的方法。背景技术：2.d-阿洛酮糖是d-果糖在c-3位的差向异构体，在自然界中含量稀少，甜度为蔗糖的70％，能量仅占0.3％。同时，d-阿洛酮糖被美国食品药品监督管理局评为“gras”安全级，允许将其添加在食品、膳食补充剂以及医药制剂中。d-阿洛酮糖具有许多有益人体健康的特殊功能，例如摄入适量的d-阿洛酮糖可以降低血糖血脂水平、减少脂肪堆积、清除活性氧的活性等，因此受到越来越多的关注，而开发一种高效生产d-阿洛酮糖的方法成为了满足市场增长的必要条件。3.近年来大多数研究者用d-阿洛酮糖3-差向异构酶(dpease)催化d-果糖合成d-阿洛酮糖。不同来源的dpease在大肠杆菌中异源表达时，d-果糖至d-阿洛酮糖的平衡转化率可以达到20-30％。最近也有研究者将底物d-果糖替换为易得、低价的d-葡萄糖，由葡萄糖异构酶与d-阿洛酮糖-3-差向异构酶共表达合成d-阿洛酮糖。双酶体系表达中，d-葡萄糖合成d-阿洛酮糖的平衡转化率在12％-16％之间，但底物和中间底物积累严重。现有一种两步法是利用l-鼠李树胶糖激酶，将d-阿洛酮糖磷酸化为d-阿洛酮糖-1-磷酸，提高催化体系平衡反应转化率，再使用去磷酸化策略将磷酸基团脱去，转变为d-阿洛酮糖。该法尽管提高了转化效率，但由于它需要两步进行在实际生产中操作更加繁琐，耗费较长的时间，从而导致影响生产效率。我们现在开发出一种一步生产阿洛酮糖的方法，在操作上更加便捷。技术实现要素：4.本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种联合糖酵解与atp再生系统的全细胞合成d-阿洛酮糖的方法，利用该方法可以提高d-阿洛酮糖的产率。5.为解决上述技术发明，本发明的技术方案是：6.一种利用磷酸糖酶联动合成d-阿洛酮糖的方法，以d-葡萄糖为底物，加入重组大肠杆菌湿菌体后及辅因子后进行全细胞催化反应制得；所述的重组大肠杆菌至少同时表达葡萄糖激酶glk、6-磷酸葡萄糖异构酶pgi、d-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶a6pe、d-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶a6pp。7.所述的重组大肠杆菌同时表达葡萄糖激酶glk、6-磷酸葡萄糖异构酶pgi、d-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶a6pe、d-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶a6pp和腺苷激酶adk。8.所述的重组大肠杆菌按以下方法进行构建：将葡萄糖激酶基因glk插入在质粒pcdfduet-1上，得到重组质粒prsfduet-glk；将6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi连接在prsfduet-glk上，得到重组质粒prsfduet-glk-pgi；将d-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶基因a6pe与d-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶基因a6pp连接到载体petduet-1上，得到重组质粒petduet-a6pe-a6pp；将腺苷酸酶基因adk连接到质粒pacycduet-1上，酶切位点是bamhi,hindiii，得到重组质粒pacycduet-adk；再将重组质粒petduet-a6pe-a6pp、重组质粒prsfduet-glk-pgi和重组质粒pacycduet-adk转化至大肠杆菌bl21(de3)中，得到重组大肠杆菌。9.所述的葡萄糖激酶基因glk来源于bacillus sp.，所述的6-磷酸葡萄糖异构酶基因pgi来源于clostridium bolteae atccbaa-613，所述的腺苷酸酶基因adk来源于大肠杆菌bl21。10.所述全细胞催化反应条件是：ph7-10，反应温度为30-50℃，反应时间12-18h，反应时添加辅因子；所述辅因子为金属离子和腺苷三磷酸，所述的金属离子至少为mg2+、mn2+、co2+、ca2+之一。11.所述的mg2+添加量为5～20mm，腺苷三磷酸的添加量为16～40mm，以d-葡萄糖为底物，底物浓度为20～100g/l。12.所述全细胞催化反应以d-葡萄糖为底物，底物浓度为20g/l，mg2+的添加量为：5mm，腺苷三磷酸的添加量为5mm，反应温度37℃，ph为7.5。13.所述湿菌体制备按以下操作进行：将重组大肠杆菌接种到lb培养基中培养，采用iptg在20℃条件下诱导20-24h,收集得到湿菌体。14.所述的lb培养基按以下组分制备：5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、10g/l氯化钠。15.所述的将重组大肠杆菌接种到lb培养基中培养的接种量为：1％。16.本发明的有益效果如下：17.本发明在重组大肠杆菌构建时以糖酵解新途径为基础构建磷酸糖酶体系合成d-阿洛酮糖，d-葡萄糖产率最高可达到51％。18.本发明联合磷酸糖酶和过表达腺苷激酶提升胞内atp含量及实现催化反应时atp循环再生，减少了外源atp供给，外源atp消耗减少为对照组的60％。19.本发明以d-葡萄糖为底物进行转化，d-葡萄糖作为自然界中一种成本低廉、易获得的单糖，相对于常规合成d-阿洛酮糖所用的果糖，能有效降低制备成本。20.本发明而相对比纯酶反应，不需要繁琐的蛋白纯化过程，操作简单方便，并且全细胞更能适应外界环境变化，胞内的辅酶因子也能对多酶级联反应起到积极作用，更能适应工业化生产，并且产物也相对容易分离。21.本发明一步法合成d-阿洛酮糖,相较于前人两步法合成d-阿洛酮糖来说，该法在操作上更加便捷，在工业应用中所费时间和人力更加少，可以有效提高了转化效率。附图说明22.图1为本发明的工艺流程图；23.图2为本发明的反应流程图；24.图中glk:葡萄糖激酶；pgi:6-磷酸葡萄糖异构酶；a6pe:d-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶，a6pp:d-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶；adk：腺苷激酶。具体实施方式25.下面结合具体实例来进一步说明。若为特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1-12是利用磷酸糖酶构建合成d-阿洛酮糖的新途径，而实施例13-22是在磷酸糖酶新途径合成d-阿洛酮糖的基础上将其与atp再生系统联合进一步提高以d-葡萄糖为底物合成d-阿洛酮糖的平衡转化率，将实施例1-12与实施例13-22进行对比，观测期所用外源atp使用量的变化。26.本发明实施例中所用到的原料和试剂均为常规化学试剂，均能通过商业渠道购买得到。lb培养基按以下组分制备：5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、10g/l氯化钠。27.实施例128.本实施例是利用磷酸糖酶联动合成d-阿洛酮糖方法的一个实施例，作为与过表达腺苷激酶提升胞内atp含量的对比实施例，具体步骤如下：29.(1)重组大肠杆菌构建：30.重组质粒prsfduet-glk的构建：以来源于clostridium bolteae atccbaa-613的glk基因片段为模板，以glk-f:tcatcaccacagccaggatccgatgacaaagtatgcattagtcggt(bamhi)为上游引物，以glk-r:tgcggccgcaagcttgtcgacagaatgtgacctaaggtctgg(noti)为下游引物进行pcr扩增，用限制性内切酶bamhi和noti分别对质粒prsfduet-1在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒对基因片段和质粒prsfduet-1进行重组连接，得到重组质粒prsfduet-glk。31.重组质粒prsfduet-glk-pgi构建：以来源于clostridium bolteae atccbaa-613的pgi基因片段为模板,以pgi-f:agatatacatatggcagatctcatgaaaaacatcaatccaacgcag(bglii)为上游引物，pgi-r:ggtttctttaccagactcgagttaaccgcgccacgctttata(xhoi)为下游引物进行pcr扩增，用限制性内切酶bglii和xhoi分别对质粒prsfduet-glk在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒对基因片段和质粒prsfduet-glk进行重组连接，得到重组质粒prsfduet-glk-pgi。32.重组质粒petduet-a6pe构建：以大肠杆菌a6pe基因组为模板，以a6pe-f:tcatcaccacagccaggatccgatgatgaaaatctccccctcgttaatg(bamhi)为上游引物，以a6pe-r:gcattatgcggccgcaagcttttatgctgtttttgcatgaggct(hindiii)为下游引物进行pcr扩增，用限制性内切酶bamhi和hindiii分别对质粒petduet-1在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒进行同源重组连接，得到重组质粒petduet-a6pe；33.重组质粒petduet-a6pe-a6pp构建：以大肠杆菌bl21基因组为模板，以a6pp-f:agatatacatatggcagatctcatgaaatacaccgtttacctgttcg(bglii)为上游引物，以a6pp-r:agcggtttctttaccagacgttacagcgggcaaccgc(xhoi)为下游引物进行pcr扩增，用限制性内切酶bglii和xhoi分别对质粒petduet-a6pe在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒进行同源重组连接，得到重组质粒petduet-a6pe-a6pp；34.重组质粒prsfduet-glk-pgi和重组质粒petduet-a6pe-a6pp转化：将重组质粒prsfduet-glk-pgi和重组质粒petduet-a6pe-a6pp共同转化至大肠杆菌bl21(de3)中；35.(2)湿菌体制备：将重组大肠杆菌在lb培养基中37℃培养，至od600为0.6-1.0时，加入终浓度为1mm iptg,16-25℃诱导16-24h,8000r/min离心发酵液后经pbs缓冲液重悬再离心后得到湿菌体；36.(3)全细胞催化反应：以d-葡萄糖为底物，d-葡萄糖浓度为20g/l，温度控制为：30℃，以磷酸缓冲液为反应液，ph为6.5，加入辅因子atp和金属离子，atp加入量为40mm、金属离子为20mm的mg2+，以及重组大肠杆菌经过诱导后的湿菌体，湿菌体的浓度为25g/l，经过12-18h催化反应，其中反应体系为1ml。37.(4)通过高效液相色谱(hplc)检测底物d-葡萄糖的消耗和d-阿洛酮糖的产生，并计算转化率。38.hplc检测条件如下：色谱分析柱carbomix-pb-np10:8％(7.8×300mm),流动相为超纯水，流速为0.5ml/min,柱温78℃，示差(ri)检测器,其中d-葡萄糖标准品保留时间为14.28min，d-果糖标准品保留时间为20.12min，d-阿洛酮糖标准品保留时间为34.83min。39.实施例240.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为35℃，ph为7.0，其余操作均与实施例1操作相同。41.实施例342.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，ph为7.5，加入atp，加入量30mm，其余操作均与实施例1操作相同。43.实施例444.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为40℃，ph为8.0，其余操作均与实施例1操作相同。45.实施例546.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，ph为7.5，其余操作均与实施例1操作相同。47.实施例648.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，ph为7.5，金属离子为20mm co2+其余操作均与实施例1操作相同。49.实施例750.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，ph为7.5，金属离子为20mm ca2+，其余操作均与实施例1操作相同。51.实施例852.全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为温度为37℃，ph为7.5，金属离子为20mm mn2+，其余操作均与实施例1操作相同。53.实施例954.全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为温度为底物浓度为30g/l，37℃，ph为7.5，其余操作均与实施例1操作相同。55.实施例1056.全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为温度为底物浓度为50g/l，37℃，ph为7.5，其余操作均与实施例1操作相同。57.实施例1158.全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为温度为底物浓度为60g/l，37℃，ph为7.5，其余操作均与实施例1操作相同。59.实施例1260.全细胞催化反应时整个反应体系的金属离子为温度为底物浓度为100g/l，37℃，ph为7.5，其余操作均与实施例1操作相同。61.实施例1362.本实施例是联合磷酸糖酶与atp循环系统生产d-阿洛酮糖的方法的另一个实施例，具体步骤如下：63.(1)重组大肠杆菌构建：64.重组质粒prsfduet-glk-pgi和重组质粒petduet-a6pe-a6pp构建：参照实施例1；65.重组质粒pacycduet-adk的构建：以大肠杆菌bl21基因组为模板，以adk-f:tcatcaccacagccaggatccgatgcgtatcattctgcttggc(bamhi)为上游引物，以adk-r:gcattatgcggccgcaagcttttagccgaggattttttccagatca(hindiii)为下游引物进行pcr扩增，用限制性内切酶bamhi和hindiii分别对质粒pacycduet-1在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒进行同源重组连接，得到重组质粒pacycduet-adk；66.重组质粒prsfduet-glk-pgi、重组质粒petduet-a6pe-a6pp和重组质粒pacycduet-adk转化：将重组质粒prsfduet-glk-pgi、重组质粒petduet-a6pe-a6pp和重组质粒pacycduet-adk共同转化到大肠杆菌bl21(de3)中，得到重组大肠杆菌；67.(2)湿菌体制备：参照实施例1；68.(3)全细胞催化反应：以d-葡萄糖为底物，d-葡萄糖浓度为20g/l，加入atp，加入量为25mm,金属离子为mg2+，加入量为5mm及重组大肠杆菌经诱导后的湿菌体，湿菌体的浓度为25g/l，调节ph至8.0，控制反应温度为35℃，经过12-18h的催化反应；69.实施例1470.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，ph为7.0其余操作均与实施例13操作相同。71.实施例1572.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，调节ph至7.5，其余操作均与实施例13操作相同。73.实施例1674.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，ph为8.0，其余操作均与实施例13操作相同。75.实施例1776.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为35℃，ph为7.5，其余操作均与实施例13操作相同。77.实施例1878.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为40℃，ph为7.5，其余操作均与实施例13操作相同。79.实施例1980.全细胞催化反应时整个反应体系的温度为37℃，ph为7.5,加入atp，加入量16mm，其余操作均与实施例13操作相同。81.实施例2082.全细胞催化反应时整个反应体系的底物浓度为30g/l，温度为37℃，ph为7.5,加入atp，加入量16mm，其余操作均与实施例13操作相同。83.实施例2184.全细胞催化反应时整个反应体系的底物浓度为50g/l，温度为37℃，ph为7.5,其余操作均与实施例13操作相同。85.实施例2286.全细胞催化反应时整个反应体系的底物浓度为100g/l，温度为37℃，ph为7.5,其余操作均与实施例13操作相同。87.本发明实施例1-12中的d-阿洛酮糖的转化率分别见表1，本发明实施例13-22中的d-阿洛酮糖的转化率分别见下表2。88.表189.实施例底物浓度温度ph金属离子atp浓度湿菌体浓度转化率实施例120g/l30℃6.520mmmg2+40mm25g/l39％实施例220g/l35℃7.020mmmg2+40mm25g/l33％实施例320g/l37℃7.520mmmg2+30mm25g/l38％实施例420g/l40℃8.020mmmg2+40mm25g/l36％实施例520g/l37℃7.520mmmg2+40mm25g/l50％实施例620g/l37℃7.520mmco2+40mm25g/l37％实施例720g/l37℃7.520mmca2+40mm25g/l35％实施例820g/l37℃7.520mmmn2+40mm25g/l40％实施例930g/l37℃7.520mmmg2+40mm25g/l45％实施例1050g/l37℃7.520mmmg2+40mm25g/l43％实施例1160g/l37℃7.520mmmg2+40mm25g/l42％实施例12100g/l37℃7.520mmmg2+40mm25g/l41％90.表2[0091][0092][0093]通过表1和表2数据可以发现，本发明以d-葡萄糖为底物，经重组大肠杆菌构建、湿菌体制备、全细胞催化反应制取d-阿洛酮糖。该工艺技术与现有技术可以大大提高d-阿洛酮糖的转化率，此外将表1中的实施例1-12与表2中的实施例13-22对比可以发现，实施例5与实施例15、实施例10与实施例21以及实施例12与实施例22中选择重组大肠杆菌(可同时表达葡萄糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、d-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶和d-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶和腺苷激酶)经过诱导后的湿菌体，在转化率相似的情况下，外源atp消耗减少为原来的60％，在辅因子方面节约了成本。[0094]以上所述仅为本发明的较佳实例而已，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。[0095]本发明的原理如下：[0096]葡萄糖激酶是一种己糖激酶，在atp的存在下，催化葡萄糖转变为6-磷酸葡萄糖。葡萄糖-6-磷酸异构酶是糖酵解和糖异生的重要的酶类,可以实现催化d-葡萄糖-6-磷酸盐和d-果糖-6-磷酸盐之间的互换，这样可以将合成d-阿洛酮糖的底物由果糖换成更为低价的葡糖糖。接着再由d-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶、d-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶将果糖催化成阿洛酮糖。通过联合磷酸糖酶和atp再生系统高效合成d-阿洛酮糖，将葡萄糖激酶、6-磷酸葡萄糖异构酶、d-阿洛酮糖-6-磷酸-3差向异构酶、d-阿洛酮糖-6-磷酸-磷酸酯酶在大肠杆菌中表达，同时，过表达腺苷激酶(adk)，有效提高大肠杆菌胞内atp含量，促进多酶催化反应进行。









图片声明：本站部分配图来自人工智能系统AI生成,觅知网授权图片,PxHere摄影无版权图库。本站只作为美观性配图使用,无任何非法侵犯第三方意图,一切解释权归图片著作权方,本站不承担任何责任。如有恶意碰瓷者,必当奉陪到底严惩不贷!




内容声明：本文中引用的各种信息及资料（包括但不限于文字、数据、图表及超链接等）均来源于该信息及资料的相关主体（包括但不限于公司、媒体、协会等机构）的官方网站或公开发表的信息。部分内容参考包括:(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供参考使用,不准确地方联系删除处理！本站为非盈利性质站点,发布内容不收取任何费用也不接任何广告!




免责声明：我们致力于保护作者版权，注重分享，被刊用文章因无法核实真实出处，未能及时与作者取得联系，或有版权异议的，请联系管理员，我们会立即处理，本文部分文字与图片资源来自于网络，部分文章是来自自研大数据AI进行生成,内容摘自(百度百科,百度知道,头条百科,中国民法典,刑法,牛津词典,新华词典,汉语词典,国家院校,科普平台)等数据,内容仅供学习参考,不准确地方联系删除处理!的,若有来源标注错误或侵犯了您的合法权益，请立即通知我们，情况属实，我们会第一时间予以删除，并同时向您表示歉意,谢谢!