一种可用于无痕遗传转化菌株的制备

有机化合物处理,合成应用技术1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种可用于无痕遗传转化菌株的制备。背景技术：2.乳清酸5′‑磷酸脱羧酶(omp脱羧酶)是参与嘧啶生物合成的关键酶，催化乳清酸单磷酸(omp)脱羧形成尿苷单磷酸(ump)。在尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)中，合成omp脱羧酶的基因为ura3。ura3基因缺失的突变体表现为尿嘧啶营养缺陷，需要依赖外源的尿苷、尿嘧啶才能正常生长。同时，5-氟乳清酸(5-foa)可以作为omp脱羧酶的底物，被转化为毒性中间体5-氟-ump，它是一种嘧啶类似物，可以掺入核酸链中代替尿嘧啶或胸腺嘧啶，干扰rna和dna的加工，影响其功能，最终导致细胞死亡。因此，可以通过添加5-foa、尿苷、尿嘧啶对ura3基因的缺失突变体进行筛选。3.尖孢镰刀菌是引起植物枯萎病和根腐病的主要病原物，从寄主植物根部侵入，沿着维管束向上侵染，造成作物大规模减产，严重影响产量和品质。尿嘧啶营养缺陷型尖孢镰刀菌的制备有利于增加其遗传研究工具的数量和灵活性，为更好地开展尖孢镰刀菌致病机理的研究奠定基础，从而能更有效的控制枯萎病和根腐病的传播和发展，减少经济损失。技术实现要素：4.本发明通过peg介导的真菌原生质体转化，利用转化片段与基因组中目的基因片段的同源置换，构建了可用于无痕遗传转化的尖孢镰刀菌ura3缺失突变体，为尖孢镰刀菌遗传特性的研究提供了新的工具。本发明的技术方案如下：5.尖孢镰刀菌ura3缺失突变体的制备方法，步骤如下：6.提取尖孢镰刀菌基因组dna。利用引物对up-f/r、down-f/r分别扩增尖孢镰刀菌ura3基因的5′端上游片段和3′端下游片段。将上游片段和下游片段进行pcr融合，形成融合片段。将融合片段通过peg介导转化至尖孢镰刀菌原生质体中，并在含有5-foa、尿苷和尿嘧啶的培养基上培养，筛选得到尖孢镰刀菌ura3的缺失突变体。7.本发明提供了一种尖孢镰刀菌ura3缺失突变体在无痕遗传转化中的应用，是将尖孢镰刀菌ura3缺失突变体作为出发菌，以尿嘧啶营养缺陷作为筛选标记进行目的基因敲除，在不引入新的抗性基因的前提下实现无痕遗传转化。8.本发明提供了一种以尿嘧啶营养缺陷为筛选标记进行目的基因敲除的方法，具体步骤如下：9.以尖孢镰刀菌dna作为模板，利用引物扩增获得ura3基因片段、目的基因的上游片段和下游片段。之后对目的基因的上游片段、ura3片段以及下游片段按照摩尔质量比1:3:1进行pcr融合，扩增获得转化所需融合片段。以尖孢镰刀菌ura3缺失突变体为出发菌株，制备尖孢镰刀菌ura3缺失突变体原生质体，peg介导融合片段转化原生质体。将转化子在不添加尿苷、尿嘧啶和5-foa的培养基上培养，能够正常生长的菌株被筛选为目的基因敲除的尖孢镰刀菌。10.本发明的有益效果为：11.本发明的方法能够准确、有效的敲除尖孢镰刀菌的ura3基因，在不引入其他影响尖孢镰刀菌原本遗传性状的抗性基因情况下，构建出遗传性能稳定的尖孢镰刀菌尿嘧啶营养缺陷型菌株，从而能够应用于其它目的基因的定点敲除，实现无抗性标记的遗传转化。附图说明12.图1为尖孢镰刀菌ura3基因敲除策略图；13.图2为转化片段的电泳图，其中电泳泳道从左到右的顺序依次为marker，up片段、down片段和融合片段；14.图3为ura3缺失突变体pcr鉴定电泳图，其中，a图和b图从左到右的顺序依次均为marker，野生型wt，ura3缺失突变体(δura3)；a图所用引物对为ura3-f/r，b图所用引物对为check-f/r；15.图4为尿嘧啶营养缺陷菌株δura3的验证图，其中，从左到右所用培养基依次为pda，pda+5-foa，pda+尿苷、尿嘧啶，pda+5-foa+尿苷、尿嘧啶；wt为野生型菌株，δura3为尿嘧啶营养缺陷菌株；16.图5为尖孢镰刀菌amt基因的敲除策略图；17.图6为以尿嘧啶营养缺陷菌株作为出发菌株敲除amt基因的验证图，其中a图：野生菌株和突变菌株中目的基因验证；b图：ura3基因验证；c图：验证突变菌株同源置换臂在目的基因上、下游位置发生同源置换。具体实施方式18.本发明所用培养基(1l)，其组成成分如下所示：19.pda培养基：土豆200g，琼脂20g，葡萄糖20g。pdb培养基：土豆200g，葡萄糖20g。mm培养基：kh2po4 1g，mgso4·7h2o 0.5g，kcl 0.5g，nano3 2g，葡萄糖20g，蔗糖200g，琼脂15g。t-top培养基：kh2po4 1g，mgso4·7h2o 0.5g，kcl 0.5g，nano3 2g，葡萄糖20g，蔗糖200g，琼脂10g。20.本发明所用的主要试剂，如下所示：21.fastpfu酶、easytaq酶均购自北京全式金公司，uniq-10柱式真菌基因组抽提试剂盒购自上海生工，dmso(作为5-foa的溶剂)、5-foa、尿苷、尿嘧啶购自solarbio公司，崩溃酶购自sigma公司。tec：1m ph＝7.5的tris-hcl，0.5m ph＝8的edta，1m cacl2·2h2o。stc(500ml)：山梨醇72.88g，1m cacl2·2h2o，1m ph＝7.5的tris-hcl。peg：peg4000120g、mops(3-n-吗啉基)丙磺酸25.116g加蒸馏水水浴加热溶解至200ml，室温避光保存。试验所用菌株为尖孢镰刀菌粘团专化型(fusarium oxysporum f.sp.conglutinans,foc，58385)2号生理小种，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所赠予。22.在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。23.实施例124.制备尖孢镰刀菌ura3缺失突变体，步骤如下：25.(1)克隆尖孢镰刀菌ura3基因上下游片段26.使用uniq-10柱式真菌基因组抽提试剂盒提取尖孢镰刀菌的基因组dna，并将其作为该步模板。使用引物对up-f/r(seq id no:4和5)、down-f/r(seq id no:6和7)分别扩增尖孢镰刀菌ura3基因(seq id no:1)的5′端上游片段(up片段，seq id no:2)和3′端下游片段(down片段，seq id no:3)。pcr体系：模板2μl，dntps 4μl，分别加引物up-f/r、down-f/r各1μl，5×buffer 10μl，ddh2o 31μl，fastpfu酶1μl。pcr程序：95℃预变性2min，95℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸2min，变性至延伸重复35个循环，最后72℃延伸5min。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收上下游片段。27.(2)pcr融合上下游片段28.使用步骤(1)所得产物按up片段和down片段的摩尔质量比1:1添加作为模板，不加入引物，加dntps 4μl，5×buffer 10μl，fastpfu酶1μl，用ddh2o补足至50μl作为反应体系。pcr程序如下：95℃预变性2min，95℃变性20s，58℃退火10min，72℃延伸2min，变性至延伸重复10个循环，最后72℃延伸5min。29.(3)融合片段的扩增30.使用步骤(2)所得产物2μl作为模板，引物对up-f/down-r各1μl，dntps 4μl，5×buffer10μl，ddh2o 31μl，fastpfu酶1μl。pcr程序如下：95℃预变性2min，95℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸2min，变性至延伸重复35个循环，最后72℃延伸5min得到转化所需融合片段(上、下游片段和融合片段的电泳图见图2)。31.(4)制备尖孢镰刀菌原生质体32.将崩溃酶液加到尖孢镰刀菌菌丝样品中，混匀，置于28℃、120rpm的摇床崩溃4h。取6ml酶裂解液，过滤，并不断用stc清洗，用灭菌的50ml的离心管收集滤液。3000rpm、4℃离心15min，倒掉上清，用stc重悬原生质体，调整浓度为1×108cfu/ml，备用。33.(5)peg介导原生质体转化34.将2μg融合片段加tec至体积为60μl，冰置20min，12000rpm、4℃离心2min后吸取上清，每60μl的转化片段对应100μl原生质体。将上清样品加入到100μl原生质体中轻轻混匀，冰置40min。冰置结束后缓慢加入160μl的peg，用移液枪轻轻吹打充分混匀后，室温放置15min，再加入1ml的stc混匀，3000rpm离心5min，轻轻倒掉上清，沉淀用200μl的stc重悬，置于冰上备用。用移液枪取50μl溶液加入到10mlmm培养基(含0.5mg/ml的尿苷、尿嘧啶)中，然后倒入凝固好的mm培养基平板(含0.5mg/ml的尿苷、尿嘧啶)上，放入25℃培养箱中培养1d。35.(6)筛选尖孢镰刀菌ura3缺失突变体36.将培养1d的mm培养基平板上覆盖t-top培养基(含有0.5mg/ml尿苷、尿嘧啶和1.5mg/ml的5-foa)，继续培养5天。挑取转化子置于pda培养基(含有0.5mg/ml尿苷、尿嘧啶和1.5mg/ml的5-foa)上培养3天，提取转化子的dna作为模板，用引物对ura3-f/r(seq id no:8和9)和check-f/r(引物序列为seq id no:10和11；野生型check序列为seq id no:12，条带大小为4898bp；δura3的check序列为seq id no:13，条带大小为3692bp)进行pcr扩增，扩增结果如图3所示，获得尖孢镰刀菌ura3缺失突变体(δura3)，分离单孢纯化培养。37.(7)尖孢镰刀菌ura3缺失突变体的验证38.分别在含5-foa的pda培养基，含5-foa、尿苷和尿嘧啶的pda培养基，含尿苷和尿嘧啶的pda培养基，以及正常pda培养基平板上接种野生菌株和突变菌株，在25℃的条件下培养7天，观察生长情况。结果如图4所示。由图4可知，本发明的方法可以构建出遗传性能稳定的尖孢镰刀菌的尿嘧啶营养缺陷型菌株。39.实施例2无痕遗传转化应用40.使用尖孢镰刀菌ura3缺失突变体作为出发菌株敲除amt基因(seq id no:14)，所用引物及遗传转化位置如图5所示。amt基因是编码甲基转移酶的基因。甲基转移酶又叫转甲基酶，是生物体内普遍存在的重要酶类，其受体范围从dna、rna到蛋白质、脂质等，在真菌形态和生理代谢等方面都有着十分重要的作用，可以使真菌适应不同的环境，提高生存能力。41.以尖孢镰刀菌的dna作为模板，分别用引物对ura3-f/r、a-up-f/r(seq id no:15和16)和a-down-f/r(seq id no:17和18)进行扩增得到ura3基因片段、amt基因的上游片段(a-up，seq id no:19)和下游片段(a-down，seq id no:20)。之后对目的基因的上游片段、ura3片段以及下游片段按照摩尔质量比1:3:1加入pcr小管作为模板，进行pcr融合，再将其作为模板，使用引物对a-up-f/a-down-r进行扩增得到转化所需片段。原生质体的制备和peg介导原生质体转化步骤同实施例1。转化子培养1天后覆盖的t-top培养基为不添加尿苷、尿嘧啶和5-foa的普通t-top培养基，培养5天后，挑取转化子至普通pda培养基上培养3天，提取转化子的dna作为模板，用引物对a-check-f/r(seq id no:21和22)以及ura3check-f/r(seq id no:23和24)进行pcr扩增，扩增结果如图6a、图6b所示，再分别同引物对upcheck-f/r(seq id no:25和26)和downcheck-f/r(seq id no:27和28)进行扩增，结果如图6c所示，成功构建了两个amt缺失突变体(mt-1和mt-2)。由图6可知，本发明所构建的尖孢镰刀菌尿嘧啶营养缺陷菌株可在不引入新的抗性基因的前提下完成目的基因的敲除，实现无痕遗传转化。42.上述实施例中所涉及的基因序列，如下所示：43.ura3基因：[0044]5′‑caaggcgactttcgccagtcgagctgagacagctacccatcctctcagtcgacatctctacaagctcatggacctcaaggcctcgaatctttgcctcagcgccgatgtcgcaaccgctcgcgaactgctctacttcgccgacaagattggtccctccatcgtcgtcctcaagactcattatgacatggtggccggctgggactttgatcctaggacaggtactggtgccaagctcgcctcactagcacgcaagcatggtttcctcatctttgaggatcgcaagtttggtgatattggcaatacggtcgagttgcagtatactagcggtgctgcgcgcatcatcgagtgggcacatattaccaatgtaaatatggttccaggcaaggcctcggttacatctctggcccacgctgccaaccgatggctcgagcgataccactacgaggtcaagacatctatcagcattggaactcccaccgccagtcaactggatgaggatagcgagcgttcagacaacgagaaccagaaggacacgccggaacctgctcgcgctgacagcggccgaaaaggtagcattgtttccaccaccaccgtcacccaacagtacgagtcggccgattcaccacgcctcgtcaagacgatccctgagggcgatgagacagtattccccggcatcgatgaagcgccgatcgagaggggcctgcttatcctggcacagatgtcgagccagggcaacttcatgaacaaggaatatacgcaagcatgtgtagaggccgcgcgggaacacaagaacttcgtcatgggctttgtctcacaggagtgtctcaacacagaacccgaggatgacttcatccacatgacccccggttgccaattgccccctgagggcgcggatgagaatgaagccatcaagggtgatggcaagggtcaacagtacaacacgccacagaagatcattggtattgccggtgctgacattgctattgttggacgcggtatcatcaaggc-3′(seq 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