一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用的制作方法

医药医疗技术的改进;医疗器械制造及应用技术1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用。背景技术：2.胸腔积液是晚期肺癌的临床事件之一，严重影响患者的生活质量和临床药物治疗。随着我国国民经济改革的不断深化，城市化、工业化进程不断加速，肺癌的发病率和死亡率之间增长，现已成为发病率死亡率最高的恶性肿瘤。据统计，2020年我国肺癌发病总人数达82万、总死亡人数达47万。晚期肺癌给患者及其家属造成了巨大的身体的和经济负担，尤其胸腔积液的发生往往严重影响肺癌患者的生活质量、制约临床医生的用药选择。3.胸腔积液作为晚期癌症的常见不良事件，已引起越来越多的临床医师和研究者的重视。尽管临床针对肺癌患者的各类新药层出不穷，取得不俗的疗效，但目前临床针对晚期肺癌患者的胸腔积液，却仍然沿用传统的物理抽出配合胸腔局部化疗的方式进行治疗，该传统治疗方案的弊端包括：对患者的身体造成负担，同时多次反复的物理抽出和化疗对患者身体造成的反复创伤可能导致炎症等不良事件，极大地缩短患者的生存时间，同时炎症反应等潜在并发症的发生和发展会进一步延缓患者的抗肿瘤治疗方案的实施，导致肿瘤复发等更加严重事件的发生。4.近年来溶瘤细菌作为一种全新的具有开发前景的实体肿瘤治疗方法引进了人们的关注。鼠伤寒沙门氏菌是一个感染人类和动物最普见的致病菌，它通过侵染宿主的肠道上皮细胞，进入吞噬细胞最终在宿主体内传播。vnp20009是一株在野生型沙门氏菌14028s遗传背景上突变掉致病基因msbb和嘌呤合成基因puri的减毒沙门氏菌，在小鼠荷瘤模型中vnp20009展现了良好的抗肿瘤效果，但在进行i期实体肿瘤临床实验时，较低剂量给药的情况下，尽管展现除了较高的生物安全性，但其肿瘤靶向性和抗肿瘤效果均不显著。目前国际上对包括vnp20009在内的溶瘤细菌研究全部集中在实体肿瘤的治疗上，这是因为溶瘤细菌偏好实体肿瘤内部的乏氧等肿瘤微环境。5.减毒沙门氏菌具有安全性较好、可单次给药的特点，而目前临床针对胸腔积液的治疗缺乏具有安全性高、单次给药且有效改善患者生活质量、改善患者总生存时间特点的药物。本发明首次将溶瘤细菌用于肺癌胸腔积液的治疗。技术实现要素：6.为了解决现有技术中的问题，实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用，所述的减毒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009及其衍生或基因改造菌株，包括但不限于前述已经申请发明发明的各菌株(zl201410209851.7，zl201610946268.3，zl201610945015.4，zl201610945021.x，202010182038.0；acta pharmaceutica sinica b 2021，11(10):31653177；phop/phoq)；菌株可以不携带或携带表达治疗基因的质粒。7.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用而制备的减毒沙门氏菌活菌制剂。8.进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：9.(a)所述的减毒沙门氏菌的发酵培养物；10.(b)所得减毒沙门氏菌细胞的超声裂解上清；11.(c)所得减毒沙门氏菌细胞的超声裂解沉淀。12.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用而制备的减毒沙门氏菌冻干粉。13.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用在制备肺癌胸腔积液药物中的应用。14.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用，其特征在于：采用胸腔给药方式。15.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用，其特征在于：利用异氟烷麻醉机麻醉后，胸骨柄左侧5-6肋间用眼科剪在夹起处，制造一个2-3mm的纵向切口，针头深入胸腔3-5mm处推注给药。16.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用，其特征在于：所述改造减毒沙门氏菌联合治疗有效量的至少化学药物治疗、中药治疗、生物治疗、物理治疗等方法在治疗肺癌胸腔积液模型中的应用：降低肺癌胸腔积液模型小鼠胸腔积液体积，改善肺癌胸腔积液模型小鼠相关症状，减缓肺癌胸腔积液模型小鼠胸腔积液及肿瘤进程，改善肺癌胸腔积液模型小鼠生存时间。17.有益效果：减毒沙门氏菌具有安全性较好、可单次给药的特点，而目前临床针对胸腔积液的治疗缺乏具有安全性高、单次给药且有效改善患者生活质量、改善患者总生存时间特点的药物。本发明首次将溶瘤细菌用于肺癌胸腔积液的治疗，给药后肺癌胸腔积液小鼠模型的胸腔积液显著改善，小鼠生存期延长。18.与现有技术相比，本发明具备以下优点：19.(1)减毒沙门氏菌生长速率快，通过胸腔局部注射应用于肺癌胸腔积液小鼠模型，能显著改善模型小鼠胸腔积液体积，延缓肿瘤进程，提升模型动物生存时间。本发明有利于改善晚期具有胸腔积液并发症的肺癌患者的生活质量和生存时间。20.(2)本发明涉及的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用及胸腔注射的给药方式，是基于临床针对晚期肺癌胸腔积液的治疗需求，传统的物理抽出配合胸腔局部化疗的治疗方式，对患者的身体造成负担，同时多次反复的物理抽出和化疗对患者身体造成的反复创伤可能导致炎症等不良事件，影响患者治疗方案的实施、缩短患者的生存时间，缺乏具有安全性高、单次给药且有效改善患者生活质量特点的治疗药物和治疗方法。附图说明21.图1为本发明的减毒沙门氏菌vnp20009菌的体外生长速率图；22.图2为本发明造模时体外llc细胞状态显微图；23.图3为本发明给药后各组小鼠体重变化图；24.●：llc模型、顺铂给药组；■：llc模型、减毒沙门氏菌给药组。25.图4为本发明给药后15天内各组小鼠总生存曲线图；26.●：llc模型、顺铂给药组；■：llc模型、减毒沙门氏菌给药组。27.图5为本发明给药后15后各组小鼠胸腔积液体积图；28.1、pbs对照；2、减毒沙门氏菌vnp20009菌29.图6为本发明给药后15后各组小鼠肿瘤重量图；30.1、pbs对照；2、减毒沙门氏菌vnp20009菌31.图7为本发明tunel试剂盒染色后荧光细胞荧光显微成像情况图；32.1、pbs对照；2、减毒沙门氏菌vnp20009菌。具体实施方式33.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。34.本发明的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用，所述的减毒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009及其衍生或基因改造菌株。35.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用而制备的减毒沙门氏菌活菌制剂。36.本发明所述的减毒沙门氏菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：37.(a)所述的减毒沙门氏菌的发酵培养物；38.(b)所得减毒沙门氏菌细胞的超声裂解上清；39.(c)所得减毒沙门氏菌细胞的超声裂解沉淀。40.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用而制备的减毒沙门氏菌冻干粉。41.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用在制备肺癌胸腔积液药物中的应用。42.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用，采用胸腔给药方式。43.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用，其特征在于：利用异氟烷麻醉机麻醉后，胸骨柄左侧5-6肋间用眼科剪在夹起处，制造一个2-3mm的纵向切口，针头深入胸腔3-5mm处推注给药。44.本发明所述的一种减毒沙门氏菌在制备治疗肺癌胸腔积液药物中的应用，所述改造减毒沙门氏菌联合治疗有效量的至少化学药物治疗、中药治疗、生物治疗、物理治疗等方法在治疗肺癌胸腔积液模型中的应用：降低肺癌胸腔积液模型小鼠胸腔积液体积，改善肺癌胸腔积液模型小鼠相关症状，减缓肺癌胸腔积液模型小鼠胸腔积液及肿瘤进程，改善肺癌胸腔积液模型小鼠生存时间。45.实施例146.小鼠肺癌胸腔积液模型构建47.实验细胞：48.llc细胞由南京大学生命科学学院赠与。49.实验动物：50.野生型c57小鼠(c57bl/6j野生型小鼠)：spf级别，6-8周龄，质量16-20g，购自常州卡文斯实验动物有限公司。51.主要实验设备：52.细菌培养摇床购自上海智城分析仪器制造有限公司；移液器购自glison公司；台式普通离心机、台式低温冷冻离心机和生物分光光度计购于eppendorf公司；ph仪购于sartorius公司；核酸电泳和蛋白垂直电泳系统购于美国bio-rad公司；pcr仪购于日本takara公司；高压灭菌锅购于zealway公司；精密鼓风恒温干燥箱购于darth-carter公司；恒温水浴锅购于polyscience公司；电子天平购于mettler toledo公司；电转仪购于美国bio-rad公司；超净台，倒置显微镜，二氧化碳细胞培养箱，离心机，动物吸入式麻醉机；荧光显微镜leica dm 2500。53.(1)体外细胞培养54.体外培养llc细胞(路易斯肺癌细胞)，90％dmem高糖培养液10％胎牛血清，37℃，5％二氧化碳培养箱培养，待细胞铺满培养箱底部，且显微镜观察进入指数生长期时，胰蛋白酶酶解铁壁细胞，pbs洗出，血球计数板计数，台盼蓝试剂盒鉴定活细胞数，1000rpm/min离心3min后，用生理盐水稀释细胞浓度至1x106/ml备用。55.(2)小鼠肺癌胸腔积液模型造模56.取6-8周龄的c57bl/6j野生型小鼠，适应3-5天，利用异氟烷麻醉机浅度麻醉后，用镊子夹起小鼠胸骨柄左侧5-6肋间的皮肤，用眼科剪在夹起处制造一个2-3mm的纵向切口，针尖注入深度约3-5mm，进针缓慢推注10μl/g llc细胞悬液，注射完毕后快速拔出针头后，适当碘伏消毒后创口，并迅速停止呼吸麻醉，放置待小鼠苏醒后放回鼠笼观察生命体征，注意保暖，待小鼠苏醒。57.(3)小鼠肺癌胸腔积液模型造模成功58.小鼠正常供食供水培养6-8天后，得到小鼠肺癌胸腔积液模型。59.实施例260.减毒沙门氏菌vnp20009体外生长曲线测定[0061]-80℃保存的vnp20009接种到lb液体培养基中在37℃细菌培养箱中复苏培养过夜，次日按1:100转接到新鲜lb中培养至od为0.6-0.8，取等量的vnp20009菌株转接到等量的新鲜lb中并置于37℃细菌培养箱中培养7h，从细菌转接到lb中(即0h)开始每0.5小时分别采样一次并使用生物分光光度计测定细菌的od600 nm值，绘制细菌的生长曲线(图2)。[0062]减毒沙门氏菌vnp20009治疗肺癌胸腔积液模型小鼠的胸腔积液[0063]取肺癌胸腔积液模型小鼠，利用异氟烷麻醉机浅度麻醉后，用镊子夹起小鼠胸骨柄左侧5-6肋间的皮肤，用眼科剪在夹起处制造一个2-3mm的纵向切口，针尖注入深度约3-5mm，缓慢推注减毒沙门氏菌，注射完毕后快速拔出针头后，适当碘伏消毒后创口，并迅速停止呼吸麻醉，放置待小鼠苏醒后放回鼠笼观察生命体征，注意保暖。[0064]所述造模所有llc体外培养细胞均处于指数生长期，活细胞数达到90％以上。用于造模的小鼠体重16-18g。造模和减毒沙门氏菌vnp20009给药过程在无菌操作台上进行。[0065]所述造模所有llc体外培养细胞均处于指数生长期，活细胞数达到90％以上。用于造模的小鼠体重16-18g。造模和减毒沙门氏菌vnp20009给药过程在无菌操作台上进行。[0066]小鼠麻醉采用异氟烷呼吸麻醉机。小鼠饲养温度19-25℃，相对湿度50-70％，日常白炽灯白天8-10小时照明。减毒沙门氏菌vnp20009小鼠模型给药剂量为1x 107至1x 108/只；所述5-6肋间制造一个2mm的微小上皮组织创口。[0067]减毒沙门氏菌vnp20009小鼠模型给药剂量为2x 107/只。[0068]实施例3[0069]构建小鼠肺癌胸腔积液模型[0070](1)体外细胞培养[0071]液氮罐或-80度冰箱取出llc细胞，迅速37℃解冻1min复苏细胞，1000rpm/min离心3min，90％dmen高糖培养液和10％胎牛血清于37℃5％二氧化碳培养箱中培养，待细胞进入指数增长期且铺满培养瓶底部，利用胰蛋白酶将铁壁细胞酶解并用pbs洗出。利用血球计数板技术总细胞数，并采用台盼蓝检测试剂盒计算活细胞比例，当活细胞比例达到90％以上，用生理盐水将llc细胞悬液稀释至1x106备用，图1。[0072](2)构建小鼠肺癌胸腔积液模型[0073]取6-8周龄的c57bl/6j野生型小鼠30只，雌雄各半，适应3-5天，利用异氟烷麻醉机浅度麻醉后，将小鼠腹部朝上固定于无菌操作台上，用手术刀在小鼠胸骨柄左侧5-6肋间制造一个2mm的微小上皮组织创口，迅速进针缓慢推注10μl/g llc细胞悬液，针头深入胸腔3-5mm，拔出针头后，适当碘伏消毒后创口，并迅速停止呼吸麻醉，放置待小鼠苏醒后放回鼠笼；小鼠正常供食供水培养7天后，顺利得到小鼠肺癌胸腔积液模型。[0074]实施例4[0075]减毒沙门氏菌vnp20009应用治疗小鼠肺癌胸腔积液模型[0076]1)减毒沙门氏菌vnp20009治疗组小鼠[0077]取肺癌胸腔积液模型小鼠10只，雌雄各半，利用异氟烷麻醉机浅度麻醉后，将小鼠腹部朝上固定于无菌操作台上，胸骨柄左侧5-6肋间制造一个2mm的微小创口，医用小号注射器注射针头深入胸腔3-5mm，缓慢推注溶于生理盐水的减毒沙门氏菌vnp20009菌冻干粉2x 107/只，小心抽出针头，适当碘伏消毒创口，迅速停止呼吸麻醉，待小鼠苏醒。[0078]2)顺铂治疗组小鼠[0079]取肺癌胸腔积液模型小鼠10只，雌雄各半，尾静脉给药顺铂10mg/kg剂量，连续给药5天[0080]3)胸腔积液及小鼠生存状态鉴定[0081]给药后，将小鼠置于鼠笼保证实物和水，在温度19-25℃、相对湿度50-70％、日常白炽灯白天8-10小时照明的情况下正常饲养，并隔日称量体重，观察小鼠生存状态及死亡情况。结果显示减毒沙门氏菌vnp20009给药后小鼠体重相对平稳，且相较于顺铂给药组(图3)，减毒沙门氏菌vnp20009给药组小鼠给药后15天内死亡率更低(图4)。[0082]于给药后第15天，二氧化碳窒息处死全部参与实验的小鼠。对死亡小鼠进行解剖，抽取胸腔积液，取出肿瘤并称重切片，冰冻切片利用tdt-mediated dutpnick end labeling(tunel)试剂盒染色处理后，在荧光显微镜下观察肿瘤细胞凋亡情况。结果显示，给药后15天减毒沙门氏菌vnp20009给药组小鼠胸腔积液体积显著减少(图5)；相较于阴性对照组，减毒沙门氏菌vnp20009给药组小鼠肿瘤大小具有一定程度的改善(图6)；tunel染色后，荧光显微镜观察结果显示减毒沙门氏菌vnp20009可促进肿瘤细胞细胞凋亡(图7)，具有一定的抗肿瘤功效。[0083]实施例5[0084]构建小鼠肺癌胸腔积液模型[0085](1)体外细胞培养[0086]液氮罐或-80度冰箱取出llc细胞，迅速37℃解冻1min复苏细胞，1000rpm/min离心3min，90％dmen高糖培养液和10％胎牛血清于37℃5％二氧化碳培养箱中培养，待细胞进入指数增长期且铺满培养瓶底部，利用胰蛋白酶将铁壁细胞酶解并用pbs洗出。利用血球计数板技术总细胞数，并采用台盼蓝检测试剂盒计算活细胞比例，当活细胞比例达到90％以上，用生理盐水将llc细胞悬液稀释至1x106备用，图2。[0087](2)构建小鼠肺癌胸腔积液模型[0088]取6-8周龄的c57bl/6j野生型小鼠30只，雌雄各半，适应3-5天，利用异氟烷麻醉机浅度麻醉后，将小鼠腹部朝上固定于无菌操作台上，用手术刀在小鼠胸骨柄左侧5-6肋间制造一个2mm的微小上皮组织创口，迅速进针缓慢推注10μl/g llc细胞悬液，针头深入胸腔3-5mm，拔出针头后，适当碘伏消毒后创口，并迅速停止呼吸麻醉，放置待小鼠苏醒后放回鼠笼；小鼠正常供食供水培养7天后，顺利得到小鼠肺癌胸腔积液模型。[0089]实施例6[0090]减毒沙门氏菌vnp20009应用治疗小鼠肺癌胸腔积液模型[0091]1)减毒沙门氏菌vnp20009治疗组小鼠[0092]取肺癌胸腔积液模型小鼠10只，雌雄各半，利用异氟烷麻醉机浅度麻醉后，将小鼠腹部朝上固定于无菌操作台上，胸骨柄左侧5-6肋间制造一个2mm的微小创口，医用小号注射器注射针头深入胸腔3-5mm，缓慢推注溶于生理盐水的减毒沙门氏菌vnp20009菌冻干粉2x 107/只，小心抽出针头，适当碘伏消毒创口，迅速停止呼吸麻醉，待小鼠苏醒。[0093]2)顺铂治疗组小鼠[0094]取肺癌胸腔积液模型小鼠10只，雌雄各半，尾静脉给药顺铂10mg/kg剂量，连续给药5天[0095]3)胸腔积液及小鼠生存状态鉴定[0096]给药后，将小鼠置于鼠笼保证实物和水，在温度19-25℃、相对湿度50-70％、日常白炽灯白天8-10小时照明的情况下正常饲养，并隔日称量体重，观察小鼠生存状态及死亡情况。结果显示减毒沙门氏菌vnp20009给药后小鼠体重相对平稳，且相较于顺铂给药组(图5)，减毒沙门氏菌vnp20009给药组小鼠给药后15天内死亡率更低(图6)。[0097]于给药后第15天，二氧化碳窒息处死全部参与实验的小鼠。对死亡小鼠进行解剖，抽取胸腔积液，取出肿瘤并称重切片，冰冻切片利用tdt-mediated dutpnick end labeling(tunel)试剂盒染色处理后，在荧光显微镜下观察肿瘤细胞凋亡情况。结果显示，给药后15天减毒沙门氏菌vnp20009给药组小鼠胸腔积液体积显著减少(图7)；相较于阴性对照组，减毒沙门氏菌vnp20009给药组小鼠肿瘤大小具有一定程度的改善；tunel染色后，荧光显微镜观察结果显示减毒沙门氏菌vnp20009可促进肿瘤细胞细胞凋亡，具有一定的抗肿瘤功效。[0098]综合现有专利成果，本发明首次申请包括：(1)肺癌胸腔积液小鼠模型构建，(2)减毒沙门氏菌vnp20009在肺癌胸腔积液小鼠模型中的应用。本发明所需的实验设备简单，模型构建周期短，具备一定造作技巧后操作方便，重复性好，给药后肺癌胸腔积液小鼠模型的胸腔积液显著改善，小鼠生存期延长，为将来以此新药为基础治疗临床伴随胸腔积液正装的晚期肺癌患者提供实验基础。[0099]综合现有专利成果，本发明首次申请包括：(1)肺癌胸腔积液小鼠模型构建，(2)减毒沙门氏菌vnp20009在肺癌胸腔积液小鼠模型中的应用。本发明所需的实验设备简单，模型构建周期短，具备一定造作技巧后操作方便，重复性好，给药后肺癌胸腔积液小鼠模型的胸腔积液显著改善，小鼠生存期延长，为以此为基础治疗临床伴随胸腔积液症状的晚期肺癌患者提供实验基础。[0100]以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。









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